全 文 ：紫花苜蓿根腐性病害生防放线菌的分离与筛选
王兰英 1 ,徐林波2＊ ,何勇 3 ,乌兰巴特尔 2 ,赵海霞 2　(1.海南大学环境与植物保护学院 ,海南儋州 571737;2.中国农业科学院
草原研究所 ,内蒙古呼和浩特 010010;3.青岛海源草坪有限公司 ,山东青岛 026300)
摘要　[目的 ]分离筛选出对苜蓿根腐病病原具有高拮抗作用的生防放线菌。 [方法]利用梯度稀释分离法从来自内蒙古赤峰地区的 10
个土样中分离得到 91株放线菌。以 3株苜蓿根腐病菌为靶标菌 ,采用平皿对峙培养法 ,对分得菌株进行皿内拮抗作用测定。 [结果]获
得 5株对供试苜蓿根腐病菌有较强抑制作用的拮抗菌株 ,编号为 1-3-6、4-4-2、6-2-25、6-2-27、7-2-13,分别来自 1号、4号 、6号及 7号土样 ,
占分离菌株的 5.50%。 [结论 ]该研究可为苜蓿根腐病生物防治奠定一定基础。
关键词　放线菌;拮抗作用;苜蓿;根腐病
中图分类号　S435.4　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)15-07944-03
IsolationandScreeningofAlfalfaRootRotBiocontrolActinomyces
WANGLan-yingetal　(ColegeofEnvironmentalandPlantProtection, HainanUniversity, Danzhou, Hainan571737)
Abstract　[ Objective] Actinomyceteswithhighantagonisticefectsonalfalfarootrotpathogenwasisolatedfromsoil.[Method] 91actinomyces
wereisolatedfrom10soilsamplesinChifengInnerMongoliabygradientdilutionmethod.Induelculturetests, alisolatesweretestedfortheir
antagonismbyusing3strainsincludingFusariumsolani, F.Oxysporum, F.avenaceumofalfalfarootrotpathogenicbacteriaasindicatorstrains.
[ Result] 5strainsofmoreantagonisticmicroorganismwereobtainedfromNo.1, No.4, No.6andNo.7soilsamplesandwerenamedrespectively
1-3-6, 4-4-2, 6-2-27and7-2-13, accountedfor5.50%ofisolates.[ Conclusion] Thisstudylaidafoundationforbiologicalcontrolofalfalfaroot
rotpathogen.
Keywords　Actinomyces;Antagonism;Alfalfa;Rootrot
基金项目　中央级公益性科研院所基本科研业务费基金专项(中国农
业科学院草原研究所 2006-1-05)。
作者简介　王兰英(1976-),女 ,内蒙古呼伦贝尔人 ,硕士 , 助教 ,从事
植物病害生物防治研究。 ＊通讯作者 ,助理研究员 , E-mail:
xulinbo@yahoo.cn。
收稿日期　 2010-03-05
　　紫花苜蓿(MedicagosativaL.)因具有耐瘠薄 、耐干旱 、耐
风沙 、适应性强 、产量高 、营养丰富等优点在世界上种植历史
悠久 ,栽培范围较广 ,被誉为 “牧草之王 ”。我国早在 2000年
前就已栽培利用 ,现已成为我国北方牧区的主要牧草种植品
种 [ 1-2] 。随着紫花苜蓿种植面积的增加和种植年限的延长 ,
苜蓿根腐性病害在世界大范围发生 ,其中美国 、加拿大 、澳大
利亚 、俄罗斯 、日本和阿根廷等国家发生尤为严重 [ 3-5] 。我
国自 1991年发现此病以来 ,在新疆 、甘肃 、青海 、内蒙古等地
陆续有相关报道 [ 6-9] ,尤其是近几年 ,苜蓿根腐病性病害的
发生及危害呈逐年上升趋势。
调查发现 ,该病是以腐皮镰孢菌为主要病原 ,并与尖镰
孢菌和燕麦镰孢菌复合侵染导致的一种病害。对苜蓿根腐
病的防治目前主要依靠选育抗性品种和化学药剂加以控制 。
但目前生产中缺乏真正有效的抗病品种 ,或者是抗病品种的
抗病性极易丧失。化学杀菌剂的过量应用不仅会引起环境
污染 、食品药物残留问题 ,还会诱发病原菌产生抗药性 [ 10] 。
而生物防治以安全 、高效 、无污染等特点已成为植物病害防
治的重要途径 [ 11-12] 。放线菌作为一种资源丰富的微生物类
群 ,一直以来是人们研究的热点 ,所以寻找和利用拮抗放线
菌对苜蓿根腐病性病害进行生物防治具有重要意义。该研
究从内蒙古赤峰地区采集的 10个土样中分离筛选出对苜蓿
根腐病病原具有很好拮抗作用的放线菌 ,旨在为苜蓿根腐病
生物防治奠定基础。
1　材料与方法
1.1　供试材料
1.1.1　供试苜蓿根腐性病害病原菌 。苜蓿腐皮镰孢菌 Fu-
sariumsolani、尖镰孢菌 F.oxysporum、燕麦镰孢 F.avenaceum
由中国农业科学院草原研究所牧草病害研究组提供。
1.1.2　供试土壤。供试土样由中国农业科学院草原研究所
牧草病害研究组提供。
1.1.3　供试培养基。高氏 1号培养基 , PDA培养基。
1.2　试验方法
1.2.1　土样分离。采用梯度稀释分离法分离供试土样 , 28
℃恒温培养 5 ～ 7d。
1.2.2　菌株纯化。依据放线菌表观特征 ,菌落正 、反面色泽
以及可溶色素的有无 [ 13] ,对分离平板上的菌株进行编号 、纯
化 、保存 ,备用。
1.2.3　苜蓿根腐性病害拮抗放线菌的初筛及复筛。将分离
得到的放线菌及供试靶标菌株分别于高氏 1号平板和 PDA
平板适温培养 5 d,用 Υ=0.5 cm打孔器打取放线菌菌饼接
于 PDA平板中央 ,然后打取同样大小的靶标菌菌饼 ,十字交
叉法接于放线菌菌饼四周 , 25 ℃恒温培养 3 ～ 5 d,测量菌饼
直径 ,计算抑菌率。
　　以腐皮镰孢菌作为靶标菌进行拮抗菌株的初筛;再以尖
镰孢菌和燕麦镰孢菌进行复筛 ,方法同初筛。
2　结果与分析
2.1　放线菌分离纯化结果　采用梯度稀释分离法对来自内
蒙古赤峰地区的 10个土样进行分离 ,共分离 、纯化得到放线
菌 91株 ,结果见表 1。
由表 1可知 ,所分离纯化得到的放线菌来自 4号土样的
最多 ,其次为 1号土样 ,从这 2个土样中共得到 29株放线菌 ,
占分离放线菌的 31.87%;来自 2号 、6号土样的放线菌最少 ,
这 2个土样只分离纯化得到 8株放线菌 ,仅占分离放线菌的
8.80%;其余 54株放线菌分别为:7号土样 12株 , 10号土样
10株 , 5号和 8号土样各 9株 , 3号和 9号土样各 7株。
2.2　苜蓿根腐性病害生防放线菌初筛　以苜蓿腐皮镰孢菌
作为靶标菌 ,对分离纯化得到的 76株放线菌(91株菌中 15
株因为污染其他杂菌而被淘汰)进行皿内拮抗初筛 ,拮抗效
果较好的菌株见表 2。
责任编辑　张彩丽　责任校对　卢瑶安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(15):7944-7946
表 1　放线菌分离结果
Table1　Separationresultsofactinomyces
土样编号
Codeofsoilsamples
分离菌株编号
Codeofisolates
土样编号
Codeofsoilsamples
分离菌株编号
Codeofisolates
1号 No.1 1-2-11、1-2-16、1-3-1、1-3-2、1-3-3、1-3-4、1-3-5、
1-3-6、1-3-7、1-3-8、1-3-9、1-3-10、1-2-14、1-2-13
6号No.6 6-2-1、6-2-25、6-2-26、6-2-27
2号 No.2
2-2-1、2-2-4、2-2-5、2-4-24 7号No.7 7-2-13、7-2-14、7-2-15、7-3-8、 7-3-9、 7-3-10、7-3-12、
7-4-1、7-4-3、7-4-4、7-4-5、7-4-6
3号 No.3 3-2-3、3-2-4、3-2-5、3-2-6、3-2-7、3-3-1、3-3-2 8号No.8 8-2-18、8-2-21、8-2-23、8-3-10、8-3-11、8-3-12、8-4-2、
8-4-3、8-4-4
4号 No.4 4-2-14、4-2-15、4-2-16、4-2-17、4-3-7、4-3-8、4-3-
9、4-3-10、 4-3-11、4-3-12、4-3-13、4-4-1、4-4-2、
4-
9号No.9 9-2-7、9-2-9、9-3-4、9-3-5、9-3-19、9-4-1、9-4-2
6、4-4-20
5号 No.5 5-2-9、5-3-5、5-3-6、5-3-7、5-3-8、5-4-1、5-4-2、5- 10号 No.10 10-2-9、10-2-14、10-2-15、10-2-16、10-3-
4-3、5-4-4 2、10-3-5、10-3-6、10-3-7、10-3-8、10-4-1
　注:菌株编号第 1个数字代表土样,第 2个数字代表土样分离液的稀释度 ,第 3个数字代表菌落编号。
　Note:Thefirstnumberofstraincodestandsforsoilsample, thesecondnumberstandsfordilutionofseparationliquidofsoilsamples, thethirdnumber
standsforcolonynumber
表 2　放线菌对腐皮镰孢菌拮抗作用测定结果
Table2　Determinationresultsoftheantagonisticefectsofactinomy-
cetesonFusariumsolani
放线菌编号Codeofactinomycetes
抑菌圈平均直径 Υ∥cmAveragediameterofinhibitionone
抑制率∥%Inhibitionrate
放线菌编号Codeofactinomycetes
抑菌圈平均直径 Υ∥cmAveragediameterofinhibitionone
抑制率∥%Inhibitionrate
1-2-11 1.68 19.5 4-4-20 1.83 20.1
1-2-13 1.75 19.9 5-3-5 1.65 18.8
1-2-16 1.68 19.2 5-3-6 2.48 26.6
1-3-2 1.50 16.9 5-4-1 1.60 18.5
1-3-3 1.85 20.8 6-2-25 3.30 31.5
1-3-6 2.03 22.4 6-2-27 2.90 28.9
1-3-8 2.25 23.7 7-2-13 2.00 21.4
1-3-9 1.55 17.9 7-2-14 1.60 18.2
1-3-10 1.70 19.5 7-2-15 1.70 19.5
2-2-24 1.90 20.8 7-3-8 1.63 18.5
3-3-1 1.50 16.9 7-3-9 2.15 23.4
4-2-14 1.55 17.5 7-4-3 1.53 17.2
4-2-15 1.78 20.1 7-4-4 1.55 18.2
4-2-17 1.50 15.9 8-2-18 1.50 16.2
4-3-7 2.35 25.6 8-2-21 1.65 18.8
4-3-8 1.70 19.8 8-2-23 1.55 17.2
4-3-9 1.50 16.9 8-3-10 1.88 20.8
4-3-11 1.83 20.5 8-3-11 2.48 26.3
4-3-12 1.78 20.1 8-4-3 1.83 20.5
4-3-13 1.50 15.9 8-4-4 1.55 18.2
4-4-1 1.55 18.2 9-2-7 2.78 27.6
4-4-2 1.70 19.8 10-2-16 2.00 22.1
4-4-6 1.65 18.8 10-4-1 2.15 23.4
　　表 2列出了对腐皮镰孢菌拮抗效果较好的 46株放线
菌 ,其中有很强抑制作用的(抑菌圈 Ф≥2.0cm)有 12株 ,占
供试菌株的 15.8%。这些菌株来源于除 2号 、3号土样外的
其余 8个土样 ,编号为 1-3-6、1-3-8、4-3-7、5-3-6、7-2-13、7-3-9、
8-3-11、9-2-7、10-2-16、10-4-1、6-2-25、6-2-27。其中来源于 6
号土样的 6-2-25对靶标菌的抑制作用最好 ,其抑菌圈达 3.30
cm(抑制率为 31.5%),来源于该土样的 6-2-27抑制效果也
很理想 ,抑菌圈达 2.9 cm(抑制率为 28.9%)。另外对腐皮
镰孢菌有较强抑制作用的(1.5 cm<Ф<2.0cm)有 1-2-11、1-
2-13、1-2-16等 34株 ,占分离菌株的 44.7%。
2.3　苜蓿根腐性病害生防放线菌的复筛　苜蓿根腐病是不
同镰刀菌的复合性侵染所致 ,因此在以该病的优势侵染
菌———腐皮镰孢菌为靶标菌进行筛选的基础之上 ,再以另外
2种苜蓿根腐病致病菌尖镰孢菌 、燕麦镰孢菌作为靶标菌对
上述拮抗效果较好的 46株菌株进行复筛。经测定发现 ,供
试的 46株菌中对靶标菌 -尖镰孢菌有很强抑制作用的有 10
株 ,占供试菌株的 21.7%,而抑制作用较强的只有 4株 ,仅占
供试菌株的 8.7%;对靶标菌———燕麦镰孢菌有很强抑制作
用的只有 5株 ,占供试菌株的 10.9%,抑制作用较强的有 18
株 ,占供试菌株的 36.7%;同时对尖镰孢菌 、燕麦镰孢菌有很
强抑制作用的只有 1-3-6、4-4-2、7-2-13、6-2-25、6-2-27这 5株
菌(表 3)。由于这 5株菌在初筛试验中表现出很强的抑制
作用 ,因此它们是该试验所筛选到的理想菌株。这 5个菌株
分别来自 1号 、4号 、6号及 7号土样。
表 3　生防放线菌对尖镰孢菌和燕麦镰孢菌的拮抗作用测定结果
Table3　DeterminationresultsofantagonisticefectofbiocontrolactinomycetesonfusariumoxysporumfungusandFusariumavehaceumoats
放线菌编号
Codeofactinomycetes
抑菌圈平均直径 Υ∥cm
Averagediameterofinhibitionzone
尖镰孢菌 燕麦镰孢菌
抑制率∥%
Inhibitionrate
尖镰孢菌 燕麦镰孢菌
1-3-6 2.48 2.15 28.4 22.0
4-4-2 1.70 2.03 19.5 21.3
6-2-25 3.65 3.05 36.7 30.1
6-2-27 3.30 3.25 32.6 31.4
7-2-13 2.48 2.00 28.9 21.0
794538卷 15期　　　　　　　　　　　　　　　　王兰英等　紫花苜蓿根腐性病害生防放线菌的分离与筛选
3　结论
该研究利用平板稀释法从采自内蒙古的 10份土样中分
离纯化得到 91株放线菌 ,其中来自 4号土样的最多 ,其次为
1号土样 ,从这 2个土样中共得到 29株放线菌 ,占分离放线
菌的 31.87%;来自 2号 、6号土样的放线菌最少 ,这 2个土样
只分离纯化得到 8株放线菌 ,仅占分离放线菌的 8.80%。
采用培养皿对峙培养法 ,以苜蓿根腐病优势病原菌———
腐皮镰孢菌对分离得到的菌株进行初筛 ,再以非优势病原菌
尖镰孢菌 、燕麦镰孢菌为靶标菌对初筛得到的有较强抑制作
用的拮抗放线菌进行复筛 ,最终得到 5株较为理想的拮抗放
线菌菌株 ,占分离菌株的 5.50%。该研究可为苜蓿根腐病的
生物防治奠定基础 ,进而为该病生防放线菌制剂的研制与应
用提供科学依据。
参考文献
[ 1] 胡清泉.紫花苜蓿根腐病的发生现状与防治措施 [ J].内蒙古草业 ,
2009, 21(1):37-40.
[ 2] 南志标.我国的苜蓿病害及其综合防治体系[ J].动物科学与动物医
学, 2001, 18(4):01-04.
[ 3] UDDINW, KNOUSTR.Fusariumspeciesassociatedwithcrownrotofal-falfainNevada[J].PlantDis, 1991, 75(1):51-55.
[ 4] LEATHKT, KENDALLWA.Fusariumrootrotofforagespecies, Pathoge-
nicityandhostrange[ J].Hytopathology, 1978, 68:826-311.
[ 5] STUDL, ERWINDC.Compendiumofalfalfadisease[M].2nded.St
Paul, Minn, USA:APSPres, 1991:43-44.
[ 6] 李敏权.苜蓿根和根颈腐烂病的病原及种质抗病性研究 [ D].兰州:甘
肃农业大学 , 2002:26-11.
[ 7] 南志标 ,员宝华.新疆阿勒泰地区苜蓿病害 [ J].草业科学, 1994, 11(4):
14-81.
[ 8] 严林,梅洁人.青海省紫花苜蓿病虫种类及害虫天敌的调查 [ J].植物保护, 1996, 22(5):24-51.
[ 9] 曹丽霞,赵存虎 ,孔庆全, 等.紫花苜蓿根腐病病原及防治研究进展
[ J].内蒙古农业科技 , 2006(3):36-37.
[ 10] 梁文平,征斐能.21世纪农药发展的趋势:绿色农药与绿色农药制剂
[ J].农药 , 1999, 38(9):1-2.
[ 11] 陈红军,郭明 ,冯建菊.我国生物农药的研究应用近况[ J].植物保护,
2000, 20(3):21-22.
[ 12] 李晶 ,安德 ,刘翠娟,等.放线菌S-159-05抑菌活性物质的初步研究
[ J].农药 , 2007, 46(11):755-757.
[ 13] 阎逊初.放线菌的分类和鉴定[ M] .北京:科技出版社:1992.
[ 14] WANGJ, ZHUJH, LINW, etal.Screeningforthestrainhighlyproducing
antagonisticsubstancefromBacilussubtilisB47byUVmutagenesis[J].
AgriculturalScience＆Technology, 2008, 9(4):68-72.
[ 15] PEIT, RENDM, SHIJ.Studyonpurificationandpropertiesofantibacte-
rialsubstancefromantagonisticbacteriaP72againstwheatscab[ J].Agri-
culturalScience＆Technology, 2008, 9(6):124-126.
[ 16] LEIBS, JIANGJB, WANGW, etal.Screeningandidentificationofcoton
verticiliumwiltantagonisticbacteriastrain7-30[ J] .AgriculturalSci-
ence＆Technology, 2008, 9(6):127-131.[ 17] 魏杰.紫花苜蓿及其栽培技术[ J].畜牧与饲料科学 , 2009, 30(3):159
-160.
[ 18] 谭英 ,孙振权 ,李树岩 ,等.苜蓿的营养价值及其在养鸡生产中的应用
[ J].畜牧与饲料科学, 2009, 30(5):190.
[ 19] 姚文超,李秋玲,郭孝 ,等.优质苜蓿青干草在奶牛生产中应用效果的
研究 [ J].畜牧与饲料科学, 2009, 30(6):130-132.
(上接第 7928页)
最低还高 27.77%。其他混配药剂除了 0.5%阿维菌素 WE
+豆油 EC0.50+2.50ml/L的校正死亡率不在 60%以上外 ,
其他都在 64.81%以上。
3　讨论
棉籽油 EC(10.00ml/L和 5.00ml/L)对 20%吡虫啉 EC
(0.10ml/L和 0.05ml/L)和 0.5%阿维菌素 WE(1.00ml/L
和 0.50 ml/L)都有明显的增效作用 ,除了 20%吡虫啉 EC+
棉籽油 EC(0.05+5.00ml/L)的校正死亡率只有 81.84%以
外 ,其他都在 94.45以上。
豆油 EC(10.00 ml/L和 5.00 ml/L)对 20%吡虫啉 EC
(0.10ml/L和 0.05ml/L)有明显的增效作用 ,其校正死亡率
达 94.44%以上。而豆油 EC对 0.5%阿维菌素 WE增效作
用没有对 20%吡虫啉 EC的增效作用明显 ,以上 2种药剂混
配溶液的最高校正死亡率为 85.18%,其次为 81.48%,其他
的都在 74.07%以下 。
由以上数据可知 ,棉籽油 EC和豆油 EC对 20%吡虫啉
EC都有明显的增效作用 ,豆油 EC对 0.5%阿维菌素 WE的
增效作用没有棉籽油 EC明显 ,所以在生产实践中 ,可选用棉
籽油 EC或豆油 EC与 20%吡虫啉 EC混配 ,棉籽油 EC和
0.5%阿维菌素 WE混配来防治麦蚜。
参考文献
[ 1] 罗增国 ,高必才 ,王少其.三种新药剂防治小麦蚜虫效果理想 [ J].植
物医生 , 1998, 16(5):22.
[ 2] 吴雪平 ,单长卷 ,包东娥.蓖麻碱粗提取物对麦蚜的生物活性研究[ J].
安徽农业科学, 2006, 34(11):2450-2451.
[ 3] 杜学林 ,戴明勋 ,邢光耀.几种植物油乳油对菜蚜的室内毒力和田间药
效试验 [ J] .农药 , 2006, 45(7):496-497.
7946 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年