全 文 ：第 22卷　第 4期
2006年 4月
甘 肃 科 技
GansuScienceandTechnology
Vol.22　No.4
Apr.　2006
融冻微波破壁法提取枣核中黄酮类化合物及纯化研究
杨自嵘 ,李平菊 ,许莹堂 ,吴冬青
(河西学院化学系 , 甘肃 张掖 734000)
摘　要:本文将融冻微波破壁法和微波破壁法相结合技术用于枣核总黄酮类化合物的提取。详细
研究了融冻微波破壁法和微波破壁法提取枣核中总黄酮类化合物最佳工艺 ,并对黄酮类化合物的
纯化条件作以研究。结果表明:融冻微波破壁法是提取枣核黄酮类化合物的优选方法 ,游离黄酮类
化合物最佳提取工艺为:以料液比为 1g:20ml,体积分数 40%的乙醇为浸提剂 ,在低火 、微波提取
2min。具酚羟基和游离花色素类化合物的最佳提取工艺为:以料液比为 1g:20ml,在中火 、微波提
取 3min。
关键词:融冻微波破壁法;枣核;黄酮;提取工艺
中图分类号:TS202.3 Q586
　　红枣营养丰富 ,有健脾益气 、养血安神 、润肺止
咳 、调和诸药的作用 ,对高血压 、动脉硬化 、冠性病等
症有较好的疗效 ,还具有防癌抗癌 , 延年益寿之功
效 ,也是生产保健食品的良好原料。研究所用枣核
是甘肃临泽昭武酒厂的下脚料 ,常被焚烧或弃于空
地 ,利用下脚料提取具有生物活性的黄酮类化合物 ,
有效地改善了环境并使废物再利用。
八十年代后 ,对黄酮类化合物的研究转向对活
性自由基的清除以及对老年病的防治功能上 ,发现
它们在生物体内有预防心血管疾病 、防癌抗癌 、调节
免疫 、抗衰老 、抗菌 、抗病毒 、抗炎 、抗过敏 、止血镇痛
等诸多功效 ,已列为保健食品的一类功能因子 [ 1] 。
微波技术以其反应高效性 、强选择性 、操作简便 、副
产物少 、产率高 ,以及产物易提取 、易纯化等优点 ,在
提取植物黄酮类化合物中应用越来越广泛 。融冻微
波破壁法是生物化学研究中常用的破碎生物细胞壁
的方法 ,本文采用融冻微波破壁与微波法相结合的
方法 ,确定提取枣核黄酮类化合物的最佳提取工艺 ,
为今后枣核总黄酮类化合物的应用奠定了基础 。
1　材料与方法
1.1　原料 仪器 试剂
1.1.1　原料 枣核由甘肃省临泽昭武酒厂提供 ,洗
净 ,阴干粉碎备用 。
1.1.2　仪器
722S型分光光度计 (上海分析仪器厂 );
FA1004型电子天平 (上海精密科学仪器有限公
司);HH-4数显恒温水浴锅(常州国华有限公司);
LG微波炉(天津乐金电子电器有限公司);RE-52
型旋转蒸发仪(上海青浦沪西仪器厂);SHB-Ⅲ型
循环式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);冰
箱;冷凝回流装置;粉碎机等 。
1.1.3　试剂
95%乙醇 ,硝酸铝 ,亚硝酸钠 ,氢氧化钠等均为
国产分析纯
标准品 芦丁 (生化试剂 国药集团化学试剂有
限公司)。
1.2　试验方法
1.2.1　黄酮类的测定 硝酸铝比色法 [ 3]
1.2.2　浸提条件的选择 采用浸提法 、融冻微波破
壁法和微波破壁法比较试验筛选法
1.2.2.1　融冻微波破壁法提取条件的选择
称取备用的干燥枣核粉 2.0000g,加入蒸馏水 ,立即
放入 -20℃的冰箱中 ,冷冻 ,直溶液完全冻结 。将其
从冰箱中取出 ,进行微波提取 。提取结束后 ,将溶液
冷却到室温 ,用蒸馏水定容至 50ml,用硝酸铝比色
法比色测定。
1.2.2.2　微波破壁法提取条件的选择
称取备用干燥枣核粉 2.0000g,加入乙醇提取
剂 ,立即放入 -20℃的冰箱中 ,冷冻 2h。将其从冰
箱取出 ,进行微波提取。提取结束后 ,将溶液冷却到
室温 ,用 60%的乙醇定容至 50ml,用硝酸铝比色法
比色测定 。
1.2.2.3　浸提法提取条件的选择
称取备用干燥枣核粉 2.0000g,加入提取剂 ,立
即放入 60℃的水浴中回流提取 。提取结束后 ,将溶
液冷却到室温 ,定容至 50ml,用硝酸铝比色法比色
测定。
2　结果与分析
2.1　对照品溶液的制备
精密称取芦丁对照品 75mg,置于 25ml容量瓶
中 ,以少量乙醇微热溶解后 ,乙醇定容。精密吸取
5ml,再以乙醇定容于 25ml,摇匀 。即得芦丁对照
液 ,浓度为 0.6mg/ml。
2.2　标准曲线的制备
精密吸取芦丁对照液 0、0.25、0.50、0.75、 1.
00、1.25、1.50ml分别于具塞试管中均用乙醇稀释
至 3.0ml,精密加入 5% NaNO2 0.4ml,摇匀 ,放置
6min后 ,加入 10%Al(NO3)3 0.4ml,摇匀 ,放置 6min
后 ,加入 5%NaOH 4.0ml定容至 10.0ml放置
15min,测定 510nm处吸光度值 (A)。以吸光度值
(A)为横坐标 ,芦丁含量 y为纵坐标绘制标准曲线 ,
得回归直线方程为:y(mg)=0.819152A+0.003981
R2 =0.9997,测定范围 0-0.90mg。
黄酮含量(mg/g)=y＊d/w(d稀释倍数 , w样
品重量 g)
2.3　浸提法 、微波破壁法和融冻微波破壁法比较试验
称取 1.0000g枣核粉末 12份 ,每两份为一平行
样分别用蒸馏水和乙醇为提取剂 ,以浸提法 、微波破
壁法和融冻微波破壁法做比较试验。结果见表 1:
表 1　三种方法比较试验表
浸提法 融冻微波破壁法 微波破壁法
提取剂 蒸馏水 乙醇 蒸馏水 乙醇 蒸馏水 乙醇
提取温度 70℃ 70℃ 中火 中火 中火 中火
每次提取时间 30h 30h 3min 3min 3min 3min
提取次数 2次 2次 2次 2次 2次 2次
平均得率 0.155% 0.420% 0.265% 0.480% 0.227% 0.457%
由表 1可知 ,无论利用何种提取剂融冻微波破壁法
和微波破壁法提取率均高于浸提法 ,提取相同时间
融冻微波破壁法提取率高于微波破壁法 ,而融冻微
波破壁法乙醇作为提取剂最佳 。因此 ,融冻微波破
壁法是提取枣核黄酮类化合物的优选方法。
2.4　正交试验
为了更好地提取枣核总黄酮类化合物 ,分别设
计 L16(44)和 L9(33)的正交试验利用微波破壁法来
选择提取游离黄酮类化合物的最佳提取方法 ,利用
融冻微波破壁法来选择具酚羟基黄酮类化合物和游
离花色素类化合物的提取方法 ,结果见表 2、表 3:
由表 2可知 ,提取游离黄酮类化合物的因素影
响顺序是:RC>RD>RB>RA,最佳组合:A3B2C1D2
即以料液比为 1g:20ml,体积分数为 40%的乙醇为
浸提剂 ,在低火下浸提 2min为最佳提取条件 。
由表 3可知 ,提取具酚羟基和游离花色素类化
合物的因素影响顺序是:RC>RA >RB最佳组合:
A1B3C3即以料液比为 1g:20ml,在中火下浸提 3min
为最佳提取条件。
表 2　微波破壁法提取游离黄酮类化合物的 L
9
(43)正交试验表
编号 A料液比(g/ml) B温度(火力) C浓度(%) D时间(min) 提取一次 提取两次 总量mg/g
1 1:10(1) 中火(3) 80(3) 1(1) 4.462 1.861 6.233
2 1:15(2) 解冻(1) 80 2(2) 4.994 1.902 6.896
3 1:20(3) 低火(2) 80 3(3) 5.506 2.086 7.592
4 1:10 低火 60(2) 2 5.608 1.943 7.449
5 1:15 中火 60 3 4.523 2.127 6.650
6 1:20 解冻 60 1 4.625 1.882 6.507
7 1:10 解冻 40(1) 3 5.567 2.025 7.592
8 1:15 低火 40 1 5.772 2.086 7.858
9 1:20 中火 40 2 5.875 2.926 8.801
K1 =21.364 K1 =20.995 K1 =24.251 K1 =20.688
K2 =21.404 K2 =22.899 K2 =20.606 K2 =23.146
K3 =22.900 K3 =21.774 K3 =20.811 K3 =21.834
RA=1.536 RB=1.904 RC=3.645 RD=2.458
影响因素:RC>RD>RB>RA最佳组合:A3B2C1D2正交试验表中的解冻指在微波条件下
113第 4期　　　　　　　杨自嵘等:融冻微波破壁法提取枣核中黄酮类化合物及纯化研究
表 3　融冻微波破壁法提取具酚羟基和游离花色素类化合物的 L9(33)正交试验表
编号 A料液比(g/ml) B温度(火力) C时间(min) 提取一次 提取两次 总和mg/g
1 1:10(1) 低火(2) 2(2) 2.343 1.431 3.774
2 1:10(2) 解冻(1) 1(1) 2.065 1.308 3.373
3 1:10(3) 中火(3) 3(3) 2.537 1.594 4.131
4 1:15 解冻 1 1.984 0.816 2.800
5 1:15 中火 3 2.311 1.390 3.701
6 1:15 低火 2 2.455 1.554 4.009
7 1:20 中火 2 3.315 1.574 4.889
8 1:20 低火 1 2.475 0.837 3.312
9 1:20 解冻 3 3.008 1.615 4.623
K1 =11.278 K1 =10.796 K1 =10.386
K2 =10.510 K2 =11.095 K2 =11.463
K3 =12.824 K3 =12.721 K3 =12.763
RA=2.314 RB=1.925 RC=2.377
影响因素:RC>RA>RB最佳组合:A1B3C3正交试验表中的解冻指在微波条件下
2.4　提取级数及提取率的确定
称取 1.0000g枣核粉末 ,在最佳条件下多次浸
取直至无色 ,分别收集每次提取溶液并测其吸光度
(A),合并各次提取溶液总吸光度(A总),平行两份
用线性回归计算得率和提取率 ,确定提取级数 。结
果见表 4:
表 4　提取级数及提取率的确定
提取 1次提取 2次提取 3次 总量
蒸馏水为
提取剂
3.253 1.533 1.021
56.02% 26.40%17.58% 5.807mg/g
乙醇为提
取剂
5.875 2.926 1.247
58.47% 29.12% 12.41% 0.048mg/g
　　由表 4可知:枣核以蒸馏水为提取剂提取 1次
提取率为 56.02%,提取 2次提取率为 82.42%,提
取 3次即可提取完全 ,因此提取三次即可 ,提取级数
为 3。以乙醇为提取剂提取 1次提取率为 58.47%,
提取 2次提取率为 87.59%, ,提取 3次即可提取完
全 ,因此提取三次即可 ,提取级数为 3。
2.5　重现性实验
称取 1.0000g样品粉末 根据正交实验确定的
最佳因素提取两次进行重复性实验结果见表 5:
表 5　重现性实验结果
次数 A B C D E
1次吸光度(A) 0.145 0.146 0.145 0.151 0.145
黄酮含量(mg) 3.069 3.089 3.069 3.192 3.069
2次吸光度(A) 0.079 0.082 0.080 0.077 0.080
黄酮含量(mg) 1.717 1.779 1.738 1.676 1.738
总量(mg) 4.786 4.868 4.807 4.868 4.807
平均值 4.827
次数 A B C D E
偏差 -0.0410.041-0.0200.041 -0.020
RSD 0.0326
变异系数(%) 0.6754
　　由表 5可知 ,经过 5次的重复性实验它们的
RSD为 0.0326,变异系数为 0.6754%,表明重现性
好。
3　黄酮类化合物的纯化(盐析法)实验
准确吸取一定量的已用石油醚处理 ,用乙酸乙
酯分离 ,浓缩的枣核提取液 ,加入不同量的 NaCl晶
体 ,用 90%的乙醇定容 ,静止结晶 ,过滤得黄酮类化
合物精品 。结果见表 6:
表 6　黄酮类化合物的纯化实验
编号 浓缩液量 NaCl的量 乙醇的量 黄酮干品量
1 5.0ml 1.0000g 10.0ml 0.0314g
2 5.0ml 1.5000g 10.0ml 0.0389g
3 5.0ml 2.0000g 10.0ml 0.0276g
4 5.0ml 2.5000g 10.0ml 0.0109g
5 5.0ml 3.0000g 10.0ml NaCl晶体存在
　　由表 6可知 , NaCl晶体加入量为 1.5000g得黄
酮精品量为最佳 ,所以选择加入量 1.5000g为盐析
法纯化枣核黄酮类化合物的最佳量。
4　小结
提取枣核总黄酮类化合物的最佳方法是融冻微
波破壁法 。游离黄酮类化合物的最佳提取工艺为:
以料液比为 1g:20ml,体积分数为 40%的乙醇为浸
提剂 ,在低火 、微波提取 2min。具酚(下转第 176页)
114 　　　　　　　　　　　甘　肃　科　技　　　　　　　　　　　　　　　　第 22卷
退 。
3　湿地可持续管理策略
湿地可持续管理策略就是以湿地可持续发展和
利用为目的而进行湿地管理的行动方针和采取的活
动方式 。对于不同类型 、不同区域的湿地在不同的
发展阶段也应据其特殊性而制定相应的管理策略 。
鉴于我省湿地已经遭受大面积的 、高强度的破坏的
客观事实 ,对于湿地的可持续管理主要应该聚焦于
两个方面:一方面是在那些湿地已受到人类干预而
严重改变的地区 ,可持续利用是湿地的主要考虑因
素 ,在有条件的地区可以实施湿地的恢复与重建计
划;另一方面是对于那些仍有大面积的相对而言未
受改变的湿地的地区应首先考虑保护 ,而且无论是
在什么地区都应优先保护具有区域性和国际性的重
要湿地 。无论是已开发的湿地还是未开发的湿地 ,
可持续性的管理是其共性 ,可持续发展是所有湿地
管理的共同目标 。因为有了这个共同的目标 ,在湿
地管理中就有一系列共同管理策略。
3.1　社区共管策略
所谓社区共管 ,是指让社区居民参与保护方案
的决策 、实施和评估 ,并与保护区共同管理自然资源
的管理模式 。
3.2　加强湿地保护管理立法和宣传教育
完善的政策和法制体系是有效保护湿地生态系
统和实现对湿地资源可持续利用的关键。建立行之
有效的湿地管理的经济政策体系对保护中国湿地促
进湿地资源的合理利用具有极为重要的意义。
3.3　加强湿地科学调查与研究
湿地保护与管理首先必须了解甘肃湿地目前的
保存状态与破坏状况 ,特别是湿地编目与监测数据
的获取 ,弄清湿地受到哪些威胁及湿地的发展趋势 ,
确定优先行动计划等 ,所有的这些活动都必须对湿
地进行科学调查。
3.4　人与人之间关系和人与自然之间关系并重的
策略
　　管理者 、政府部门 、非政府机构及社会之间的协
作是必须的。对湿地自然规律认识不清是达不到湿
地生态系统管理的目的的;同样 ,如果没有解决和协
调好各部门 、各利益主体之间的利益和责任关系 ,也
是达不到管理的目的的 。全面发挥湿地生态系统的
功能需要协调:自然与自然的关系;人与自然的关
系;人与人的关系。
3.5　因时因地制宜 、分层管理的策略
湿地生态系统管理需要适应生态系统的动态特
征和人类认知的动态发展。对不同类型和不同区域
的湿地生态系统的应采取不同的管理方法。对某一
具体的湿地生态系统而言 ,由于其特征和功能会随
时间而发展变化 ,在不同的发展阶段上也应采取不
同的管理方法 。湿地生态系统是等级系统 ,不同层
次上的湿地生态系统具有不同的特征和功能 ,其重
要性 、保护的优先性和管理的目标也不同 ,在客观上
要求对各湿地生态系统区别对待 ,建立分层管理的
管理模式 。
3.6　积极开展国际合作与交流 ,多层次 、多渠道筹
措湿地保护资金
　　当前 ,湿地保护已成为国际社会关注的热点。
我们应该重视在湿地生态系统管理领域里的国际合
作。世界上有些国家很早就开始对湿地生态系统的
保护与管理给予高度重视 ,在这方面他们有了丰富
的理论成果和实践经验。通过双边 、多边 、政府 、民
间等合作形式 ,全方位引进先进技术和湿地管理经
验可以使我们少走弯路 ,起到事半功倍的效果。
(上接第 114页)羟基和游离花色素类化合物的最
佳提取工艺为:以料液比为 1g:20ml,在中火 、微波
提取 3min。提取三次提取率就可达到 100%,因此 ,
提取 3次即可。此法的提取工艺简单 ,条件容易控
制 、提取率高 、重现性好 、方法可靠 ,提取剂乙醇易于
除净 ,此工艺可应用于工业化生产。
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176 　　　　　　　　　　　甘　肃　科　技　　　　　　　　　　　　　　　　第 22卷