全 文 :北方园艺2012(22):111~114 ·生物技术·
第一作者简介:汪殿蓓(1968-),女,湖北洪湖人,博士,教授,研究
方向为植物资源利用及观赏园艺。
基金项目:湖北省教育厅重大科研资助项目(Z20092601)。
收稿日期:2012-07-17
响应曲面法优化万寿菊叶黄素的提取工艺
汪 殿 蓓,张 胜 红,李 建 华
(湖北工程学院 生命科学技术学院,湖北 孝感432000)
摘 要:以乙酸乙酯为提取溶剂,以提取时间、提取温度以及液料比为自变量,采用Box-
Benhnken中心组合设计原理和响应曲面分析法,研究了各因素及其交互作用对万寿菊叶黄素提
取的影响。结果表明:叶黄素提取工艺最佳条件为:提取时间54.32min,提取温度32.09℃,液料
比 (mL∶g)为16.15∶1,吸光度的预测值为2.357,当选取提取时间55min,提取温度32℃,液料
比 (mL∶g)为16.15∶1的实际条件时,吸光度实际值为2.356。该试验所得工艺参数准确,可用
于万寿菊叶黄素的提取生产。
关键词:万寿菊;叶黄素;响应曲面;提取工艺
中图分类号:TS 264.4 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2012)22-0111-04
万寿菊(Tagetes erecta L.)属菊科万寿菊属多年生
草本花卉,原产于墨西哥及热带美洲,在我国多作1a生
栽培。花色有黄色、橙色等,花瓣中富含叶黄素[1]。叶
黄素在预防视黄斑退化、肿瘤、心血管疾病、增加机体免
疫力等方面具有重要的生理功能,现已被广泛用于药
品、饮料、糕点、油脂食品等领域,被认为是一种优良的
天然色素添加剂[2]。目前对万寿菊中叶黄素的提取工
艺和条件已有相关报道,如采用单因素和正交实验方法
探讨不同提取剂、提取温度、提取时间以及料液比等因
素对万寿菊叶黄素提取率的影响[3-4];以及采用柱层析
法[5]、超声波法[6-7]和超临界二氧化碳萃取法[8]对万寿菊
叶黄素提取工艺的研究;且吴兴壮等[9]对制备万寿菊叶
黄素技术的研究作了综合阐述。但到目前为止,采用响
应曲面法研究万寿菊叶黄素提取工艺的报道较少。该
试验在查阅大量文献的基础上,兼顾食品安全及减少环
境污染的原则[7],选用乙酸乙酯作为提取剂,采用Box-
Benhnken中心组合设计原理和响应曲面分析法,对影响
万寿菊叶黄素的提取时间、提取温度以及液料比等因素
进行研究,以期获得最佳工艺条件,为工业生产提供理
论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
万寿菊花朵于2011年9月采自浙江工程学院校园
内,取万寿菊花瓣在自然条件下充分阴干,然后放入粉
Detection of Indigenous Endophytic Bacteria in
Jujube Seedlings Germinated From Seeds
HOU Xiao-jie
(Department of Life Science,Hengshui University,Hengshui,Hebei 053000)
Abstract:The indigenous endophytic bacteria in the tissue culture seedlings germinated from seeds of Ziziphus jujuba
var.fupingdazao were studied using observation with optical microscope and scanning electronic microscope(SEM),and
detection of specific 16SrDNA fragment.The results showed that a large quantity of endophytic bacteria in jujube
seedlings were detected under optical microscope with a magnification of 1 000times,and round,short rod or rod bacterial
cels with the size of 1.5~1.8μm,(2.2~2.9)μm×(1.1~1.9)μm and(3.7~4.4)μm×(1.6~1.9)μm,respectively,
were observed.Rod bacteria were found by SEM as wel.The 16SrDNA fragment of 1.5kb was amplified from the total
DNA of seedlings of jujube with the bacterial primer pair pf27/1525.
Key words:Ziziphus jujuba;endophytic bacteria;detection;optical microscope;scanning electronic microscope;16SrDNA
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·生物技术· 北方园艺2012(22):111~114
碎机中粉碎,过60目标准筛,备用。乙酸乙酯为分析纯,
购自国药集团化学试剂有限公司。试验仪器:盛博多功
能药材粉碎机(浙江省永康市金盛博机械厂);HH-4数
显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司);
PL203电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);
SHZ-III型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂);721可
见分光光度计(上海分析仪器有限公司)。
1.2 试验方法
根据参考文献[3]~[8]可知,提取时间、提取温度、
液料比3个因素对万寿菊叶黄素提取效果影响较显著,
且提取温度范围为25~60℃,提取时间范围为30~
150min,液料比为15∶1~60∶1(mL∶g),根据这3个
因素的取值范围,利用设计软件Design Expert version
7.0中的Box-Benhnken中心组合设计原理和响应曲面
法设计3因素5水平共22组试验,试验方案见表1。
表1 响应曲面设计试验方案及试验结果
Table 1 Experiment design and results of response surface for
the extraction of xanthophyl fromT.erecta L.
序号温度/℃ 时间/min 液料比 吸光度 序号温度/℃ 时间/min 液料比 吸光度
1 52.91 125.68 8.08 2.299 12 42.50 90.00 16.25 2.338
2 42.50 30.00 16.25 2.305 13 42.50 90.00 16.25 2.328
3 42.50 90.00 16.25 2.345 14 52.91 54.32 24.43 2.295
4 42.50 90.00 2.50 2.310 15 52.91 54.32 8.08 2.305
5 42.50 90.00 16.25 2.327 16 42.50 90.00 16.25 2.328
6 42.50 90.00 16.25 2.329 17 60.00 90.00 16.25 2.460
7 32.09 54.32 24.43 2.339 18 32.09 125.68 8.08 2.348
8 42.50 150.00 16.25 2.334 19 42.50 90.00 30.00 2.322
9 42.50 90.00 16.25 2.340 20 52.91 125.68 24.43 2.259
10 32.09 125.68 24.43 2.293 21 32.09 54.32 8.08 2.356
11 42.50 90.00 16.25 2.311 22 25.00 90.00 16.25 2.365
首先称取0.500g粉碎过筛的万寿菊(黄色品种)粉
末,装入烧杯;按表1方案设计,在烧杯中加入乙酸乙酯,
对万寿菊粉末进行溶解;溶解后按表1设计的提取时间
和提取温度,将加入溶剂的烧杯放入水浴锅中进行水
浴;然后将水浴后的烧杯从锅中取出,运用循环水真空
泵进行超滤,得提取液;最后将超滤得到的提取液用乙
酸乙酯定容至100mL;再用1cm比色皿以乙酸乙酯作
空白对照在波长400~580nm下,每隔10nm测定吸光
度值,以确定最大吸收峰,在最大吸收峰的波长下,测定
提取液的吸光度值。
2 结果与分析
2.1 叶黄素最大吸收峰及响应曲面试验结果
由于叶黄素含量与其提取液吸光度呈线性正相
关[10],故以溶液吸光度表示叶黄素提取量的大小。按表
1中12、13、17方案提取万寿菊的叶黄素,确定叶黄素的
最大吸收峰,3个方案试验结果非常一致,叶黄素的最大
吸收波长为440nm(图1),因而选取吸收波长440nm作
为测定波长。
以吸光度为响应值,按响应曲面设计方案的试验结
果见表1。
图1 叶黄素在乙酸乙酯中的吸收图谱
Fig.1 Visible spectrum of xanthophyl in ethyl acetate
2.2 模型的建立及显著性检验
应用Design Expert软件对表2中的数据进行多元
回归拟合,得到万寿菊叶黄素提取液吸光度对提取温度
(A)、提取时间(B)和液料比(C)的4次多项回归方程:
Y=2.330+0.028A+0.008523B+0.003568C+
0.001667AB+0.002833AC-0.008667BC-0.037A2-
0.002876B2-0.021A2 B-0.019A2 C-0.050AB2 +
0.024A4。
对所得模型进行显著性检验,结果见表2。回归方
程系数及其显著性检验结果见表3。由表3可知,该回
归模型P<0.01,表明回归方程模型极显著;失拟项P=
0.2528>0.05,表明失拟不显著。方程的复相关系数R2
为0.9637,R2Adj为0.9154,表明模型回归方程的拟合程度
良好,可用来分析和预测万寿菊叶黄素的提取工艺。
表2 回归模型的方差分析
Table 2 Variance analysis of fitted quartic polynomial model
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 P值
模型 0.0290000 12 0.002427 19.93 <0.0001
失拟项 0.0003561 2 1.781 1.68 0.2528
残差 0.0010960 9 1.218
纯误差 0.0007399 7 1.057
总误差 0.030 21
R2=0.9637
R2Adj=0.9154
C.V.=47%
由表4可知,回归模型的一次项A(温度)极显著,二
次项中A2极显著,三次项中A2B和AB2极显著、A2C显
著,四次项中A4极显著,其它项均不显著,表明不同的提
取工艺与万寿菊叶黄素提取量不是简单的线性关系。
2.3 响应曲面分析与工艺优化
根据回归方程绘出响应曲面图及等高线图,以确定
提取温度、提取时间和液料比3个因素对万寿菊叶黄素
提取效果的影响及这3个因素间的相互作用,响应曲面
图及等高线图见图2~4。
211
北方园艺2012(22):111~114 ·生物技术·
表3 回归方程系数及其显著性检验
Table 3 Variance analysis of quadratic response surface regression model
模型项 系数 标准误 95%置信下限 95%置信上限 F值 P值
常量 2.330 3.490E-003 2.32 2.34
A 0.028 4.640E-003 0.018 0.039 36.79 0.0002**
B 8.523E-003 4.640E-003 -1.973E-003 0.019 3.37 0.0994
C 3.568E-003 4.640E-003 -6.928E-003 0.014 0.59 0.4616
AB 1.667E-003 3.902E-003 -7.159E-003 0.010 0.18 0.6793
AC 2.833E-003 3.902E-003 -5.993E-003 0.012 0.53 0.4862
BC -8.667E-003 3.902E-003 -0.017 1.595E-004 4.93 0.0535
A2 -0.037 8.052E-003 -0.055 -0.018 20.73 0.0014**
B2 -2.876E-003 3.022E-003 -9.712E-003 3.961E-003 0.91 0.3662
A2B -0.021 6.062E-003 -0.034 -6.809E-003 11.46 0.0081**
A2C -0.019 6.062E-003 -0.032 -5.020E-003 9.55 0.0129*
AB2 -0.050 6.062E-003 -0.064 -0.037 68.87 <0.0001**
A4 0.024 3.069E-003 0.017 0.031 58.98 <0.0001**
图2 提取温度和提取时间的响应曲面和等高线图
Fig.2 Response surface and contour plots for the efect of
cross-interaction between extraction temperature and extraction
time on extraction rate of xanthophyl fromTagetes erecta L.
响应面可以直接反应出各因子对响应值影响的大
小,由等高线图可以看出最优条件下各因子的取值。响
应曲面法的图形是响应值Y对应自变量A、B、C构成的
一个三维空间图及在二维平面上的等高线图,从试验所
得响应面分析图上可以看出其在反应过程中的相互作
用而确定合适的工艺条件[11]。如果响应面坡度相对平
缓,表明其可以忍受处理条件的变异,而不影响到响应
值的大小。相反,如果坡度非常陡峭,那么表明响应值
对于处理条件改变非常敏感[12]。由图2~4可以看出,
叶黄素提取率对提取温度的变化较敏感,当提取温度为
42.5℃,随着提取时间的延长,叶黄素提取率越高。结合
模型系数的显著性检验结果可知,提取温度与提取时
间、提取温度与液料比、提取时间与液料比的两两交互作
图3 提取温度和液料比的响应曲面和等高线图
Fig.3 Response surface and contour plots for the efect of
cross-interaction between extraction temperature and liquid-material
ratio on extraction rate of xanthophyl fromTagetes erecta L.
用都不显著,而三次方项之间存在着显著的交互作用。
2.4 模型的验证性试验
利用Design Expert软件对万寿菊叶黄素提取条件
进行响应曲面优化设计,得到万寿菊叶黄素提取的最佳
条件为:提取时间54.32min,提取温度32.09℃,液料比
(mL∶g)为16.15∶1,预测万寿菊叶黄素提取液的吸光
度值为2.357。
考虑到实际操作的可行性,对模型预测条件略作修
改,选择提取条件为:提取时间55min,提取温度32℃,
液料比16.15∶1,实际测得万寿菊叶黄素提取液的吸光
度值为2.356,与预测值2.357非常接近,因此利用响应
曲面法优化万寿菊叶黄素提取工艺是有效和可行的,具
有实际应用价值。
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·生物技术· 北方园艺2012(22):111~114
图4 提取时间和液料比的响应曲面和等高线图
Fig.4 Response surface and contour plots for the efect of
cross-interaction between extraction time and liquid-material
ratio on extraction rate of xanthophyl fromTagetes erecta L.
3 结论
以乙酸乙酯为提取溶剂,应用响应曲面设计得到了
万寿菊叶黄素提取效果与提取温度、提取时间和液料比
的回归模型,经验证试验证明,该方程是准确可靠的,能
有效预测叶黄素提取液的吸光度。模型方程为:Y=
2.330+0.028A+0.008523B+0.003568C+0.001667AB+
0.002833AC-0.008667BC-0.037A2-0.002876B2-
0.021A2B-0.019A2C-0.050AB2+0.024A4。
在对各主要影响因素及其相互作用进行探讨后,得
到叶黄素提取的优化工艺参数为:提取时间54.32min,
提取温度32.09℃,液料比 (mL∶g)为16.15∶1,此条件
下万寿菊叶黄素提取液的吸光度理论值为2.357。考虑
到实际操作的可行性,最后优选的提取工艺条件为:提
取时间55min,提取温度32℃,液料比16.15∶1,此条件
下叶黄素提取液的吸光度值为2.356。因此,应用响应
曲面法对万寿菊叶黄素的提取工艺进行优化,可获得最
佳工艺参数,省时省力,准确可靠,能够为进一步试验研
究提供理论依据。
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Optimization of Extraction Conditions of Xanthophyl from
Tagetes erecta L.by Response Surface Methodology
WANG Dian-pei,ZHANG Sheng-hong,LI Jian-hua
(School of Life Science and Technology,Hubei Engineering University,Xiaogan,Hubei 432000)
Abstract:With Ethyl acetate as extraction solvent,Box-Benhnken central composite design and response surface
methodology were used to explore the efects of extraction time,extraction temperature and liquid-material ratio as wel as
their cross-interactions on extraction rate of xanthophyl from Tagetes erecta L.The results showed that the optimal
extraction processing parameters were extraction time of 54.32minutes,extraction temperature of 32.09℃and liquid-
material ratio of 16.15∶1,in which the forecast value was 2.357.Under the actual extraction conditions such as
extraction time of 55minutes,extraction temperature of 32℃and liquid-material ratio of 16.15∶1,the absorbance value
of xanthophyl was 2.356.The processing parameters achieved from these experiments were accurate and could be applied
to the extraction and production of xanthophyl fromT.erecta L.
Key words:Tagetes erecta L.;xanthophyl;response surface methodology;extraction technology
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