全 文 ：收稿日期:2011-01-10
基金项目:河南省科技厅科技攻关项目(102102310345)
作者简介:于相丽(1975-),女 ,河南漯河人 , 讲师 ,硕士 , 主要从事植物生物技术研究。 E-mail:shuyu97@sina.com.cn
茜草茎段组织培养灭菌方法研究
于相丽 ,李勇慧 ,王　静
(洛阳师范学院 ,河南 洛阳 471022)
摘要:研究了不同灭菌剂(0.1%HgCl2 、10%NaClO 、10%H 2O 2)、不同灭菌时间 、二步灭菌法对茜
草不同年龄的茎段污染率和愈伤组织诱导率的影响。结果表明:75%酒精处理 30 s+10%NaClO
灭菌 20min效果最好 ,污染率 20%,愈伤组织诱导率为 35%;二步灭菌法不适合于茜草茎段的灭
菌;幼嫩茜草茎段愈伤组织诱导率最高 ,达 55%。
关键词:茜草;灭菌方法;污染率;愈伤组织诱导率
中图分类号:S567.23+9　　文献标识码:A 　　文章编号:1004-3268(2011)07-0130-03
Sterilization Conditions for Tissue Culture of
Stem in Rubia cord i f olia L.
YU Xiang-li , LI Yong-hui ,WANG Jing
(Colleg e of Life Science , Luoyang Normal Unive rsity , Luoyang 471022 , China)
Abstract:The different age stems from Rubia cordi f ol ia L.were used as explants to study the
ef fects o f dif fe rent bactericides(0.1%HgCl2 , 10%NaClO , 10%H2O2), dif ferent sterilization
times , and tw o-step asepsis on pollution of explants and induction of callus.The resul ts show ed
that the method of 75% alcohol 30 s+10%NaClO 20min w as the best and the pol lut ion ra t w as
20%, induction rate w as 35%;the method of tw o-step asepsis w as sui table fo r stems of Rubia
cordi folia L.;the young stemsinduct ion rate of callus w as the highest up to 55%.
Key words:Rubia cordi f ol ia L .;S terilization method;Pol lut ion rate;Induct ion rate
　　茜草(Rubia cordi folia L .),为茜草科多年生
攀援草本植物 ,以干燥根或根茎入药 ,有凉血止血 、
活血去瘀作用 ,用于吐血 、崩漏 、外伤出血 ,经闭瘀
阻 、关节痹痛 、跌扑肿痛[ 1]等的治疗。茜草自然生长
十分缓慢 ,野生资源趋于枯竭 ,且大量挖取造成水土
流失 。为保护国内茜草野生资源 ,实现茜草生产现
代化栽培 ,开展茜草的快繁及愈伤组织诱导的研究
就显得更为迫切和重要[ 2] 。污染是组织培养过程中
首先要解决的问题 ,在试验过程中常常会因外植体
灭菌不彻底 ,导致组培无法取得预期效果 ,因此外植
体的灭菌技术 ,直接影响整个组织培养过程[ 3] 。对
茜草来说 ,其茎 、叶均有倒刺 ,易隐藏微生物 ,灭菌工
作更为重要。本研究以茜草不同年龄段的茎段为外
植体 ,采用不同灭菌剂(0.1%HgCl2 , 10%NaClO ,
10%H 2O 2)、不同时间及二步灭菌法进行处理 ,观察
接种茜草茎段后的污染率以及愈伤组织诱导率 ,以
期为茜草组织培养提供借鉴 。
1　材料和方法
1.1　材料
试验材料茜草(Rubia cordi folia L.)取自洛阳
师范学院中区校园 ,选取生长良好的茜草茎 ,切成
3 cm 左右的茎段 ,自来水冲洗 2 h后进行灭菌处理。
1.2　方法
1.2.1　不同灭菌剂处理　75%酒精浸泡外植体
30 s ,共设 9 个处理:A1:0.1%HgCl2 溶液灭菌
　河南农业科学 ,2011 ,40(7):130-131 ,134
　Journal of Henan Ag ricultural Sciences
DOI :10.15933/j.cnki.1004-3268.2011.07.029
2min;A2:0.1% HgCl2 溶液灭菌 5min;A3:0.1%
HgCl2 溶液灭菌 8min;B1:10%NaClO 溶液灭菌
10min;B2:10%NaClO 溶液灭菌 20min;B3:10%
NaClO 溶液灭菌 30min;C1:10% H2O2 溶液灭菌
10min;C2:10% H 2O 2 溶液灭菌 15m in;C3:10%
H 2O2 溶液灭菌 20min。无菌水冲洗 5 次后 , 把茜
草茎段切成 1 cm 左右的小段(切去节), 接种在
MS+2 ,4-D 2mg/ L 诱导培养基中进行培养。温度
(25±1)℃,相对湿度 60%～ 70%,光照 3 000lx ,人
工光照 15 h/d。接种后第 2天开始记录污染和褐化
情况 ,20 d后统计污染率和愈伤组织诱导率 ,比较灭
菌效果 ,筛选出最佳灭菌方案 。污染率=污染外植
体数/接种外植体数×100%;愈伤组织诱导率=发
生愈伤组织数/接种外植体数×100%。
1.2.2　二步灭菌法灭菌处理　75%酒精灭菌 30 s
后 ,共设 3 个处理 , 即 D:0.1% HgCl2 溶液灭菌
2min;E:10% NaC lO 溶液灭菌 20min;F :10%
H 2O2 溶液灭菌 15min 。然后各处理于无菌水静置
48 h ,再次用 75%酒精灭菌 30 s后 ,用 0.1%的升汞
灭菌 5min 。接种及统计方法同上。
1.2.3　不同年龄段茜草茎段处理　选取生长健壮
的不同年龄段茜草茎段用 75%酒精灭菌 30 s后 ,再
用 10%NaClO 溶液处理 20min 。接种及统计方法
同上 。
2　结果与分析
2.1　不同灭菌剂处理对茜草茎段愈伤组织的影响
由表 1可以看出 ,经过不同灭菌剂的处理 ,效果
最好的为 10%NaClO ,污染率都在 25%以下 ,愈伤
组织诱导率也较高;0.1%升汞灭菌效果次之 ,愈伤
组织诱导率低;最差的为 10% H2O2 ,污染率高 ,而
且愈伤组织诱导率为 0。所有处理中 ,污染率最低
的是 A3组 ,污染率为 10%,但愈伤组织诱导率仅有
5%,本次试验的最终目的是得到愈伤组织 ,进一步
培养得到组培苗 ,HgCl2 虽然有很强的杀菌效果但
由于其毒性过大 ,在灭菌过程过度损伤茜草茎段 ,导
致其愈伤组织诱导率较低;10%N aClO 毒性相对较
小 ,灭菌过程中不产生有害副反应物 ,虽然处理时间
相对较长 ,有较好的杀菌效果 ,对茜草茎段损伤小 ,
所以愈伤组织诱导率相对较高;而 10% H 2O 2 处理
后 ,可能由于在杀菌过程中 ,产生较多氧离子 ,对茜
草损伤过大 ,以至于不能产生愈伤组织。综合考虑
污染率和愈伤组织诱导率 ,最好的处理组是 B2组 ,
即 75%酒精灭菌 30 s后用 10%NaClO 灭菌 20m in
的处理。
表 1　不同灭菌剂处理对茜草茎段愈伤组织的影响
处理 外植体数/个 污染率/ % 愈伤组织诱导率/ %
A1 20 40 20
A2 20 25 15
A3 20 10 5
B1 20 15 15
B2 20 20 35
B3 20 25 20
C1 20 65 0
C2 20 70 0
C3 20 60 0
2.2　二步灭菌法对茜草茎段灭菌效果的影响
由表 2可以看出 ,不同灭菌剂经二步灭菌法处
理的茜草茎段 ,污染率都很低 ,但愈伤组织诱导率都
为 0。这可能和茜草本身有关 ,茜草是草本植物 ,茎
木质化程度低 ,表皮较易受伤害 ,尤其是在无菌水浸
泡 2 d后 ,受到更大的伤害 ,导致其愈伤组织诱导率
都为 0。综合考虑污染率和愈伤组织诱导率 ,二步
灭菌法杀菌效果虽好 ,但不适合用于茜草茎段消毒。
表 2　二步灭菌法对茜草茎段灭菌效果的影响
处理 外植体数/个 污染率/ % 愈伤组织诱导率/ %
D 20 0 0
E 20 15 0
F 20 10 0
2.3　不同生理状态茜草茎段对愈伤组织诱导的影响
由表 3可以看出 , 10%的 NaClO 灭菌 20min ,
幼嫩和成熟的茎段 ,污染率均为 10%,而衰老的茎
段 ,污染率相对较高 ,这可能和材料本身携带的微生
物多少有关 ,材料生长时间越长 ,携带微生物越多 ,
故衰老茎段污染率相对较高 。细胞的生理状态和其
脱分化的能力密切相关 ,细胞越幼嫩 ,脱分化能力越
强 ,反之 ,脱分化能力越弱 ,这个规律在本试验中也
得到体现。对 3种材料来讲 ,愈伤组织诱导率有很
大差别 , 最高的是幼嫩茎段 , 愈伤组织诱导率为
55%,成熟茎段次之 ,为 40%,最弱的为衰老茎段 ,
只有 20%。以后在茜草取材时 ,尽可能选取幼嫩的
材料 ,以获得较多的愈伤组织。
表 3　不同生理状态茜草茎段愈伤组织诱导率
茎段生理
状态 外植体数/个 污染率/ %
愈伤组织
诱导率/ %
幼嫩 20 10 55
成熟 20 10 40
衰老 20 20 20
3　结论与讨论
污染是组织培养过程中首先遇到的问题 ,且很难
控制。如果不能将污染降低到一定 (下转第 134页)
131　第 7期　　　　　　　　　　　于相丽等:茜草茎段组织培养灭菌方法研究
3　结论与讨论
利用一体化营养基育苗被证明不仅省工省时 ,
育出的苗健壮 、抗逆能力强而且幼苗发育快 、缓苗
快 ,移植成活率高;同时它对于促进花芽分化 、开花
坐果数增多 、延缓衰老 、产品品质改善和提前上市以
及增产增收也具有明显效果[ 1-5] 。
在西瓜上采用中农赛世公司研制的一体化育苗
营养基育苗虽然在提高产量 、增强抗病性等方面还
达不到对照 2的效果 ,但是相对于传统的育苗方式
对于促进根系生长 、培育壮苗有着显著作用 ,并且可
以使花期提前4 ～ 5 d ,坐果率提高 6.7个百分点 ,产
量提高 20%以上 ,这对于增加果实单果质量 、提高
产量 、促进坐果 ,促进西瓜增收增效具有明显效果 。
同时 ,采用一体化育苗营养基育苗可以使幼苗立枯
病的发病率降低 ,在后期生长过程中可使枯萎病的
发生降低 11.72个百分点 。
由于果实成熟时瓜蔓太长导致不易测定株高 ,
所以试验中采用的株高数据为前期测定的数值 ,但
是或许成熟期的株高更能说明问题 ,这一点值得进
一步试验研究。
参考文献:
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(上接第 131页)　范围内 ,意味着组织培养不能继
续进行 ,因此 ,保证无菌培养是植物组织培养成败的
关键[ 4] 。对于茜草 ,因其生长在地面 ,生活环境复杂
且表面有倒刺 ,很容易携带大量微生物且难以清除 ,
因此 ,茜草外植体的生理状态 、灭菌剂的种类选择 、
灭菌时间 、灭菌方法等都是组织培养中需要解决的
问题 。本试验结果表明 , 75%酒精灭菌 30 s+10%
NaClO 灭菌 20min 效果最好 ,茜草茎段污染率最
低 ,且愈伤组织发生率最高 。二步灭菌法作为一种
有效的灭菌方法 ,在很多植物上得到应用 ,对于茜草
来说 ,虽然污染率低 ,但不能有效的诱导愈伤组织 ,
故不宜采用二步灭菌法。
组织培养中 ,外植体的生理状态也是不可忽略
的影响因素[ 5] 。本试验将茜草茎段分为 3个不同的
生理状态 。发现幼嫩的材料愈伤组织诱导率较高 ,
这说明分生组织在早期发生的内在变化通过细胞分
裂传递下去 ,造成生理状态处于晚期的细胞脱分化
比早期细胞更难 ,因而更难诱导出愈伤组织;也可能
在幼嫩的材料中 ,内源激素的含量相对较高 ,而培养
基所加的外源激素能很快诱导其产生愈伤组织 ,而
其他材料由于内源激素含量下降 ,培养基的外源激
素不能很快引起其脱分化。
参考文献:
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134 河南农业科学 第 40卷