全 文 ：韶关学院学报·自然科学
Journal of Shaoguan University·Natural Science
火炭母组织培养灭菌方法探索
刘静华
（韶关学院 英东生命科学学院， 广东 韶关 512005）
收稿日期：2013-04-22
作者简介：刘静华（1980-），女，广东龙川人，韶关学院英东生命科学学院实验师，主要从事分子生物学、基因工程方面的研究.
2013年 6月
第 34卷 第 6期
Jun.2013
Vol.34 No.6
摘要：针对火炭母组织培养中的污染问题，以火炭母带腋芽茎段为外植体，设计多种灭菌方法，进行组织培养.以求找
出降低污染的方法.实验结果表明：用洗涤剂处理、紫外线照射、75%碱化乙醇、1%次氯酸钠组合的灭菌方法，能有效降
低火炭母组织培养污染率，同时还可提高腋芽萌发率，是火炭母的组织培养比较理想的灭菌方法.
关键词：火炭母；组织培养；灭菌方法
中图分类号：S567.23+9 文献标识码：A 文章编号：1007-5348（2013）06-0050-04
火炭母为蓼科（Polygonaceae）蓼属（Polygonum）植物火炭母草（Polygonum Chinese Linn.）.别名火炭毛、
火炭藤、信饭藤、老鼠蔗等.性味寒，微酸、涩.具有清热利湿，凉血解毒，祛湿止痒，平肝明目，活血舒筋等功
效.用于痢疾、泄泻、咽喉肿痛、肺热咳嗽、流行性腮腺炎、扁桃腺炎、肝炎等疾病的治疗，是常用中草药.为广
东凉茶、腹可安等中成药的固有成份.分布于我国南部的广东、广西、福建、贵州等地.研究发现，火炭母对于
大肠埃氏菌、绿脓杆菌、金黄葡萄球菌、痢疾杆菌、枯草杆菌等具有一定的抑菌活性 ［1-3］.种植上如采用组织
培养技术繁殖种苗，不仅能大大提高繁殖速度，而且可使植株脱毒，保持品种的优良品质.而在组织培养过
程中，外植体污染是要首先解决的问题，外植体灭菌是否彻底，是外植体污染的主要原因之一.从火炭母植
株特点分析，其茎为圆柱形，略具棱沟，或被疏毛或腺毛，容易隐藏微生物.因此本研究选择幼嫩的带腋芽茎
段为外植体，采用不同的消毒灭菌剂、不同的物理灭菌方法进行处理，观察接种后的污染率、腋芽萌发率、
褐化率，以求提高火炭母组织培养的成功率.
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
火炭母选取生长良好，表观无病变的带腋芽幼嫩茎段.升汞、乙醇、氢氧化钠、次氯酸钠、过氧化氢均为
国产分析纯.75%碱化乙醇为 75%（体积分数）乙醇与 40%（质量分数）氢氧化钠按 100∶1（体积比）配成，MS
培养基（含 1.0 mg/l 6-BA、0.2 mg/l NAA、0.6%琼脂、3%蔗糖，pH5.8-6.0），洗涤剂混合液为普通家用洗涤剂
与自来水 1∶50（体积比）混合.
1.2 仪器设备
超净工作台（苏州佳宝净化有限公司 SW-CJ-IBC 型），高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂 ZDX-35BI
型）， 恒温干燥箱 （上海申光仪器仪表有限公司 200AB-2型）， 光照培养箱 （韶关泰宏医疗器械有限公司
LRH-250-G型），电子分析天平（上海恒平 JA5003型）.
1.3 实验方法
预处理：火炭母茎段用自来水冲洗表面泥土后，切去叶片，自来水冲洗 30 min.除去顶芽，剪成长约 1.5～
2.0 cm的带 1个腋芽的小段备用.
第 6期
外植体表面灭菌方案见表 1.
表 1 火炭母外植体表面灭菌方案
每次用消毒剂浸泡后用无菌水冲洗 5 次，每次 2 min.将完成灭菌的外植体接种于 MS 培养基上，每一
种灭菌方案均接种 10 瓶，每瓶 5 个外植体.培养温度 28℃，光照 14 h/d，光照强度 1 600 lx，接种 12 d 起统
计污染外植体数量.以污染率（%）=污染的外植体数/接种外植体数×100%，腋芽发芽率（%）=发芽的外植体
数/接种外植体数×100%，来计算污染率以及腋芽萌发率.
2 结果与分析
2.1 不同消毒处理的灭菌效果
实验结果表明，方案 C1、C4、D1、D4 四个处理的灭菌效果较好，污染率分别为 20%、20%、22%、22%；其
次为方案 C2、C5、D2、D5， 污染率分别为 26%、24%、24%、26%， 其余方案污染率均在 30%以上. 方案 A、B
组、 与方案 C、D组对比可知， 增加洗涤剂处理或紫外线照射会显著提高灭菌效果. 方案 C1、C4 对比方案
D1、D4可知，选用洗涤剂处理或紫外线照射与 75%乙醇、0.1%升汞的组合或者 75%碱化乙醇、1%次氯酸钠
的组合，灭菌效果相当，是降低污染率的最佳组合.
2.2 不同消毒处理对腋芽萌发的影响
不同消毒处理对腋芽萌发的影响试验表明，用了 0.1%升汞的方案如 A1、B1、C1、D1腋芽萌发率低于或
等于 40%，其余使用 1%次氯酸钠或 10%过氧化氢的方案萌发率均在 50%以上，方案 C、D 组中使用 75%碱
化乙醇与 1%次氯酸钠或 10%过氧化氢的方案萌发率在 70%以上，显著高于其他方案.可见选用洗涤剂处
理或紫外线照射与 75%碱化乙醇、1%次氯酸钠或 10%过氧化氢的组合能显著提高腋芽萌发率.
2.3 不同消毒处理对外植体存活率的影响
实验结果表明，用了 0.1%升汞的方案如 A1、B1、C1、D1 存活率都低于 60%，其余使用 1%次氯酸钠或
10%过氧化氢的方案存活率均在 80%以上.可见使用次氯酸钠或过氧化氢来代替升汞，能显著提高火炭母
外植体的存活率.
因此，在火炭母带腋芽又能茎段灭菌过程中使用洗涤剂处理 30 min 或紫外线照射 30 min 后用 75%碱
A2 √ √
A3 √ √
B1 √ √
B2 √ √
B3 √ √
C1 √ √ √
C2 √ √ √
C3 √ √ √
C4 √ √ √
C5 √ √ √
D1 √ √ √
D2 √ √ √
D3 √ √ √
D4 √ √ √
D5 √ √ √
方案
表面灭菌步骤
洗涤剂处理
30 min
紫外照射
30 min
75%乙醇浸泡
30 s
75%碱化乙醇
浸泡 30 s
0.1%升汞
浸泡 8 min
1%次氯酸钠
浸泡 15 min
10%过氧化氢
浸泡 10 min
A1 √ √
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韶关学院学报·自然科学 2013年
化乙醇处理 30 s，最后用 1%次氯酸钠处理 15 min是最佳灭菌方案.
表 2 不同消毒剂处理对火炭母组织培养的结果
3 结论与讨论
(1)消毒剂的选择.消毒剂和处理时间对外植体的消毒效果影响明显，而且根据火炭母茎结构上略具棱
沟，或被疏毛或腺毛，容易隐藏微生物的特点，采用一般的 75%乙醇组合 0.1%升汞的方案消毒不理想.因此
要根据接种材料的具体特点确定最佳的消毒剂和处理时间组合.研究结果表明：方案 C1 污染率为 20%，腋
芽萌发率为 36%；方案 D1 污染率为 22%，腋芽萌发率为 40%.这两种方法污染率控制比较理想，是因为先
使用了洗涤剂或者紫外线照射，而且升汞中的 Hg2+可以与带负电荷的蛋白质结合，使蛋白质变性，从而杀死
菌体［2］.萌发率低是因为升汞容易在植物体上残留，对植物体伤害大.方案 C4 污染率为 20%，腋芽萌发率为
80%；方案 D4污染率为 22%，腋芽萌发率为 76%，这两种方法污染率比较低，同时拥有较高的萌发率，因为选
用了 75%碱化乙醇与 1%次氯酸钠的组合，碱化乙醇中的 OH-可改变细胞膜表面所带电荷性质，增加膜的通
透性，从而提高乙醇的杀菌能力［3］.次氯酸钠可以释放出活性氯离子，从而杀死菌体，其消毒力很强，而且不易
残留，对环境无害. 75%乙醇是常用的表面消毒剂，具有较强的穿透力，使菌体蛋白质脱水变性，杀菌效果好，
同时它还具有较强的湿润作用，可排除材料的空气，有利于其他消毒剂的渗入.但是乙醇对植物材料的杀伤作
用很大，如浸泡时间过长，植物材料的生长将会受到影响，甚至被杀死.所以使用时应严格控制时间，浸泡完后
冲洗干净.但乙醇不能彻底消毒，要配合其他消毒剂使用.实验结果表明 75%碱化乙醇比 75%乙醇表面灭菌效
果更好.升汞的消毒效果虽然极佳，但对植物体伤害大，对环境危害大，对人畜毒性极强，可选择不易残留的次
氯酸钠来代替.过氧化氢消毒效果较好，易清除，不会损伤植物体，但消毒效果一般.
（2）洗涤剂处理与紫外线照射能降低污染率.洗涤剂的主要成分是表面活性剂，其分子会强烈地降低水
的表面张力，使附着在火炭母茎棱沟或腺毛上的污垢迅速膨胀，从而降低污垢与植物体表面的结合力，无
菌水冲洗后能有效去除火炭母表面的污垢.紫外线会穿透微生物的细胞膜和细胞核，破坏 DNA的分子键，使
方案 接种数/个 污染数/个 污染率/% 发芽数/个 萌发率/% 褐化率/% 存活率/%
A1 50 20 40 19 38 45 55
A2 50 21 42 28 56 13 87
A3 50 23 46 27 54 9 91
B1 50 17 34 17 34 47 53
B2 50 19 38 28 56 12 88
B3 50 21 42 28 56 8 92
C1 50 10 20 18 36 43 57
C2 50 13 26 34 68 14 86
C3 50 15 30 33 66 8 92
C4 50 10 20 40 80 13 87
C5 50 12 24 37 74 10 90
D1 50 11 22 20 40 45 55
D2 50 12 24 34 68 12 88
D3 50 15 30 32 64 7 93
D4 50 11 22 38 76 10 90
D5 50 13 26 37 74 8 92
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其失去复制能力和活性.紫外线照射火炭母茎段能够抑制附着其表面的微生物的繁殖，从而减少污染率.
因此，用洗涤剂处理、紫外线照射、75%碱化乙醇、1%次氯酸钠的灭菌方法，能有效降低火炭母组织培
养污染率的同时，大大提高腋芽萌发率.此次试验为火炭母的组织培养找到了比较理想的灭菌方法.
参考文献：
［1］黄国霞，刘柳，汪青，等.火炭母有效成分的提取及抗氧化活性研究［J］. 湖北农业科学，2011，29（12）：2490.
［2］欧阳蒲月，朱翠霞，陈恭喜，等.火炭母提取物抑菌活性的初步研究［J］.化学与生物工程，2012，29 （4）：37-40.
［3］文明玲，乐正碧，徐茜，等.金银花组织培养外植体灭菌方法探索［J］.陕西农业科学，2011，57（2）：50-51，63.
Exploration of sterilization method for tissue culture of Polygonum Chinese
LIU Jing-hua
（Yingdong College of Life Sciences，Shaoguan University，Shaoguan 512005，Guangdong，China）
Abstract: To deal with the pollution in tissue culture of Polygonum Chinese Linn the study was carried out by
using the belf of the axial bud and the stem section of Polygonum Chinese Linn to find out the methods of re-
ducing pollution. The best sterilization method of explants was when the explants were treated with the combi-
nation of detergent treatment, ultraviolet radiation, 75% alkaline ethanol, 1% sodium hypochlorite, which can ef-
fectively reduce the pollution, at the same time, improve the germination rate.
Key words: Polygonum Chinese Linn.; tissue culture；sterilization method
（E D. : X， J）
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