全 文 ：图 8　阴阳双补组-2(肾气丸全方)HPLC色谱图
3　讨论
实验过程中流动相试用了甲醇-水(30∶70)、甲醇-水(45∶
55)、甲醇-水(50∶50)、甲醇-水(60∶40)、甲醇-水(70∶30)、甲
醇-水(60∶45)几个系统 ,以甲醇 -水(60∶45)系统分离效果最
优 , 各拆方组桂皮醛的理论塔板数均大于 4 000;而检测波长选择
试用了 285, 300, 310nm3个波长 ,以 310 nm时峰形最好 ,出峰时
间在 12min左右。
实验结果显示肾气丸全方(即阴阳双补组-2)水煎液中桂皮
醛含量高于桂枝 、附子与 “三泻”(茯苓 、泽泻 、丹皮)配伍组(即补
阳组-2), 其次桂枝 、附子与 “三补”(干地黄 、山茱萸 、山药)的配
伍组(即阴阳双补组-1)水煎液中的桂皮醛含量高于桂枝 、附子配
伍组(即补阳组-1), 且具有统计学意义 , 说明配伍了补阴药———
干地黄 、山茱萸 、山药有助于桂皮醛在水煎液中的溶出。而补阳
组-2含量高于补阳组-1、阴阳双补组-2含量高于阴阳双补组-1,
且有统计学意义 , 则说明无论是纯补阳组还是阴阳双补组 , 加用
“三泻”(茯苓 、泽泻 、丹皮)后桂皮醛含量增高 , 茯苓 、泽泻 、丹皮
亦有助于桂皮醛在水煎液中的溶出。即阴阳双补组水煎液中桂
皮醛的含量高于纯补阳组 ,且 “三泻”有增强此作用的趋势。
对肾阳虚证的现代研究表明 [ 1] , 肾阳虚证具有下丘脑 -垂
体 -肾上腺皮质轴不同环节(层次)、不同程度的功能紊乱 ,肾阳
虚证与神经内分泌免疫网络有内在联系 ,补肾药是调节下丘脑 、
神经内分泌免疫网络 、下丘脑 -垂体 -肾上腺 -胸腺轴的有效手
段。生理条件下 , 下丘脑产生的促肾上腺皮质释放激素经垂体门
脉系统到达垂体 , 促进垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)分泌 , 垂
体分泌的 ACTH进入血液 ,作用于肾上腺皮质细胞 , 促使其分泌
皮质醇 ,而血浆皮质醇又可以反馈抑制 CRH和 ACTH的分泌。
外源性糖皮质激素氢化可的松能明显降低血液中皮质醇 、ACTH
的含量 , 使肾上腺皮质分泌类固醇激素的释放减少 ,从而使大鼠
表现出一系列的肾阳虚症状。
桂皮醛是桂枝中的有效成分之一。有研究表明 [ 2]桂皮醛进
入循环系统后 ,到达肾上腺 , 促使肾上腺释放儿茶酚胺 ,从而提高
血浆中儿茶酚胺的浓度。而儿茶酚胺对许多激素的分泌有促进
作用 , 如 ACTH、胰高血糖素 、生长素 、甲状腺素 、肾素等。而增加
肾阳虚大鼠血中 ACTH的含量 ,则可明显改善肾阳虚证症状。
中医学认为阴阳相互依存 , 互为根本 , “孤阴不生 , 独阳不
长” 。 《医贯·阴阳论》曰:“阴阳又各互为其根 , 阳根于阴 , 阴根
于阳;无阳则阴无以生 , 无阴则阳无以化” 。肾阳虚证若单用大
量的温补肾阳的药物反致虚不受补且有助热之弊 ,若在滋阴补肾
的基础上加入少量温阳的药物 , 使阳得阴之助而生化有源 , 以达
阴中求阳之效。肾气丸是 “阴中求阳”配伍的代表方剂 , 方中大
量滋阴补肾药配以少量温阳的桂枝 、附子 , 在于温通阳气 ,使温阳
而有生化之源 , 滋阴药得温阳药相助则滋而不腻 ,微微生火 , “少
火生气 ”,以鼓舞肾中真阳。
综上所述 ,桂皮醛进入机体后通过作用于肾上腺 ,促使其释
放儿茶酚胺 , 使血浆中儿茶酚胺的浓度增高 , 间接促进血中
ACTH含量增加来改善肾阳虚证 , 结合本实验结果 , 以 “阴中求
阳”的肾气丸全方组水煎液中桂皮醛的含量最高 , 高于补阳组。
实验结果提示肾气丸 “阴中求阳”的配伍可能是通过桂皮醛提高
血浆中儿茶酚胺的浓度来调节神经内分泌以治疗肾阳虚证 ,桂皮
醛可能是肾气丸 “阴中求阳”的配伍在治疗肾阳虚证中的有效成
分之一 。
参考文献:
[ 1 ] 　沈自尹.从肾本质研究到证本质研究的思考与实践 [ J] .上海中医
药杂志 , 2000, 34(4):4.
[ 2 ] 　HaradaM, HirayamaY, YamazakiR.PharmacologicalstudiesonChi-
nesecinnamon.V.Catecholaminereleasingefectofcinnamaldehydein
dogs[ J] .JPharmacobiodyn, 1982, 5(8):539.
收稿日期:2008-08-27;　修订日期:2008-10-14
基金项目:美国波特兰市俄勒岗州健康科学大学资助项目(No.303205)
作者简介:梁永红(1964-),女(壮族),广西容县人 ,现任广西医科大学药学院副教授 ,学士学位 ,主要从事天然产物化学成分与活性研究工作.
岩黄连生物总碱对肝纤维化大鼠
TGF-β1及 MMP-9的影响
梁永红1 ,贾　杰 1 , PeterS.Spencer2 ,毛宇昂 1 ,覃崇举 3
(1.广西医科大学药学院 ,广西 南宁　530021;　2.美国波特兰市俄勒岗州健康科学大学职业与环境
毒理学研究中心;　3.广西河丰药业有限公司 ,广西 东兰　547400)
摘要:目的 观察岩黄连生物总碱对肝纤维化大鼠 TGF-β 1及 MMP-9表达的影响 , 并探讨其抗纤维化的可能机制。方
法 Wistar大鼠 80只随机分为 6组 , 除正常组外其他各组首次皮下注射 50% CCl4 5ml· kg-1 ,以后每 3天注射 1次 30%
CCl4 3 ml· kg-1。正常组给予等体积花生油 , 持续 12周 , 给药自造模之日开始。结果 CCl4所致慢性肝纤维化大鼠有明
显的肝损伤及慢性肝纤维化的表现。与模型组相比 ,岩黄连生物总碱三个剂量组能不同程度改善肝功能指标;肝组织中
Hyp含量较模型组明显降低;病理组织学检查表明其肝脏病变程度较模型组明显减轻;肝组织中 TGF-β 1, MMP-9的表
达较模型组明显下降。结论 岩黄连生物总碱对慢性肝纤维化大鼠具有肝保护作用及抗肝纤维化作用 , 可能通过抑制
TGF-β 1和 MMP-9表达而促进肝纤维化的逆转。
关键词:岩黄连生物总碱;　四氯化碳;　肝纤维化
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2008)11-2620-03
·2620·
时珍国医国药 2008年第 19卷第 11期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.11　
ProtectiveEffectofCorydalissaxicolaAlkaloids(CSA)onLevelofTGF-β 1, MMP-9
inRatswithLiverFibrosis
LIANGYong-hong1 ,JIAJie1 ,PeterS.Spencer2 ,MAOYu-ang1 , QINCong-ju3
(1.GuangxiMedicalUniversity, Nanning530021, China;2.CenterforResearchonOccupational＆Environ-
mentalToxicologyOregonHealth＆ScienceUniversityPortland, Oregon, USA;3.GuangxiHefengPharmaceu-
tical, Co.Ltd., Donglan547400, China)
Abstract:ObjectiveToobservetheeffectsofCorydalissaxicolaalkaloids(CSA)onthelevelsofTGF-β 1, MMP-9 inthe
liversofratswithhepaticfibrosis.MethodsHepaticfibrosiswasinducedbyhypodemicinjectionof40% CCl4(5ml· kg-1 for
thefirsttime, 3ml· kg-1 every3 days).ResultsObviousliverdamageandchronicfibrosiswereobservedintheratsafterthein-
jectionofCCl
4
.TheparametersreflectingliverfunctionwereimprovedinthethreegroupsadministeredwithvariousdoseofCSA;
thehydroxyprolineintheliverwasobviouslydeclined;thehistopathologicalimprovementintheliverdamagedbyCCl4 wasa-
chievedinCSA-treatedgroups;levelsofTGF-β 1andMMP-9 intheCSA-treatedgroupsweresignificantlylowerthanthose
intheliverfibrosisgroup.ConclusionCSAisefficientforthetreatmentofhepaticfibrosis.Themechanismspossiblyinvolvethe
inhibitionofTGF-β 1 andMMP-9.
Keywords:CSA;　CCl4;　Hepaticfibrosis
　　肝纤维化是各种慢性肝脏疾病向肝硬化发展的必经阶段。
阻断肝纤维化的发生和发展 ,对防治肝硬化和慢性肝病具有重要
意义。我国是病毒性肝炎的高发区 , 目前肝纤维化的发病率呈上
升趋势 , 严重危害人们健康。将肝脏病变终止于纤维化阶段或逆
转之 , 是当前医学界关注的热点之一。 岩黄连是一种纯中药制
剂 , 实验研究已表明其对甲 、乙 、丙型肝炎病毒均有不同程度的抑
制和杀灭作用。本实验旨在观察岩黄连生物总碱对 CCl4所致大
鼠慢性肝纤维化的肝保护作用及抗纤维化作用 ,并初步探讨其作
用机制。
1　材料
1.1 　动物 Wistar大鼠 , 清洁级 , 体重 180 ～ 220g, 雌雄各半 ,购
于广西医科大学实验动物中心。
1.2 　药品与试剂 岩黄连生物总碱为广西药材岩黄连醇提取
生物总碱 , 本实验室提供。四氯化碳 ,重庆川江化学试剂厂;联苯
双酯 , 北京协和药厂;ALT, AST, TP, ALB, MDA, SOD, Hyp试剂
盒 , 南京建成生物工程研究所;TGF-β 1, MMP-9免疫组化染色
试剂盒 , 北京中杉生物工程有限公司。
2　方法
2.1 　动物分组及处理 Wistar大鼠 80只 , 称重后随机分为 6
组 , 正常对照组 10只 , 模型组 、联苯双酯组(150 mg· kg-1)、CSA
高剂量组(100 mg· kg-1)、CSA中剂量组(75 mg· kg-1)、CSA
低剂量组(50mg· kg-1)各 14只。首次按 5 ml· kg-1给与大鼠
大腿内侧及背部皮下注射 50%CCl4 , 以后按 30% CCl4 3 ml·
kg-1 ,每周 2次 ,连续 12周 ,制备肝纤维化模型 [ 1, 2] 。空白组用等
体积花生油。造模同时 CSA各剂量组及联苯双酯组每日灌胃给
药 , 空白组和模型组则每日给与等体积生理盐水灌胃。
2.2　生化指标观察 各组于末次给药后 24 h, 拔眼球取血 ,分离
血清 , 按试剂盒说明 进行 ALT, AST, TP, ALB等各项指标的测
定 , 取出部分肝组织加冷生理盐水制成 10%肝组织匀浆 , 按试剂
盒说明进行 MDA, SOD, Hyp指标的测定。
2.3　肝组织病理学观察 末次给药 24 h后处死大鼠 , 取肝大叶
相同部位的一小块肝组织固定于 10%甲醛溶液 , 常规脱水 , 石蜡
包埋 , 制作组织切片 , HE染色 ,普通光镜下观察。
2.4　免疫组织化学观查 取出肝组织用 10%甲醛溶液固定 ,石
蜡包埋 , 切片机切片 ,按照试剂盒说明进行免疫组化染色 ,普通光
镜观察。免疫组化染色以汇管区 、中央静脉及细胞浆膜或间质有
棕黄色颗粒或线状条索状沉积为阳性。免疫组化图像分析:每张
切片随机选 5个视野 , 利用病理图像分析软件(RGB)计算其灰
度值 , 取其平均值 ,并加以统计学分析。
2.5　统计学分析 数据以 x±s表示 , 采用 SPSS12.0进行统计
学分析 ,组间比较采用 t检验 , P<0.05说明差异具有显著性。
3　结果
3.1　一般状况 纤维化模型组大鼠毛色暗淡 、精神萎靡 ,进食进
水减少 ,易受惊 , 体重增长缓慢。处死后取肝组织可见模型组肝
脏表面粗糙有结节 ,颜色灰暗 , 用手触摸感觉发硬 ,治疗组大鼠毛
色较好 ,食欲尚可 , 肝组织损害较模型组轻 ,肝脏质地软 , 表面较
光滑。
3.2　CSA对慢性肝纤维化大鼠血清 ALT, AST, TP, ALB的影响
与正常组相比 ,模型组的 ALT、AST明显升高 , TP, ALB明显降低 ,
P<0.01;与模型组相比 , 联苯双酯组和 CSA高 、中剂量组的
ALT, AST明显降低 , TP, ALB明显升高 , P<0.01;CSA低剂量组
与模型组相比 , P<0.05。
表 1　CSA对 CCl4所致大鼠慢性肝纤维化血清中
ALT, AST, TP, ALB的影响( x±s)
组别 n ALT/U· L-1
AST
/U· L-1
TP
/g· L-1
ALB
/g· L-1
正常对照 10 52.31±11.00 91.55±9.53 95.37±11.70 42.32±5.36
模型对照 14 275.71±35.13a225.10±34.14a76.47±9.70a 32.15±5.64a
联苯双酯 14 190.35±30.27b194.27±31.33b80.63±9.97b 39.27±3.25bCSA高剂量 14 203.43±34.55b196.65±40.48b79.11±7.57b 38.91±4.11bCSA中剂量 14 226.69±38.46b209.28±43.50b77.86±10.34b 37.78±4.98bCSA低剂量 14 247.82±41.21c213.91±37.92c75.37±7.03c 35.77±3.73c
　　与正常对照组比较 aP<0.01;与模型组比较 bP<0.01, cP<0.05
3.3　CSA对慢性肝纤维化大鼠肝组织 MDA, SOD, Hyp的影响
与正常对照组相比 ,模型组 MDA, Hyp明显升高 , SOD明显降低 ,
P<0.01;与模型组比较 , 联苯双酯组和 CSA高 、中剂量组 MDA、
Hyp明显降低 , SOD明显升高 , P<0.01;CSA低剂量组与模型组
比较 , P<0.05。
表 2　CSA对 CCl4所致大鼠慢性肝纤维化肝组织中
MDA、SOD、Hyp的影响( x±s)
组别 n MDA/nmol· mg-1 SOD/U· mg-1 Hyp/μg·g-1
正常对照 10 6.13±1.13 343.37±31.16 93.3±40.6
模型对照 14 11.71±6.40a 235.16±55.10a 350.2±27.9a
联苯双酯 14 7.66±1.86b 275.81±39.05b 234.0±18.5bCSA高剂量 14 8.06±2.06b 277.50±38.90b 241.3±42.5b
CSA中剂量 14 8.76±1.79b 263.67±35.57b 257.7±32.7b
CSA低剂量 14 9.11±1.53c 256.47±32.00 279.5±35.8c
　　与正常对照组比较 aP<0.01;与模型组比较 bP<0.01, cP<0.05
3.4　CSA对慢性肝纤维化大鼠肝组织病理学的影响 正常对照
组肝小叶及汇管区结构正常 ,肝细胞呈条索状以肝小叶中央静脉
·2621·
LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.11 时珍国医国药 2008年第 19卷第 11期
为中心向周围呈放射状排列 , 未见纤维化或变性 、坏死;模型组大
鼠肝组织正常结构被破坏 , 肝索排列紊乱 , 肝细胞肿胀变性 ,其中
多为脂肪变 , 部分呈气球样变 ,窦旁细胞增生明显 ,胶原纤维大量
增生 , 呈较宽的条索状分割肝小叶 , 弥漫分布 , 形成假小叶 , 有炎
性细胞浸润;经 CSA治疗各组病变程度较模型组轻 ,窦旁细胞轻
度增生 , 纤维间隔略细 ,假小叶形成有所减少 ,汇管区及纤维间隔
中有少量慢性炎细胞浸润;联苯双酯组病变程度较模型组明显减
轻 , 纤维间隔细 ,假小叶形成减少。
3.5　CSA对慢性肝纤维化大鼠 TGF-β 1、MMP-9的影响 与正
常对照组比较 ,模型组 TGF-β 1、MMP-9表达量均明显升高 , P
<0.01;与模型组比较 , 联苯双酯组两者表达量明显降低 , P<
0.01;CSA高剂量组与模型组相比 TGF-β 1、MMP-9的表达量
也降低 , 分别为 P<0.01和 P<0.05;CSA中剂量组与模型组相
比两者表达均降低 , P<0.05;CSA低剂量组与模型组比较无统
计学意义。
表 3　CSA对肝纤维化肝组织 TGF-β 1、MMP-9水平的影响( x±s)
组别 n TGF-β 1 MMP-9
正常对照 10 149.86±62.59 123.80±30.06
模型对照 14 170.19±62.97a 157.27±63.59a
联苯双酯 14 164.23±56.87b 154.80±20.19b
CSA高剂量 14 164.73±65.31b 153.60±57.85c
CSA中剂量 14 166.23±56.87c 155.65±59.25c
CSA低剂量 14 169.71±64.17 158.59±66.62
　　与正常对照组比较 aP<0.01;与模型组比较 bP<0.01, cP<0.05
4　讨论
肝纤维化是肝硬化的早期阶段。肝纤维结缔组织异常增生 ,
纤维化的发生与肝细胞坏死 、间质炎症反应及肝细胞的再生缺陷
有关 [ 3, 4] 。四氯化碳是目前诱导肝纤维化的常用化学毒物 , 其机
制与脂质过氧化有关 ,致细胞损伤达一定程度后引起肝内胶原纤
维增多 , 随病程进展而迁延 ,从而形成肝纤维化 [ 5]。
肝脏是人体含酶量最丰富的脏器。在肝脏有实质性损伤时 ,
有些酶可从受损肝细胞内大量逸出 ,使这些酶在血清中的活性升
高 , 因此检测血清中某些酶的活性可灵敏地反映肝细胞受损的程
度。本实验表明 , CSA给药组能明显降低肝纤维化所引起的
ALT、AST活性的升高。病理组织学检查也显示了 CSA3个剂量
组肝细胞炎性浸润较模型组明显减轻 , 肝细胞变性和坏死减少 ,
表明 CSA可改善肝功能 ,具有一定的保肝降酶作用。
肝脏是人体蛋白质代谢的主要器官。当肝功能受损时 ,蛋白
便会减少。因此 , 测定血清蛋白含量 , 可了解肝脏对蛋白质的代
谢 , 有助于诊断和判断预后。本实验 CSA各剂量组能升高纤维
化引起的 TP及 ALB含量的减少 ,说明 CSA可能能够干预肝脏蛋
白质的合成过程。
MDA是脂质过氧化的最终产物 , 它可使蛋白质 、核酸及脂类
发生交联 , 致生物膜发生变性 , 细胞突变 、衰老或死亡。 SOD是
超氧阴离子自由基的清除剂 ,可抑制由自由基启动的脂质过氧化
反应。这两个是反映脂质过氧化的敏感指标 ,还可间接反映出细
胞损伤的程度。本实验中 CSA给药组能降低肝纤维化大鼠肝组
织中 MDA含量 ,升高 SOD含量 , 提示 CSA的保护机制可能与抗
过氧化有关。
体内胶原蛋白代谢与肝纤维化密切相关 ,而血清游离羟脯氨
酸(Hyp)是体内胶原特有的代谢产物。由于胶原纤维化时使所
合成的胶原纤维最后都能沉积在肝内 , 特别是活动性肝纤维化
时 , 胶原合成 、降解的速度均加快 , 导致血清 Hyp升高 , 故血清
Hyp水平可间接反映体内胶原代谢情况。在本研究中 , 模型组大
鼠肝组织匀浆中 Hyp含量明显升高 , CSA各组肝组织匀浆中 Hyp
含量较模型组明显减少 ,说明在纤维化过程中 , 肝组织胶原含量
增加 , 而应用 CSA后胶原沉积减少。
TGF-β 1与 MMP-9均是肝纤维化的重要调控因素。 MMP
-9又称明胶酶 B, 主要作用于Ⅴ型胶原 , 对肝内基底膜结构的
降解及在肝纤维化的发生过程中发挥着重要作用。 TGF-β 1是
目前研究最深入的与肝脏疾病密切相关的细胞因子 ,是调控肝纤
维化发生发展的核心物质 [ 6] 。该物质主要由活化的 HSC分泌并
激活 , 而 TGF-β 1又可促进 、维持 HSC的活化。 研究发现 , 在
MMPs的活化过程中 , TGF-β 1发挥重要调节作用 , 它通过调节
基质金属酶的产生和活性来干扰细胞外基质的代谢 [ 7] 。本实验
表明 , 模型组 TGF-β 1和 MMP-9表达明显高于正常组 ,而 CSA
用药后各组的 TGF-β 1表达均有不同程度的下降 , 提示 CSA在
肝纤维化形成过程中可能参与了 ECM的降解作用。
综上所述 , CSA能明显改善 CCl4 引起的慢性肝纤维化大鼠
的肝功能指标 ,免疫组化结果显示 CSA能降低肝组织中 TGF-
β 1与 MMP-9的表达 ,说明 CSA具有抗纤维化的功能 , 其作用
机制可能是:①抗过氧化脂质;②减少胶原沉积;③抑制 HSC活
化 , 降解 ECM。本实验仅仅对 CSA抗纤维化作了初步探讨 ,其详
细机制有待于进一步研究。
参考文献:
[ 1 ] 　陈　奇.中药药理研究方法学 [ M] .北京:人民卫生出版社 ,
1993:724.
[ 2 ] 　徐叔云 ,卞如濂 ,陈　修.药理实验方法学 ,第 3版 [ M] .北京:人民
卫生出版社 , 2002:1346.
[ 3 ] 　赵敏崎 ,韩得伍 ,马学惠 ,等.甘草酸 、甘草次酸与柴胡皂甙对防治
大鼠实验性肝硬化的作用 [ J].药学学报 , 1983, 18(5):325.
[ 4 ] 　于建国 ,白　薇 ,刘福义.肝纤维化与肝硬化 [ J] .临床军医杂志 ,
2004, 32(1):102.
[ 5 ] 　武忠弼.病理学 ,第 3版 [ M].北京:人民卫生出版社 , 1991:325.
[ 6 ] 　KinnmanN, AndersonU, HulterantzR.Insituexpressionoftransfor-
minggrowthfactor-betal-3, latenttransforminggrowthfactor-beta
bindingproteinandtumornecrosisfactor-alphainlivertissuefrompa-
tientswithchronichepatitisC[ J] .ScandJGastroenterol 2000;
35:1294.
[ 7 ] 　SatoM, ShegogueD, GoreEA, SmithEA, McDermotPJ, Trojanowska
M.Roleofp38MAPKintransforminggrowthfactorbetastimulationof
colagenproductionbysclerodermaandhealthydermalfibroblasts[ J] .J
InvestDermalol2002;118:704.
·2622·
时珍国医国药 2008年第 19卷第 11期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.11