全 文 ：苜蓿根瘤菌对多氯联苯降解转化特性研究
徐莉 , 滕应 , 骆永明＊ , 李振高
(中国科学院南京土壤研究所土壤环境与污染修复重点实验室 ,南京　210008)
摘要:采用溶液摇瓶实验研究了苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)对三氯代联苯(2 , 4 , 4′-trichlorobiphenyl)单体以及 18 种多氯联苯
(polychlorinated biphenyls , PCBs)混合物的降解转化能力.结果表明 , 接入苜蓿根瘤菌转化 7d 后 ,随着溶液中底物 2 , 4 , 4′-TCB 浓
度的增加 ,该菌株对其的降解能力也逐渐提高 , 在 1.0、 5.0、 10.0 、 25.0 、 50.0 mg·L-1浓度条件下该菌对 2 , 4 , 4′-TCB 的降解率
分别为34.0%、 48.3%、69.7%、 96.0%、98.5%, 并且通过气相质谱分析 ,发现溶液中出现了一些新的代谢产物.同时 , 苜蓿根
瘤菌对不同浓度下 18 种 PCBs 同系物混合物的降解能力 , 随着底物浓度的升高呈现出从低到高 , 然后降低 , 并趋于平衡的趋
势 ,其最高降解率可达 54.7%,并存在高氯代 PCBs 向低氯代 PCBs的转化过程.
关键词:苜蓿根瘤菌;多氯联苯;微生物降解;生物转化
中图分类号:X172　文献标识码:A　文章编号:0250-3301(2010)01-0255-05
收稿日期:2008-09-05;修订日期:2009-06-15
基金项目:国家自然科学基金项目(40621001, 40701080);国家重点
基础研究发展规划(973)项目(2002CB410809);中国科学院
知识创新工程项目(KZCX2-YW-404)
作者简介:徐莉(1981～ ),女 ,博士 ,主要研究方向为土壤环境微生物
生态及其生物修复, E-mail:xuli602@126.com
＊通讯联系人 , E-mai l:ymluo@issas.ac.cn
Effects of Rhizobium meliloti on PCBs Degradation and Transformation in Solution
Culture
XU Li , TENG Ying , LUO Yong-ming , LI Zhen-gao
(Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation , Institute of Soil Science , Chinese Academy of Sciences , Nanjing 210008 ,
China)
Abstract:The capability of Rhizobium meliloti on degrading 2 , 4 , 4′-trichlorobiphenyl and 18 kinds of polychlorinated biphenyl congener
mixtures was studied by shaking flask experiment.The results showed that the degradation capability of Rhizobium meliloti to 2 , 4 , 4′-
trichlorobiphenyl increased gradually with the increasing concentration of 2 , 4 , 4′-trichlorobiphenyl.After 7 days , the degradation rates of
2 , 4 , 4′-trichlorobiphenyl under 1.0 , 5.0 10.0 , 25.0 , 50.0 mg·L-1 concentration of 2 , 4 , 4′-trichlorobiphrnyl were 34.0%, 48.3%,
69.7%, 96.0%, 98.5% respectively.Meanwhile some new intermediate products were found in the solution culture.The capability of
Rhizobium meliloti on degrading 18 kinds of polychlorinated biphenyls congener mixtures appeared in a trend from low to high , then decreased
to a certain balance with the increasing concentration of the mixture.The highest degradation rate was 54.7%, and moreover , a transformation
process from higher chlorinated PCBs congeners to lower chlorinated PCBs congeners emerged.
Key words:Rhizobium meliloti;poly chlorinated biphenyls;microbial degradation;biotransformation
　　多氯联苯(polychlorinated biphenyls ,PCBs)是国
际上关注的持久性有机污染物之一 ,它的微生物降
解及其在土壤中的消减行为成为研发 PCBs污染土
壤生物修复技术的关键环节[ 1 , 2] .自从 1973 年
Ahmed和 Focht筛选出 2株能降解卤代联苯的无色
杆菌(Achromobacter)以来 ,至今已分离出多株种能够
降解 PCBs的细菌菌株.其中根瘤菌作为一种特殊菌
种 ,在环境中具有 2种存在状态 ,即游离态和共生
态 ,引起了广大研究者的兴趣[ 3 , 4] .Damaj等[ 5] 发现 ,
游离态的根瘤菌能够耐受并且转化 PCBs.随后
Mehmannavaz等[ 6] 发现与紫花苜蓿共生状态下的根
瘤菌可以在一定程度下促进植物对 PCBs污染土壤
的修复.最近 ,本课题组的研究也发现接种苜蓿根瘤
菌(Rhizobium meliloti)不仅能够促进紫花苜蓿的生
长 ,而且显著促进紫花苜蓿对土壤 PCBs污染的修
复 ,同时在植物的根瘤中积累了高浓度的 PCBs[ 7 , 8] .
那么 ,苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)本身是否可以
降解 PCBs ,其降解途径如何等 ,这些都几乎没有相
关报道 ,亟待进一步的研究.由于细菌通常对低氯代
PCBs 同系 物具有 较好 的降 解能 力 , 特 别是
Komancova等[ 9] 已提出了关于假单胞菌对低氯代
2 ,4 ,4′-trichlorobiphenyl(2 , 4 , 4′-TCB)单体存在的可
能转化途径.鉴于此 , 本实验拟以苜蓿根瘤菌
(Rhizobium meliloti)作为供试菌株 ,采用液体摇瓶转
化实验来研究该菌株对低氯代 PCBs ,即 2 , 4 ,4′-TCB
单体以及18种包括从二氯到十氯代的 PCBs混合物
的降解能力 ,并初步探讨其对 PCBs转化的可能过
程 ,以期为进一步研发 PCBs污染土壤的根瘤菌修复
第 31 卷第 1期
2010 年1 月 环　　境　　科　　学ENVIRONMENTAL SCIENCE
Vol.31 , No.1
Jan., 2010
DOI :10.13227/j.hjkx.2010.01.037
及其与植物联合修复技术提供科学依据.
1　材料与方法
1.1　苜蓿根瘤菌的发酵培养
供试菌株:苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti), 由
中国农业科学院提供.甘露醇酵母汁琼脂培养基
(YMA)组成:甘露醇 10.0 g ,磷酸氢二钾 (K2HPO4)
0.5 g ,硫酸镁 (MgSO4·7H2O)0.2 g ,氯化钠 (NaCl)
0.1 g ,酵母汁(1%)100 mL ,碳酸钙 (CaCO 3)3.0 g ,
蒸馏水 900 mL ,固体培养基中加入 18.0 g·L-1琼脂
粉.先将菌种接种于 YMA固体平板上 28℃活化 24
h ,后接入 50 mL YMA液体种子培养基中扩大培养 ,
然后以 1%的接种量再次转接到 50 mL YMA液体培
养基中28℃,200 r·min-1培养 48 h.
1.2　PCBs的苜蓿根瘤菌转化实验
将上述发酵培养的苜蓿根瘤菌悬液离心 ,收集
菌体 ,用 pH 7.0的 0.05 mol·L-1磷酸缓冲液洗涤 2
次 ,然后转入同体积的不同浓度PCBs的无机盐培养
基中 ,28℃,200 r·min-1转化 7 d ,以接入灭活菌液处
理为对照.
转化液由无机盐培养基添加 PCBs组分制成 ,分
为2组 ,一组是以2 ,4 ,4′-TCB为唯一碳源 ,设计5个
浓度梯度 ,1.0 、 5.0 、10.0 、25.0 、50.0 mg·L-1;另一
组是以 18种 PCBs的混合物作为碳源 ,也设计 5 个
浓度梯度(按照每个单体的浓度),0.1 、0.2 、0.5 、1 、
2 mg·L-1 , 总浓度梯度为 1.8 、 3.6 、 9 、 18 、 36
mg·L-1.
无机盐培养基配方为:KH2PO4 3.7g , K2HPO 4·
3H2O 5.2g ,NH4Cl 1.0 g , Na2SO4 1.0 g ,MgSO4·7H2O
0.2 g ,微量金属盐溶液 1mL ,补水至 1000 mL.
微量金属盐溶液(去离子水 1000 mL):FeCl2·
4H2O 0.3 g , CoCl2·6H2O 0.038 g , MnCl2·4H2O 0.02
g ,ZnCl2 0.014 g ,H3BO3 0.0124 g ,Na2MoO4·2H2O 0.04
g ,CuCl2·2H2O 0.0034 g.
标准 PCBs 混合样品(PCB8 、 18 、 28 、 52 、 44 、
66 、 101 、 77 、 118 、 153 、 138 、 126 、 128 、 180 、 200 、
170 、206 、 209)和 2 , 4 ,4′-TCB 标准样品均购自北京
百灵威化学技术有限公司.
1.3　转化液中 PCBs的提取和测定
苜蓿根瘤菌对 PCBs转化后 ,采用等体积(50
mL)的乙酸乙酯萃取 3次 ,加入无水Na2SO4 脱水 ,后
旋转蒸发至干 ,以正己烷定容 ,待测.其中乙酸乙酯 、
正己烷均为色谱纯.采用带有电子俘获检测器和自
动进样器的 Varian 3800 型气相色谱仪分析.色谱
柱:CP-sil 24CB(30 m×0.25 mm×0.25 mm),进样温
度为260℃,检测器温度为 300℃.程序升温:初始温
度为120℃,0.5 min ,10 ℃·min-1梯度升温至 180℃,
持续 1 min ,然后 15 ℃·min-1梯度升温至 250℃,持
续 25 min.无分流进样 1 μL ,载气为高纯氮 ,流速为
1.0 mL·min-1 ,用外标法进行测定.
1.4　2 ,4 ,4′-TCB转化产物的GC MS 分析
将上述提取浓缩的样品用于 GC MS 分析 ,使用
TraceGC PolarisQ气相色谱 质谱联用仪 ,色谱柱为
DB-5MS ,程序升温:80℃保持 2.0 min , 8.0 ℃·min-1
升至160℃,4.0 ℃·min-1升至270℃,保持25 min.进
样口温度为 250℃,传输线温度为 270℃,载气为氦
气 ,流速为 1.0 mL·min-1.进样量为 1 μL ,电离源为
EI源 , 离子源温度 250℃, 扫描质量范围为 50 ～
450 u.
1.5　数据处理方法
降解率(%)=(灭菌处理溶液浓度-活菌处理
溶液浓度) 灭菌处理溶液浓度×100%
数据偏差分析以及图形制作均在 Excel 2003中
完成.
2　结果与分析
2.1　苜蓿根瘤菌对溶液体系单体 2 ,4 , 4′-TCB的降
解转化效率
由表1可见 ,接入苜蓿根瘤菌转化 7 d后 ,溶液
中 2 ,4 ,4′-TCB 降解率显著增加 ,与灭菌对照相比 ,
在 1.0 、5.0 、10.0 、25.0 、50.0mg·L-1浓度条件下该
菌对 2 , 4 , 4′-TCB 的降解率分别达到了 34.0%、
48.3%、 69.7%、 96.0%、 98.5%,并且随着底物浓
度的增加 ,苜蓿根瘤菌对其的降解能力逐渐增加.这
与 Cho等[ 10] 的研究结果类似 ,即在低浓度范围内 ,
微生物对PCBs的降解率随其底物浓度的增加而呈
直线增加 ,最后达到平稳.这可能是因为微生物对污
染物的降解过程是一种酶促降解过程 ,底物的浓度
可以影响酶促反应 ,在一定范围内 ,即底物浓度不对
微生物产生毒害作用时 ,底物浓度的增加可以促进
微生物自身降解酶的诱导形成 ,从而提高对底物的
降解效率[ 11] .
苜蓿根瘤菌对单体 2 ,4 ,4′-TCB 降解转化的GC
图谱如图 1所示.从中可知 ,相比于灭菌处理(对
照),活菌处理下 ,底物 2 , 4 ,4′-TCB 的色谱峰大大减
小 ,并且出现一系列小峰 ,这些可能是菌种自身的代
谢产物 ,也有可能是 2 , 4 , 4′-TCB的转化产物 ,因此
256 环　　境　　科　　学 31 卷
　　　　　　 表 1　苜蓿根瘤菌对不同浓度 2 , 4 , 4′-TCB的降解率
Table 1　Degradation rate of 2, 4 , 4′-TCB by Rhizobium melilot i under different concentrations
项目 初始浓度 mg·L -1
1.0 5.0 10.0 25.0 50.0
灭菌对照溶液浓度 0.68±0.06 2.25±0.34 3.65±0.60 7.44±1.10 21.8±2.59
活菌处理溶液浓度 0.45±0.01 1.17±0.76 1.17±0.17 0.30±0.15 0.33±0.17
降解率 % 34.0 48.3 69.7 96.0 98.5
图 1　苜蓿根瘤菌对 2 ,4 , 4′-TCB的转化作用
Fig.1　Transformation of 2, 4 , 4′-TCB by Rhizobium meliloti
本实验采取气相质谱联用的方法进一步对产物结构
进行分析.
2.2　苜蓿根瘤菌对单体 2 ,4 ,4′-TCB的降解产物初
步分析
苜蓿根瘤菌对 2 , 4 ,4′-TCB转化的 GC MS 结果
如图 2所示.从中可以看出 ,灭菌对照的 GC MS 图
谱中 ,除了底物2 ,4 , 4′-TCB(保留时间为 21.02 min)
外 ,还存在一些杂峰 ,这些峰可能是苜蓿根瘤菌的自
身分泌物.经苜蓿根瘤菌转化处理后 ,底物 2 , 4 , 4′-
TCB的质谱峰几乎全部消失 ,同时在质谱图中出现
了一些在灭菌对照图谱中没有的新峰 ,如保留时间
为 36.34 min的峰 ,但与质谱自带的标准谱图库进行
　　　　　　　
图 2　苜蓿根瘤菌对 2 , 4 ,4′-TCB的转化 GC MS图谱
Fig.2　GC MS figure of the transformation of 2 ,4 , 4′-TCB by Rhizobium meli loti
2571 期 徐莉等:苜蓿根瘤菌对多氯联苯降解转化特性研究
比对 ,并没有找到相应的产物结构 ,无法确定是何物
质.同时 , 根据现有文献报道[ 9] 的假单胞菌降解
2 ,4 ,4′-TCB的可能代谢产物 2 , 4-二氯苯甲酸也没有
在本实验转化产物中发现.究其原因 ,一方面可能转
化产物浓度很低 ,并且很可能为羟基化合物 ,而气质
联用对此类物质检测灵敏度较低 ,因而未能测出.另
一方面 ,苜蓿根瘤菌在转化过程中可能伴随自身代
谢分泌物的产生 ,这些杂质未能去除 ,从而影响了产
物的分析.因此 ,如何纯化产物 ,提高产物浓度 ,进而
确定苜蓿根瘤菌代谢 2 ,4 ,4′-TCB的中间产物 ,还有
待在方法学上开展进一步的深入研究.
2.3　苜蓿根瘤菌对 PCBs混合物的降解效果
由表 2 可以看出 ,苜蓿根瘤菌对不同浓度的
PCBs混合物的降解效率总体低于对单体 2 , 4 , 4′-
TCB的降解效率 , 这与 PCBs 混合物中存在难以降
解 、甚至对菌体存在毒性的高氯 PCBs同系物有关.
接入苜蓿根瘤菌培养 7 d后 ,溶液中 18种 PCBs 的
降解率明显增加 , 与灭菌对照相比 ,在 1.8 、 3.6 、
9.0 、18.0 、36.0mg·L-1浓度条件下其降解率分别达
到 23.8%、 38.4%、 54.7%、 41.0%、 48.7%, 呈现
出降解能力随浓度增高 ,然后又有所降低 ,并趋于平
衡的趋势.这与酶促反应的特点相一致.可见 ,苜蓿
根瘤菌对 PCBs 的降解存在浓度效应 , 低浓度的
PCBs可能达不到菌株的反应浓度要求 ,其降解率偏
低 ,随着浓度增加 ,降解率逐渐增加 ,而较高浓度的
PCBs可能会对菌株产生了一定程度的毒害作用 ,从
而抑制根瘤菌对其的降解.
从图 3苜蓿根瘤菌对不同浓度 PCBs同系物的
降解效果可知 ,低氯成分的 PCBs(<6氯)的含量总
体呈现减少的趋势 ,则高氯组分含量增加 ,这符合低
氯 PCBs组分容易被微生物转化 ,而高氯组分不易被
转化的一般规律[ 3 , 12] .此外 , 在 0.5 mg·L-1和 1.0
mg·L-1的浓度下 ,二氯 、三氯的低氯代 PCBs组分的
含量却出现了显著增加 ,推测在苜蓿根瘤菌的转化
过程中可能存在高氯代化合物向低氯代化合物的转
化过程.
表 2　苜蓿根瘤菌对不同浓度 PCBs混合物的降解率
Table 2　Degradation rate of mixed PCBs by Rhizobium meliloti under different concent rations
项目 初始浓度 mg·L -1
1.8 3.6 9.0 18.0 36.0
灭菌对照溶液浓度 0.84±0.14 2.28±0.29 5.08±0.62 11.1±0.25 22.4±1.88
活菌处理溶液浓度 0.64±0.04 1.40±0.94 2.30±0.52 6.55±0.65 11.5±0.34
降解率 % 23.8 38.4 54.7 41.0 48.7
a:转化前 ,b:转化后
图 3　苜蓿根瘤菌转化不同浓度 PCBs同系物的含量变化
Fig.3　Mass f raction of PCBs congeners under transformation
of Rhizobium meliloti
3　结论
(1)苜蓿根瘤菌能够转化降解多种 PCBs ,特别
是低氯的 PCBs同系物.在对 2 , 4 ,4′-TCB的转化过
程中 ,随着底物浓度的增加 ,根瘤菌的降解效率不断
增加 ,最高达到了 98.5%,同时产生一些新的代谢
产物.
(2)菌株在转化 PCBs混合物的过程中 ,其降解
效率随浓度增加逐渐增加 , 最高达到 54.7%,但由
于 PCBs混合物中存在难以转化和毒性较大的高氯
PCBs同系物 ,因而苜蓿根瘤菌对 PCBs混合物的降
解能力要低于 PCBs 单体.苜蓿根瘤菌(Rhizobium
meliloti)对 PCBs降解具有一定的潜力.
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