全 文 ：中国农学通报 第23卷 第9期 2007年 9月
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植物保护科学
基金项目:塔里木大学校长基金硕士项目“ 塔里木棉区棉花秸秆生产燃料酒精的研究”（ TDZKSS07010）。
第一作者简介:张琴，女，1980年出生，四川雅安人，讲师，主要从事苜蓿根瘤菌耐酸和生物质能方面的研究，已发表论文3篇。通信地址：843300新疆
阿拉尔塔里木大学生物技术研究与开发中心，E-mail:jhtabszq@163.com。
收稿日期:2007-06-03，修回日期：2007-07-13。
土壤酸性严重影响了紫花苜蓿的产量和共生固氮
效率，在酸性条件下，多数苜蓿根瘤菌的生长受阻甚至
难以存活，这大大限制了苜蓿的高产、优质。低pH下
根瘤菌的生长与存活对农业生产中豆科植物成功接种
是十分重要的[1]。郭彦军等的研究表明，酸性土壤良好
的结瘤性能可提高生物固氮效率、促进紫花苜蓿生
长[2]。可见接种高效耐酸根瘤菌株是促进苜蓿在酸性
土上有效结瘤固氮的措施。然而，苜蓿根瘤菌一般不耐
六株耐酸苜蓿根瘤菌的筛选及生长特性研究
张 琴,李艳宾
（ 塔里木大学新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆阿拉尔 843300）
摘 要:为获得能够使紫花苜蓿在酸性土壤中高效结瘤的耐酸根瘤菌,该研究从酸性土(pH5.2)上生长
的紫花苜蓿根瘤中分离到若干菌株,利用根瘤菌对酸的适应性耐受反应筛选到六株能够在pH4.8的固
体培养基上稳定生长的菌株,并检测了这六株菌的结瘤特征、不同酸度下的生长曲线和平均代时。结果
表明,六株根瘤菌均能使紫花苜蓿植株结瘤,使其具有较多的结瘤数(≥10个 /株)和较高的结瘤率
(66.67%~100%);不同酸度下,六株根瘤菌呈现不同的生长特性,酸显著降低根瘤菌的生长速率,使其生
长延滞期增长,对数生长期出现滞后,稳定期到达延迟,酸性条件下各根瘤菌的平均代时均较中性条件
下的长,环境pH越低,菌株平均代时越长。然而,在低pH条件下,耐酸根瘤菌在其耐受酸度范围内经
过延长的延滞期后仍然能够较快地生长。
关键词:耐酸;苜蓿根瘤菌;筛选;生长曲线
中图分类号:S144.3 文献标识码:A
IsolationofSixAcid-tolerantRhizobiummelilotiandStudyonitsGrowthCharacteristics
ZhangQin,LiYanbin
(KeylaboratoryofProtectionandUtilizationofBiologicalResourcesinTarimBasinofXinjiang
Production&ConstructionCrops,Tarimuniversity,Alaer843300)
Abstract:Inordertodiscoveracid-tolerantRhizobiummelilotithatcannodulatealfalfahigh-efectively
onacidicsoil,researcheswereexploredtoisolaterhizobiafromalfalfanodulesonacidicsoil(pH5.2),
methodsbasedonthethesisofadaptiveacid-toleranceresponseoftheRhizobiawereadopted,sixstrains
wereisolated,whichcouldgrowonsolidmediumwithpH4.8steadily.Inaddition,thenodulationcharac-
teristics,growthcurvesandmeangenerationtimeunderdiferentacidityofthestrainswereexamined.The
resultsshowedthataltherhizobiacouldnodulatealfalfawithenoughnodules(≥10)andhighnodulation
ratio (about66.67%~100%);underdiferentacidity,therhizobiarepresenteddiferentgrowthcharacteris-
tics,acidslowedstrains’growthratesignificantly,whichmadetherhizobiaexhibitaprolongedlagphase,a
laggedlogphaseandadelayedstationaryphase,themeangenerationtimeunderacidicconditionwas
longerthanthatunderneutralcondition,thelowerthepHwas,muchlongerthemeangenerationtimewas.
However,theacid-tolerantrhizobia,ifexposedtothetolerantacidityrange,couldstilgrowquicklyaftera
prolongedlagphase.
Keywords:Acid-tolerant,Rhizobiummeliloti,Isolation,Growthcurve
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酸，为此，筛选耐酸苜蓿根瘤菌用于接种显得尤为重
要。
从酸性土壤上生长的苜蓿根瘤中分离并筛选耐酸
的根瘤菌株是一条直接而有效的途径。在阿根廷和乌
拉圭的酸性土壤上，已经筛选到一系列中等耐酸的苜
蓿根瘤菌株，这些菌株能在pH5.6下使紫花苜蓿结瘤，
但却使其表现出结瘤延迟、结瘤数减少[3]，其中有 15
株能够在pH5.0下生长并能使苜蓿结瘤，但共生固氮
效率却非常低[4]。与其他革兰氏阴性细菌相似，根瘤菌
在适度的酸性条件下会表现出对酸的适应性耐受反
应[1]，因此，从酸性环境中分离到的较耐酸根瘤菌中再
进行耐酸筛选则可能得到更耐酸的菌株。为此，此研究
开展了大量实验，欲从酸性土壤上生长的苜蓿根瘤中
分离到较耐酸的苜蓿根瘤菌株，并在此基础上获得更
耐酸的菌株。目前已经筛选到六株较耐酸的苜蓿根瘤
菌株，并测定了菌株在酸性条件下的生长特性，为在酸
性土壤上接种高效耐酸根瘤菌提供了理论依据，也为
探讨根瘤菌耐酸机理奠定了基础。
1材料与方法
1.1植物材料
江苏苜蓿：为江苏连云港地方品种，购买自连云港
草业中心；苜蓿“ 露”：为西南大学动科院玉永雄老师所
赠。
1.2采样时间和采样环境
新鲜的苜蓿根瘤于2004年9月15日在西南大学
盆栽场采集获得，其宿主植物紫花苜蓿为西南大学动
科院玉永雄老师栽培于酸性土壤（ 鸡公山森林土，
pH5.2）上的试验植株。
1.3根瘤菌培养基和植物营养液
根瘤菌培养基采用改进的YMA培养基：甘露醇：
10g， 酵 母 浸 粉 ：5g，NaCl：0.1g，MgSO4·7H2O：0.2g，
K2HPO4：0.5g
植物营养液为Fahraeus无氮植物营养液[5]
1.4菌种的分离纯化及耐酸筛选
取新鲜的根瘤洗净，经表面消毒[6]，将根瘤夹破，
于加结晶紫的中性YMA固体培养基上划线分离，挑
取单菌落反复划线分离，肉眼观察比较纯的单菌落，挑
取少量菌体革兰氏染色，置显微镜下镜检。分离纯化的
菌株进行耐酸筛选试验，其筛选流程如下：
pH
7.0→
pH
6.0→
pH
5.5→
pH
5.2
→
pH
5.0
→
pH
4.8
pH7.0的YMA培养基上已经分离纯化的菌株，在
三代内稳定生长以后，保存并接种到pH6.0的YMA
培养基上，反复划线分离，分离纯的菌株稳定生长三代
后保存并接种到pH5.5的培养基上，按照如前所述方
法依次保存菌种并接种到更低pH的培养基上，这样，
在所有pH梯度（ 7.0、6.0、5.5、5.2、5.0、4.8）都有分离纯
的菌株保存备用。
1.5菌株回接实验
表面消毒的种子播种于灭菌的滤纸上 [7]，于
28±1℃下暗培养1d，再于28±1℃，16h的光照下萌发
5~7d，取正常生长5~7d的苜蓿幼苗培养于各处理营
养液中，接种新培养的苜蓿根瘤菌液（ OD600=1），
1000ml营养液中接种10ml根瘤菌液，观察并记录现
瘤日期，培养30d后收获，统计平均每株结瘤数和结瘤
率。
1.6菌株在中性和酸性条件下生长曲线和平均代时的
测定
各菌株经活化后，接种于YMA液体培养基中，置
恒温振荡器中28±1℃下培养，待OD600约为1，分别吸
取100μl菌悬液接入装有10mlYMA液体培养基的大
小相同、口径一致的三角瓶中，置恒温振荡器中
28±1℃下培养。YMA液体培养基事先用 HCl、NaOH
调节pH分别为7.0、6.0、5.5、5.2、5.0、4.8。参照谢福莉[8]
的方法，每隔2h取一瓶菌悬液，用722分光光度计测
定该菌悬液的OD600值，作出相应的曲线，同时测定各
取样时刻的活菌数，选取对数期部分，按照以下公式计
算菌株代时：
G=（ t1-t2)lg2
lgNt2-1gNt1
公式中t1、t2为对数期的两个时间点，Nt1和Nt2为
相应时间的菌数。
2结果与分析
2.1根瘤菌耐酸筛选
从酸性土壤上生长的苜蓿根瘤中分离获得一系列
根瘤菌，其中六株能够在低pH下较快生长，分别命名
为 91511、91512、91521、91522、91531、91532。这六株
根瘤菌镜检结果显示，六株菌均为革兰氏阴性细菌，短
杆状，大小约为1.725~1.875μm×0.49~0.61μm。这六株
根瘤菌均能在pH4.8固体培养基上稳定生长，培养基
pH低于4.8，菌株不能稳定生长或死亡。因此，初步认
为这六株根瘤菌可以在pH≧4.8下正常生长，即对酸
的耐受低限为pH4.8。
将根瘤菌株接种于中性和酸性固体培养基上，发
现菌株在中性培养基上生长较快，在酸性培养基上生
长较慢，培养相同天数（ 5d），菌株在酸性培养基上形成
的菌落直径小于中性培养基上的，随着pH降低，菌落
平均直径减小（ 表1）。
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图1苜蓿根瘤菌回接结瘤率
2.2菌株回接实验
用六株根瘤菌接种江苏苜蓿和苜蓿“ 露”，发现这
六株根瘤菌均能使苜蓿植株结瘤，证明这六株根瘤菌
均为苜蓿根瘤菌。接种这六株根瘤菌，苜蓿植株结瘤数较
多，平均每株结瘤数≧10个，菌株91512促使苜蓿结瘤
的数目最多，而对照为不结瘤或结瘤数极少（ 表2）。
菌株植株
平均每株结瘤数（ 个/株）
江苏苜蓿
苜蓿“ 露”
91532
14.7±1.0
15.0±0.9
91531
13.0±0.5
13.0±0.6
91522
13.5±0.9
14.9±0.5
91521
13.2±1.0
10.0±1.0
91512
17.2±0.3
15.8±0.5
91511
13.3±0.8
13.9±0.9
CK
0
0.5±0.5
表2苜蓿根瘤菌回接平均每株结瘤数
菌株
菌落平均直径（ mm）
7.0
5.2
4.8
91511
8.9
5.4
4.9
91512
9.2
5.8
5.1
91521
9.0
5.6
5.0
91522
9.0
5.7
5.2
91531
8.8
5.5
5.0
91532
9.3
6.2
5.5
从结瘤率（ 图1）来看，CK处理（ 不接种）不结瘤或
结瘤率很低（ 约为11.11%），对两种苜蓿植株来说，六
株根瘤菌促使其结瘤的结瘤率都很高，最低为
66.67%，最高达100%。
2.3菌株在中性和酸性条件下生长曲线和平均代时的
测定
在中性和酸性条件下，每隔2h测定了六株根瘤菌
菌悬液的OD值，构建了58h内苜蓿根瘤菌的生长曲
线（ 图2）。对六株根瘤菌来说，同一测定时刻，中性条
件（ pH7.0、pH6.0）下菌悬液的OD值均高于酸性条件
（ pH5.5、pH5.2、pH5.0、pH4.8）下的。从曲线在菌株各生
长时期（ 延滞期、对数生长期和稳定期）的趋势来看，中
性条件下，苜蓿根瘤菌的延滞期较短，约为4~8h；酸性
条件下，苜蓿根瘤菌延滞期增长，并且，pH越低，延滞
期越长，pH5.2~5.5，约为10~20h；pH5.0，约为20~28h。
pH4.8下，只有菌株91532可以生长，其它的根瘤菌株
OD值变化很小，几乎检测不到生长。从图2还可以看
出，酸性条件下六株根瘤菌生长与中性条件下的相比，
均表现出对数生长期滞后，稳定期延迟，低pH下，对
数生长期比中性条件下的晚出现6~30h不等，稳定期
比中性条件下的晚到达 8~12h不等（ pH4.8除外），
pH4.8下，菌株91532的稳定期约比中性条件的晚到
达38h，可见，培养液pH越低，根瘤菌对数生长期出现
的越晚，稳定期到达也越迟。尽管如此，在pH较低的
培养液中，所有菌株仍会在一定酸度范围内出现一个
较快生长的时期。说明，在低pH条件下，耐酸根瘤菌
在其耐受酸度范围内经过延长的延滞期后仍然能够较
快地生长。通过平板计数，测定了六株根瘤菌在不同
pH下的活菌数，计算出了不同pH下每株菌的平均代
时，如表3所示，酸性条件下各根瘤菌的平均代时均较
中性条件下的长，pH从7.0降到5.0，平均代时约延长
5.6~11.3h，环境pH越低，菌株平均代时越长。
表1不同pH培养基上菌株形成的菌落平均直径
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表3不同pH下菌株生长的平均代时
注：*ND表示在该pH下不能测出代时的（ notdetermined）。
图2苜蓿根瘤菌在中性和酸性条件下的生长曲线
菌株
平均代时（ h）
91511
91512
91521
91522
91531
91532
7.0
4.8
5.1
4.9
5.2
5.1
3.8
6.0
5.3
6.0
5.6
5.2
5.2
3.9
5.5
6.1
7.2
6.0
7.7
7.2
4.7
5.2
10.1
10.7
9.8
11.0
11.7
6.1
5.0
15.0
16.4
15.1
16.1
15.9
9.4
4.8
ND
ND
ND
ND
ND
15.2
3结论与讨论
六株耐酸根瘤菌的筛选获得，证明在一定酸度范
围内通过根瘤菌对酸的适应性耐受反应筛选耐酸菌株
是可行的。筛选到的六株苜蓿根瘤菌均能在pH4.8固
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体培养基上稳定生长，使苜蓿植株有效结瘤并使其具
有较高结瘤率。已有的研究表明，这六株根瘤菌在
pH4.8的环境下仍使植株有较高的固氮酶活性，并且
植株基本生长良好[9]。获得的耐酸菌株由于具有低pH
下稳定生长和使苜蓿植株高效结瘤的性能，将可能作
为有效的接种剂用于酸性条件下苜蓿的接种，也可能
作为模式菌株用于根瘤菌耐酸机理的探讨。
六株苜蓿根瘤菌在不同pH下生长曲线的构建，
平均代时的测定，有效地检测了苜蓿根瘤菌在不同酸
度下的生长特性。平均代时随着pH的降低而增长的
结论与Watkin等[10]的相一致。说明，分离到的苜蓿根
瘤菌株尽管具有一定的耐酸性能，但其生长特性在酸
性和中性条件下的表现是不一致的，为此，进一步探讨
菌株的耐酸机理将十分重要。
参考文献
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（ 责任编辑：李碧鹰）
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