全 文 ：试验研究　 中国食品添加剂ChinaFoodAdditives
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柱层析法分离万寿菊叶黄素
张志强1 , 向正华1 , 代冬海 2 , 邢英 1
(1.青海大学化工学院 , 青海西宁　810016;2.青海普兰特药业有限公司 , 青海西宁　810007)
　　摘　要:本试验研究了万寿菊叶黄素的分离方法及分离条件。采用高效液相色谱法 (HPLC)测定叶黄
素的含量 , 色谱柱为岛津 VP-ODSC18柱 (150mm×4.6mm, 5μm), 检测波长 454nm;以甲醇 -0.1%磷酸溶
液为流动相进行梯度洗脱 , 流速 1.0mL/min;柱温 30℃;进样量 10μL;校准曲线法定量 , 在 0.6 ～ 2.0μg范
围内具有良好的线性关系 , 回归方程为Y=1.16×107C+4.99×104 , 相关系数r=0.9984。采用柱层析法分离
万寿菊叶黄素的皂化液 , 实验结果表明:固定相采用硅胶 G(100 ～ 200目);胡萝卜素洗脱剂为 V(石油醚)
∶V(乙酸乙酯) =5∶1;叶黄素洗脱剂为 V(石油醚)∶V(乙酸乙酯) =1 ∶1;层析柱规格为 Υ26 ×
510mm;使用皂化液直接湿法上样;吸附时间为 30min;上样量为 0.4mL皂化液 /g硅胶;柱温为常温;皂化
液可直接上样;在以上条件下 , 经分离回收溶剂后得到含量为 83.3%的叶黄素产品。该方法有良好的分离能
力 , 便于操作 , 产品纯度稳定。硅胶在重复使用 5次以内 , 对分离效果的影响不明显。
关键词:叶黄素;万寿菊;分离;柱层析
中图分类号:TS202.3　　　文献标识码:A　　　文章编号:1006-2513(2010)03-0051-05
Separationofluteinfrommarigoldbycolumnchromatography
ZHANGZhi-qiang1 , XIANGZheng-hua1 , DAIDong-hai2 , XINGYing1
(1.SchoolofChemicalEngineering, QinghaiUniversity, Xining810016;
2.QinghaiPlateauPharmaceuticalCompanyLimitedXining810007)
Abstract:ThispaperstudiedthemethodandconditionsofseparatingluteinfromMarigold.Highperformanceliquid
chromatography(HPLC)wasappliedtodetermineluteincontent.Theoperatingparameterswere:ShimadzuVP-
ODSC18column(150mm×4.6mm, 5μm), detectionwavelength454nm;methanol-0.1%phosphoricacidasmo-
bilephasegradientelution, flowrate1.0mL/min;columntemperature30℃;injectionvolume10μL.Chromatogram
peakarea(Y)againsttheinjectionmassconcentrations(C)ofluteinwasingoodlinearityintherangeof0.6 ～
2.0μg, regressionequationwasY=1.16×107C+4.99 ×104 , thecorrelationcoeficientr=0.9984.Theresults
showedthat:thestationaryphasewassilicagelG(100 ～ 200mesh);caroteneelutingagentwasV(petroleumether)
∶V(ethylacetate) =5 ∶1;luteinelutingagentwasV(petroleumether)∶V(ethylacetate) =1 ∶1;chromatog-
raphycolumnwasΥ26 ×510mm;saponificationliquidwasuseddirectlyonthewetsample;adsorptiontimewas
30min;samplevolumewas0.4mLsaponificationliquid/gsilicagel;columntemperaturewasroomtemperature;sa-
ponificationsolutionaddeddirectlyonthesample;intheaboveconditions, theseparationandrecoveryofthelutein
was83.3%.Thismethodseparatedoptimally, waseasytooperateandtheproductswerestable.Silicagelwasreused
5 timesandshowednoobviousdifferencesontheseparationeffect.
Keywords:lutein;separation;columnchromatograph;marigold.
收稿日期: 2009-10-17
作者简介:张志强 (1969-), 男 (汉), 副教授 , 本科 , 从事天然产物提取与分离研究。
中国食品添加剂
ChinaFoodAdditives　试验研究
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叶黄素 (lutein)又称植物黄体素 , 分子式为
C40H56O2 , 属四萜类化合物[ 1] 。叶黄素是人类食
物与血清中主要的类胡萝卜素之一 , 并且是 α, β
-类胡萝卜素的代表[ 2, 3] 。研究发现 , 年龄相关
性黄斑退化 (AMD)是发达国家老年人失明以及
普通视觉损害的最重要原因 [ 4 ～ 7] 。叶黄素和玉米
黄质作为抗氧化剂和近紫外蓝光的吸收剂 , 可降
低此类眼疾发生的风险 。随着对叶黄素药理研究
的深入 , 还发现叶黄素在防治心血管动脉硬化 、
增强免疫力等方面起着重要作用 [ 8, 9] 。万寿菊
(Tageteserecta), 菊科万寿菊属 , 原产于墨西哥 。
因其花叶黄素含量高 , 其他种类类胡萝卜素少 ,
而成为生产叶黄素的理想原料 [ 10] 。但是万寿菊中
游离叶黄素很少 , 主要是叶黄素酯(>90%), 其
脂肪酸部分包括月桂酸 、 肉豆蔻酸 、 棕榈酸等十
多种。研究表明 , 叶黄素酯类衍生物不易被人体
直接吸收代谢 , 人类功能性食品添加剂和药品对
游离叶黄素的纯度要求较高 。因此对叶黄素酯类
物质进行皂化 , 并且进一步分离叶黄素十分必
要 [ 11] 。
文献 [ 12] [ 13] 报道了重结晶法分离和纯
化万寿菊叶黄素。虽然得到的叶黄素纯度较高
(﹥ 90%), 但是操作步骤复杂 、收率低 , 只适用
于实验室少量制备。柱层析分离叶黄素的报道很
少 。本文采用柱层析法对万寿菊叶黄素的提取皂
化物进行分离 , 以期为工业生产提供依据 。
1　材料与方法
1.1　材料
万寿菊干花颗粒 , 内蒙古自治区赤峰市鑫卉
公司;叶黄素标准品 (>90%), Sigma-Aldrich
公司。
1.2　试剂与仪器
硅胶 G(100 ～ 200目) (200 ～ 300目), 青
岛海洋化工分厂;硅藻土 、 氧化铝 、 氧化镁 , 上
海建信有限公司试剂厂;甲醇 、 氯仿 、 甲苯 、 磷
酸 、无水乙醇 、 二氯甲烷 、 乙酸乙酯 、 正己烷 、
无水硫酸钠以及石油醚 (30 ～ 60℃)均为分析
纯;甲醇色谱纯 。
高效液相色谱仪 BOSTAV201/330 , 岛津国际
贸易 (上海)有限公司;电子分析天平 AB104-
N, 梅特勒 -托利多仪器 (上海)有限公司;循
环水真空泵 SHI-II, 上海亚荣生化仪器厂;层
析柱 (Υ26mm×510mm)。
1.3　叶黄素的分离
万寿菊干花颗粒经干燥后 , 粉碎过 60目筛 。
所得花粉用 V(无水乙醇)∶V(丙酮) =1 ∶1
混合提取剂提取 , 提取液用 30%KOH-CH3OH
溶液皂化 , 皂化液经调节 pH后用旋转蒸发器回
收溶剂 , 所得浸膏加入少量甲醇溶解 , 并将其转
入棕色容量瓶中定容。称取一定量的吸附剂 , 经
活化后采用干法装柱 。在少量的吸附剂中拌入已
定容的皂化液进行吸附 , 挥干溶剂后置于柱顶 。
负压条件下 , 首先用胡萝卜素洗脱剂洗脱出胡萝
卜素和比其极性小的部分 , 再用叶黄素洗脱剂洗
脱出叶黄素 , 经回收溶剂后得到产品 。
1.4　叶黄素的 HPLC分析
采用岛津 VP-ODSC18柱(150mm×4.6mm,
5μm),检测波长 454nm;以 CH3OH— 0.1%H3PO4
溶液为流动相进行梯度洗脱 ,流速 1.0mL/min;柱
温 30℃;进样量 10μL。校准曲线法定量 ,在 0.6 ～
2.0μg范围内具有良好的线性关系 ,回归方程为 Y
=1.16×107 C+4.99×104 ,相关系数 r=0.9984。
标准品 HPLC图谱见图 1。
2　试验结果与分析
2.1　吸附剂的选择
选用硅胶 G1 (100 ～ 200目)、硅胶 G2 (200
～ 300目)、 m(氧化镁)∶m (硅藻土) =1 ∶1、
m(硅胶 1)∶m(硅藻土) =1 ∶1、 中性氧化铝
等作为固定相。叶黄素 、 胡萝卜素等均为色素 ,
可通过观察柱层析时各色素条带分离状况判断分
离效果。实验结果表明:中性氧化铝对样品的吸
附性较差 , 当用胡萝卜洗脱剂洗脱时 , 所有的色
素均被洗脱下来 , 达不到分离的目的;硅胶 G2
颗粒小 , 洗脱阻力大 、流速慢 、 分离时间过长易
导致叶黄素氧化;m(氧化镁)∶m(硅藻土) =
1 ∶1和 m(硅胶 1)∶m(硅藻土) =1 ∶1分离
过程中整个柱身均充满了色素 , 没有形成明显的
叶黄素和胡萝卜素色素条带 , 不利于分离操作;
使用硅胶 G1作为吸附剂时 , 可观察到柱内颜色
明显分为两部分 , 上段为较深的橙黄色 , 下段为
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较浅的淡黄色 , 分 2级收集洗脱液 。经 HPLC分
析 , 样品的分离效果较好 , 洗脱速度较快 , 洗脱
剂的用量较少 , 因此选用硅胶 G1作为吸附剂较
好 。
2.2　洗脱剂的选择
通过石油醚 、 正己烷 、 甲苯 、 二氯甲烷 、 氯
仿 、 乙酸乙酯 、无水乙醇等溶剂对叶黄素的洗脱
效果的比较发现 , 当溶剂的极性大于二氯甲烷
时 , 叶黄素能够被完全洗脱下来。为了保证分离
效果 , 采用混合洗脱剂 。不同的混合洗脱剂的洗
脱效果见表 1:
图 1　标准品的 HPLC图谱
Fig.1　ChromatogramsofstandardsofbyHPLC
表 1　不同洗脱剂对分离的影响
Table1　Resultsofcolumnchromatographyusingdifferenteluants
序号 洗脱剂体系 胡萝卜素洗脱剂/v/v
叶黄素洗脱剂
/v/v 现　　象
1 正己烷 -丙酮 -无水乙醇 9∶1∶0 8∶1∶1 柱子不能出现明显的色带 , 分离效果较差。
2 二氯甲烷 -氯仿 1∶0 1∶1 在柱子上出现了三条色素带 , 但叶黄素未被分开。
3 正己烷 -无水乙醇 100∶1 ——— 当用胡萝卜素洗脱剂洗脱时 , 叶黄素也被洗下来。
4 石油醚 -乙酸乙酯 5∶1 1∶1 能出现比较好的色素带 , 其洗脱 、 分离叶黄素的效果较好。
由表 1可知 , 石油醚 -乙酸乙酯体系作为洗
脱剂有很好的分离效果 , 能够达到分离的要求 。
同时该洗脱剂具有毒性小 、 价格低廉以及易于回
收等优点 。因此选用 V(石油醚)∶V(乙酸乙
酯) =5 ∶1为胡萝卜素洗脱剂 , 选用 V(石油
醚)∶V(乙酸乙酯) =1∶1为叶黄素洗脱剂 。
2.3　上样方法
柱层析的上样方法主要有湿法上样和干法上
样两种 , 实验比较了干法上样与湿法上样对分离
效果的影响 , 结果见表 2。
由表 2可知 , 经柱层析分离后 , 由湿法上样
得到的叶黄素产品的纯度和收率明显高于干法上
样 。并且在干法上样时 , 胡萝卜素洗脱液中有少
量叶黄素被洗脱下来 , 使得叶黄素的纯度和收率
均有所下降。同时干法上样 , 叶黄素在拌样的过
程中暴露在空气中易被氧化 , 增大了叶黄素的损
失。
表 2　上样方法对分离的影响
Table2　Effectofdifferentthemethod
ofloadonseparation
上样方法
湿法 干法
1 2 1 2
叶黄素纯度 /% 83.63 82.66 66.33 67.33
叶黄素收率 /% 88.43 86.22 70.32 73.66
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2.4　吸附时间对分离的影响
采用湿法上样 , 样品与吸附剂的接触时间较
短 , 如果吸附剂没有将样品完全吸附上 , 在洗脱
胡萝卜素部分时将会导致叶黄素也被洗脱下来 ,
这样将影响叶黄素的收率。在上样后 , 选择吸附
时间分别为 10、 30、 60、 120min时 , 比较吸附和
分离效果。实验结果表明:当吸附时间为 30min
时 , 在洗脱胡萝卜素部分时不会使叶黄素洗脱下
来 , 因此吸附时间选为 30min。
2.5　上样量对分离的影响
上样量少使得吸附剂未能充分利用 , 过多的
上样量又会造成色谱柱的负担过重 , 难以保证分
离效果 。选择上样量样品分别为 0.20、 0.40、
0.60、 0.80、 1.00mL/g硅胶 , 上样量对叶黄素的
纯度及收率的影响见图 2。
图 2　上样量对分离的影响
Fig.2　Effectofloadabilityonseparation
由图 2可知 , 上样量在 0.40mL样品 /g硅胶
时 , 叶黄素的纯度和收率均最高。实验结果表
明 , 为了减少叶黄素的损失 , 提高收率 , 上样量
样品选择为 0.40mL/g硅胶较为适宜 。
2.6　上样浓度对分离的影响
分别将皂化液按 1.3节配制成浓度为 0.40、
0.80、 0.12mg/mL的溶液分别上柱 , 收集叶黄素
洗脱液并回收溶剂 , 测定产品中叶黄素含量 。上
样浓度对分离效果的影响见图 3。
由图 3可知 , 上样浓度对分离效果的影响不
明显。因此直接使用皂化液进行分离 , 可简化操
作 。
图 3　上样浓度对分离的影响
Fig.3　Effectofdifferentsample
concentrationonseparation
2.7　吸附剂使用次数对分离的影响
吸附剂重复使用可降低生产成本 。实验发
现 , 在层析结束后由于柱中还残留少量的杂质 ,
用 2 ～ 3倍柱体积的无水乙醇洗脱 , 再用 2 ～ 3倍
柱体积的洗脱剂平衡 , 然后重新上样 。在操作条
件下连续进行了 5次层析分离 , 结果如表 5所示 。
硅胶使用 5次以内 , 对叶黄素的分离效果无明显
影响 。可见层析分离的重现性较好。这是由于乙
醇极性较大 , 能够有效地洗脱硅胶柱吸附的极性
杂质组分 , 从而使层析柱基本恢复到初始状态 。
但是当硅胶使用一段时间后 , 需将硅胶重新活
化 , 使其恢复吸附性能 。
图 4　连续 5次层析分离的结果
Fig.4　Resultsofconsecutivecolumn
chromatographyforfivetimes
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2.8　优化条件下的分离
皂化液经样品前处理后 , 进样得到图 5 (a)。
由图可知 , 经 HPLC分离后得到 7个色谱峰 , 其
中 3峰为叶黄素 , 含量为 17.3%。在硅胶使用量
为 40g, 上样量为 16mL皂化液 , 湿法上样 , 吸附
时间为 30min, 负压操作过柱的条件下 , 经柱层
析后得到的叶黄素产品 , 其 HPLC图谱见图 5
(b)。
(a)皂化液的 HPLC图谱
(b)叶黄素产品的 HPLC图谱
图 5　皂化液和叶黄素产品的 HPLC图谱
Fig.5　ChromatogramsofsaponificationsolutionandproductstandardsofbyHPLC
由图 5 (b)可知 , 叶黄素产品的纯度可以达
到 83.3%左右。表明该方法有良好的分离能力。
3　结论
固定相采用硅胶 G(100 ～ 200目),胡萝卜素
洗脱剂为 V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=5 ∶1,叶黄
素洗脱剂为 V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1 ∶1 ,
层析柱规格为 Υ26×510mm, 吸附时间为 30min,
使用皂化液直接湿法上样 , 上样量为 0.4mL皂化
液 /g硅胶;柱温为常温 。在以上条件下 , 叶黄素
的纯度可由皂化液的 17.3%提高到 83.3%。实验
表明 , 该方法有良好的分离能力 , 便于操作 , 产
(下转第 130页)
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4　讨论
4.1　本实验通过三水平四因素正交试验 , 确定了
橘红皮多糖的最佳提取条件 , 即为:微波萃取功
率为 40%(320W)、 浸提时间 120s、 固液比 1 ∶
50, 橘红皮粉碎粒度 30目 , 在此条件下进行的验
证实验提取量高达 23.77mg/g, 远高于单因素实
验及正交试验的最高提取量。
4.2　目前微波萃取基本上还停留在实验室小样品
的提取及分析 , 使用设备简陋 , 工业化微波提取
器尚未见报道。近年 , 有用于试生产的微波提取
设备问世 , 一类为微波提取罐;另一类为连续微
波萃取设备 。而且对于潮州这样一个橘红产地来
说 , 一旦这些设备应用于大生产 , 必将对食品 、
香料业 、传统中药制药业等相关行业带来巨大的
革命 , 也必将极大的影响潮州的橘红种植 、 加工
业甚至潮州的经济结构。
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(上接第 55页)
品纯度稳定 。硅胶在重复使用 5次以内 , 对分离
效果的影响不明显。但是叶黄素在光照条件下易
氧化 , 因此在检测 、 分离过程中应采取良好的避
光措施 。
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