全 文 ：收稿日期:2005-03-14;修回日期:2005-06-20
基金项目:科技部奶业专项 “优质饲草高效生产关键技
术研究与产业化开发 ”(2002BA518A03)
作者简介:师尚礼(1962-),男 ,副教授 ,硕导 ,在读博士 ,
从事牧草种质资源 、牧草栽培的教学与研究工作 .
苜蓿根瘤菌固氮研究进展及浅评
师尚礼
(甘肃农业大学草业学院 ,甘肃　兰州　730070)
　　摘要:综述了苜蓿根瘤菌资源调查及根瘤菌和寄主 、环境间的相关特性和共生关系 、共生结瘤过
程与根瘤菌与寄主植物间的信息物质传递的研究 , 生物技术应用于根瘤菌系统发育及其分类的研
究 , 进一步促进根瘤菌资源的开发利用等方面的研究。并对苜蓿根瘤菌固氮研究方面进行了浅评。
　　关键词:苜蓿根瘤菌;固氮研究;进展;浅评
　　中图分类号:S154.39　　文献标识码:A　　文章编号:1000-6311(2005)05-0063-06
AdvanceintheStudyofSymbioticNitrogenFixationofAlfalfaRhizobiumandCom-
mentonIt.SHIShang-li(ProtaculturalColege, GansuAgriculturalUniversity, Lanzhou,
730070, China):GraslandofChina, No.5, 2005, pp.63 ～ 68.
Abstract:Theinvestigationofrhizobiaresource, thecharactersandsymbioticrelationship
betweenrhizobiaandalfalfa, thegeneticinformationandmaterialtransmissioninthe
procesofnodulationwerereviewed.Thattheapplicationofbiotechnologyinsystematicde-
velopmentandclassificationofrhizobiahaspromotedthedevelopmentandutilizationofrhi-
zobiaresourcewasalsoreviewed.
Keywords:Alfalfarhizobium;Symbioticnitrogenfixation;Advance;Comment
　　1886年 ,德国植物化学家 Helriegel和
Wilfarth等人研究证明豆科植物根瘤是由细
菌感染引起的 , 并能固定大气中的氮素。
1888年 ,荷兰学者 Beijerinck从豆科植物根
瘤中分离出固氮细菌 ,命名为根瘤菌。 1895
年 Nobbe和 Hiltner将根瘤菌接种剂第一次
用于试验室接种生产并在英 、美申请豆科植
物接种剂专利 。从此 ,各国科学家对生物固
氮进行了大量的研究 。目前 ,美国有 80%的
紫花苜蓿在种植之前进行根瘤菌接种;加拿
大和澳大利亚紫花苜蓿接种根瘤菌技术已经
被普遍接受 [ 1] 。
近些年 ,随着生态学和分子生物学技术
的发展 ,生物技术普遍应用于苜蓿根瘤菌研
究领域 ,对苜蓿根瘤菌固氮基因及其表达调
控 、根瘤菌基因与寄主基因之间的信号传递 、
识别与物质交换 ,苜蓿根瘤菌结瘤基因的遗
传特征 ,根瘤菌 、寄主植物 、环境三者之间的
协同对固氮效率的影响 ,苜蓿根瘤菌系统发
育特征等进行了比较深入的研究 ,苜蓿根瘤
菌固氮机理的研究已从细胞水平提高到分子
水平 ,从单纯的固氮领域扩展到一个涉及生
理 、生化和生态的综合领域 ,同时对固氮菌剂
—63—
第 27卷　第 5期　　　　　　　　　　　　中　国　草　地　　　　　　　　　　　　2005年 9月
Vol.27　No.5　 　　　　　　　　　　　GrasslandofChina　　　　　　　　 　　　　Sept.2005
(肥)的开发与利用进行了大量有益的探索 。
1　苜蓿根瘤菌固氮研究现状
1.1　苜蓿根瘤菌资源调查
我国苜蓿根瘤菌的研究始于 1950年 ,
起初以引进国外根瘤菌剂应用为主;大规模
研究始于 1980年 ,政府立项进行豆科牧草根
瘤菌筛选与利用研究 。中国农业微生物菌种
保藏管理中心根瘤菌实验室与全国各有关省
区县草原站协作从 20个省区 60多个县采集
根瘤及土样 1000多份 , 获得原始分离物
3000多份 ,经鉴定和筛选获得共生固氮性能
优良根瘤菌菌种 561株 , 其中苜蓿根瘤菌
252株 ,分别来自内蒙古 、黑龙江 、甘肃 、青
海 、新疆 、河北 、山东等 7个省区的 30个苜蓿
品种 , 2个扁蓿豆品种 、5个草木樨品种等寄
主植物 ,而且来自不同地区 、不同土壤和寄主
的不同品种根瘤菌生理生化特征间的差异很
大 [ 3] 。中国农业大学生物固氮研究室对全
国 27省(区)的豆科植物结瘤情况进行了全
面调查研究 ,从根瘤中分离出与之共生的根
瘤菌 4000多株 , 是目前国际上菌株数量最
大 、寄主最多样的根瘤菌库 。对其中 1000多
株菌进行了性状分析和分类研究 ,发表过两
个新属 , 7个新种 ,并发现了一批抗逆性强
(耐酸 、耐碱 、耐盐 、耐高温或低温)的宝贵种
质资源 。王卫卫等在甘肃 、宁夏部分地区调
查豆科植物 36属 99种 ,获得根瘤菌 360株 ,
44株是从尚未报道结瘤的 30种豆科植物分
离得到的。其中调查的苜蓿属(Medicago)植
物 4(5)种 ,菌株数 33株;草木樨属(Medilo-
tus)植物 3(4)种 ,菌株数 18株 [ 2] 。这些菌
种资源已被根瘤菌剂生产厂 、农业院校和科
研单位广泛利用 ,国家 863项目也采用其中
一些菌株用于基因工程菌的研究 ,成为我国
苜蓿共生固氮研究及接种剂生产的主要菌种
来源。
近二十年来 ,我国科技工作者加大了对
苜蓿根瘤菌资源的开发力度 ,国家和地方立
项支持 ,科研单位 、农业院校 、根瘤菌剂生产
企业联手合作 ,对我国根瘤菌资源分地区 、分
范围 、分类型进行了不断的采集调查 、筛选和
鉴定研究。宁国赞等对国内各省区 [ 3] ,王素
英等对西藏 、河北 [ 4, 5] ,王卫卫等对甘肃 、宁
夏 [ 2] ,刘宏生等对辽宁 [ 6] ,马玉珍 、王静等对
山西 [ 7, 8] ,韦革宏等对陕甘宁地区 [ 9, 10]的根瘤
菌资源相继进行了报道。
1.2　苜蓿根瘤菌的田间固氮应用研究
从 20世纪 70年代开始我国大面积播种
牧草改良退化草原。当时 ,豆科牧草种子接
种用根瘤菌剂主要从国外进口 , 1982年开始
用我国微生物菌种保藏中心筛选的菌种生产
接种剂 。高振生 (1996)等在黄河三角洲沿
海滩涂区给 5个紫花苜蓿品种接种根瘤菌 ,
结果表明 ,该技术可使紫花苜蓿干草产量提
高 50% ～ 93.2%, 结瘤量提高 70.97% ～
73.39%[ 11] ;宁国赞 (1998, 2001)在辽宁 、黑
龙江 、云南 、江西及内蒙古等 18个试验点紫
花苜蓿接种根瘤菌的结果显示 ,干草平均增
产 37.8%,增产最高的地区达到 100%[ 3] ;喻
文虎等(1995)在甘肃省高寒阴湿地区种植
紫花苜蓿接种根瘤菌 ,结果表明 ,幼苗结瘤率
提高 51.1%,分枝期结瘤量增加 9.3%,花期
产草量提高 27%[ 12] 。
AndrewH.Bosworth(1994)等将 dct基因
导入苜蓿根瘤菌中 , 构建苜蓿基因工程菌
RMBPC-2,在 5个实验点开展田间试验 ,结
果表明 , 除了在低氮 (NH4 +浓度为 7.3 ×
10
-6 , NO3 -为 10.3×10-6)、低土著菌(<50
个 /g干土 )地区干草产量比对照增产
17.9%,达到显著水平外 ,其它 4个地区与对
照没有显著性差异 [ 13] 。曾昭海等(2002)在
低氮 、土著菌数量偏高(3.5×105个 /g干土)
的田间环境下 ,接种筛选的高效根瘤菌 ,干草
产量比对照增产 10.2% ～ 13.7%,蛋白质产
量增产 13.59% ～ 19.63%,说明筛选竞争能
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中国草地　2005年　第 27卷　第 5期
力强 、固氮效率高的根瘤菌接种 ,苜蓿根瘤菌
的应用范围和增产效果将会有较大的提
高 [ 14] ,与宁国赞等 (1999)的研究结果一
致 [ 3] 。
马其东等 (1999)研究了不同根系发育
能力的苜蓿品种接种根瘤菌的效果 ,发现根
系发育能力越强 ,接种效果越明显 ,结瘤量与
根系发育能力密切相关 ,根系发育能力的强
弱是影响接种效果和固氮效率的重要因
素 [ 15] 。
虽然接种根瘤菌能使苜蓿的产量和质量
有显著提高 ,但已有的研究表明 ,在土壤氮素
相同的条件下 ,所有根瘤菌株并不能使不同
苜蓿品种获得同样的接种效果 ,对一个品种
可以产生优异表现的菌株 ,对另一个品种也
许只能诱导次级反应 ,这两种生物间的交互
作用说明根瘤菌与寄主之间需要很好搭配 ,
才能使苜蓿获得最佳固氮效率 [ 16] 。
1.3　苜蓿根瘤菌固氮机理的研究
1.3.1　影响苜蓿根瘤菌固氮效率的主要因
子
李友国等报道 ,根瘤菌的固氮效率既与
参与固氮的根瘤菌和植物基因有关 ,又受到
生态环境不同程度的影响 ,影响根瘤菌共生
固氮效率的主要因素有土壤因素 、宿主植物 、
固氮酶基因 〔包括共生质粒(基因)、缺陷型
回复突变〕等 [ 17, 18] 。
1.3.1.1　土壤因素
土壤中的生物和非生物因素均能不同程
度地影响接种根瘤菌的结瘤和共生固氮效
率 。苗期施用少量氮肥可加强植株光合作
用 ,促进根系生长 ,为根瘤菌感染和结瘤创造
较好条件。另一方面 ,土壤环境中较高浓度
的化合态氮(主要为硝态氮和铵态氮)能影
响根瘤菌对根毛的侵染 ,降低结瘤数量 ,抑制
类菌体固氮酶活性 ,从而对固氮效率表现出
明显抑制作用 ,并随着菌株和宿主植物不同
而异。 pH对根瘤菌生长的影响是一个相对
渐进的过程 ,依据其受影响程度不同可分为
酸敏感型和酸耐受型两大类 ,随着土壤的酸
化 ,根瘤菌结瘤和植物生长均会受到不同程
度的抑制。生物因素如土壤微生物(特别是
土著根瘤菌)、噬菌体 、菌根菌等也会影响根
瘤菌的占瘤率 , 从而影响其共生固氮效
应 [ 17] 。
1.3.1.2　宿主植物
对寄主植物而言 , Cregan等发现不同基
因型的豆科植物能限制结瘤菌株的类型或血
清型 ,通过对宿主植物基因型的选育 ,可有选
择地提高固氮优良菌株与宿主之间的亲和力
和匹配性 ,提高接种菌的占瘤率和共生固氮
效率。 Mulder与 Hardy等报道 ,向植物根部
或植株加富 CO2的空气可促进结瘤植株的
固氮作用 ,并可使植株的瘤数 、瘤重和固氮酶
活性成倍增加 ,且延长了其作用时间 ,并将其
归因于对植物光合作用的提高 [ 17] 。
1.3.1.3　固氮酶基因
影响根瘤菌共生固氮效率的主要固氮酶
基因有四碳二羧酸转移酶基因(dct)、固氮酶
调节基因(nifA)、吸氢酶基因(hup)、共生质
粒(基因)和缺陷型回复突变等 。苹果酸和
琥珀酸等四碳二羧酸是植物供给菌体以支持
共生固氮所需要的直接碳源及能源 ,加强四
碳二羧酸转移酶基因(dctABD)的表达可以
加强光合产物向类菌体的传递 ,以充分满足
其固氮作用和氨同化吸收过程对能量及碳源
的需求 ,从而提高其固氮效率 [ 17] 。 nifA除作
为固氮酶的正调节基因外 ,与根瘤发育 、类菌
体分化及竞争结瘤有关 。加强 nifA的表达
水平也是提高根瘤菌共生固氮效率和结瘤能
力的途径之一。利用吸氢酶基因 hup来循环
利用固氮酶还原 H+放出的 H2 ,则有可能因
减少能量损失而提高固氮效率 。根瘤菌的色
氨酸代谢及其缺陷株的研究也受到了不少研
究者的重视 [ 17] 。
1.3.2　苜蓿根瘤菌结瘤基因及其表达调控
—65—
师尚礼　苜蓿根瘤菌固氮研究进展及浅评
研究认为 ,所有的根瘤菌中 nod基因的
调控是相似的 ,它们的调控包含三个因素:一
是 trans-acting调节子 N.dD蛋白起的转录
激活作用;二是 N.dD蛋白结合到存在广泛
的同源序列的启动子(即 nodbox)上;三是通
过 N.dD蛋白激活的 nod基因的转录需要豆
科植物根分泌的植物信号分子如黄酮类物质
或具苯环的化合物的存在。根瘤菌结瘤基因
表达调控的研究进展非常迅速 [ 19] 。
1.3.2.1　结瘤基因与结瘤因子
结瘤基因的主要功能是共生关系早期过
程信号分子的形成与交换。其主要过程包括
植物根系分泌的类黄酮化合物作用于根瘤菌
的 NodD蛋白再激活其它 nod基因表达并合
成根瘤菌的应答信号结瘤因子 ,由根瘤菌分
泌到环境中的结瘤因子有效刺激宿主植物 ,
使根毛变形卷曲 ,根瘤菌再从该部位侵入并
形成侵入线最终导致根瘤形成。该过程也称
之为植物与根瘤菌的分子对话。结瘤基因从
功能上又可分为调节基因和结构基因 ,调节
基因对植物信号分子产生应答后激活其它结
瘤基因转录 ,如 nodD。结构基因可分成共同
结瘤基因和宿主专一性基因 ,共同结瘤基因
是指 nodABCIJ等基因 ,它们存在于所有根瘤
菌中。一种根瘤菌的 nodABC基因突变可用
另一种根瘤菌的同源基因互补 ,若将其导入
没有质粒的农杆菌中 ,也可以使农杆菌有结
瘤能力 。宿主专一性基因控制根瘤菌的宿主
范围 , 如 S.meliloti的 nodH、nodL或 nodEF
等 ,目前已克隆的结瘤基因约有 50个(nod、
nol、noe)[ 20 ～ 23] 。
结瘤因子 (Nod因子)又称胞外结瘤因
子 ,它在根瘤形成早期 ,在根瘤菌与植物分子
间的相互识别 、相互作用方面起着极其重要
的作用 。最先从苜蓿根瘤菌中分离到结瘤因
子 [ 20, 22] 。
1.3.2.2　结瘤基因的表达调控
结瘤基因的表达主要由调节基因 nodD
基因执行 ,在至今所检测的所有根瘤菌中均
存在 nodD基因 ,且具有一定的同源性 ,但不
同菌株的 nodD的拷贝数不同。 nod基因的
拷贝数甚至在一个种内也会发生变化 ,只有
单拷贝 nodD基因的菌株突变会产生 Nod-、
Hac-表型;而多拷贝 nodD基因的菌株中 ,一
个拷贝的 nodD基因突变影响的表型效应根
据菌株和寄主植物的不同而不同 ,如在苜宿
根瘤菌中 ,其 1个或 2个拷贝 nodD失活 ,引
起结瘤延迟 ,只有 3个拷贝的 nodD均突变才
表现出 Nod-表型 ,由此说明所有 3个 nodD
基因在其寄主植物结瘤时均有作用 。某些菌
株的 nodD基因的一些点突变可使之扩大寄
主范围 [ 18, 23] 。
苜宿根瘤菌中发现了 nolR基因 , 它是
nod基因表达的阻遏子 ,这种阻遏子结合到
nodD1和 nodD2启动子上 ,通过抑制 nodD1
和 nodD2的转录 ,从而调节可诱导的 nodD
基因的表达 [ 18, 19] 。nod基因的表达调控是相
当复杂的 ,不仅与根瘤菌本身的基因有关 ,也
与植物的基因表达有关。
1.4　根瘤菌分类研究
1932年 Fred根据 “互接种族 ”的关系将
全部根瘤菌定义为一个属 6个种 , 1964年
Graham通过数值分类证明当时的已有根瘤
菌应分为两个属 。此后分子生物学技术引入
根瘤菌分类 ,以 “互接种族 ”为依据的分类体
系被彻底否定 ,一些全新的方法应用于根瘤
菌分类 ,使根瘤菌分类的研究得到了迅速发
展 ,从过去的传统分类过渡到以遗传特征和
系统发育为主要依据的现代系统分类 [ 12] 。
目前总共已发表的根瘤菌有 6个属 20个种 ,
依据宁国赞(1999)报道 [ 3] ,目前苜蓿根瘤菌
发现有一个属一个种 252个菌株 。其分类的
主要研究方法有全细胞可溶性蛋白电泳 、多
位点酶电泳 、DNAG+C摩尔百分含量测定
及 DNA-DNA杂交 、限制性片段长度多态性
分析(RFLP)、随机扩增 DNA片段的多态性
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中国草地　2005年　第 27卷　第 5期
(RAPD)、基因外回文重复序列 PCR扩增 、
16SrDNA序列分析等 [ 24] ,多相分类方法的
应用使根瘤菌的分类更加系统化 、完整化。
在多相分类中使用各种不同的方法 ,目的是
从多角度 、多方位深入系统地认识根瘤菌的
现象和实质 。这些方法包括确定细菌系统发
育关系的方法 、大量菌株进行比较分群的方
法以及进一步提供遗传特征和表型特征的方
法等 ,各种方法之间有相似之处又各有其特
点 [ 24 ～ 26] 。
2　苜蓿根瘤菌固氮研究浅评
2.1　生物固氮是仅次于光合作用的生化过
程 ,每年向地球提供约 14 ×1010 kg的氮 ,其
中 80%由共生固氮生物所固定 , 20%由自养
生物固定 ,生物固氮占总初级光合作用产物
的 2.5%[ 1] ,因此 ,其作用极其显著 。紫花苜
蓿是我国北方地区人工草地优良豆科牧草品
种 ,在优质高产栽培技术的研究方面 ,对栽
培 、育种 、加工贮藏等技术研究较多 ,对根瘤
菌的研究起步较晚 ,研究不够深入。苜蓿具
有和根瘤菌共生固氮的能力是其表现优异的
基本因素 ,近年来 ,随着根瘤菌资源的不断挖
掘和发现以及新技术的不断发展和应用 ,苜
蓿根瘤菌的研究有很大的发展 [ 3] 。
2.2　大量研究证明 ,一定的根瘤菌株与一定
的苜蓿品种结合 ,才能产生较高的固氮作用。
因此 ,在根瘤菌与苜蓿品种共生固氮体系的
构建上 ,应做更深入的探讨:①通过苜蓿育种
培育苜蓿—根瘤菌高效固氮组合 ,发挥较强
的固氮能力[ 16] 。 ②筛选光合作用较强的高
光效苜蓿品种和根系发育能力强的苜蓿品
种 ,提高碳源和能量供应 ,提高根系生活强度
和扩展能力 ,为提高占瘤率做好基础[ 15] 。 ③
大力挖掘现有根瘤菌资源 ,筛选固氮效率较
高的根瘤菌 。同时利用现代生物技术手段 ,
构建高效固氮工程菌 。
随着经济的发展 ,用于改良草地的苜蓿
品种将不断增加 ,对根瘤菌资源的品种更新
也将提出新的要求。因此 ,不仅要长期有效
地保护已有的菌种资源 ,深入研究各类菌种
的特性 ,筛选各类寄主植物品种与根瘤菌种
共生固氮优良组合 ,而且要继续从不断变化
着的自然界分离筛选新的根瘤菌种 ,以不断
满足共生固氮研究和苜蓿根瘤菌接种剂生产
对菌种资源的需要。
2.3　根瘤菌与苜蓿植物的结瘤过程是一个
比较复杂的过程 ,它不仅涉及到根瘤菌自身
的遗传背景和植物的遗传背景 ,而且涉及到
根瘤菌与植物两者的信号 、物质的识别 、交换
等 。虽然我们已经初步了解了结瘤过程中结
瘤基因的表达调控 ,但了解十分有限 ,特别对
分子水平的表达调控机理了解的就更少 。因
此还有必要深入地研究结瘤过程基因表达调
控的分子机理。
2.4　目前生产上常以草炭作为苜蓿根瘤菌
接种剂的载体材料 ,实践证明 ,草炭是苜蓿根
瘤菌接种剂较理想的载体材料 ,如果在载体
材料中添加铁 、锌 、锰等微量元素可进一步提
高菌种存活率 ,并延长接种剂保存期 [ 1] 。但
各种微量元素种类及其适宜添加浓度尚待研
究 。
2.5　开辟苜蓿根瘤菌溶磷和分泌生长激素
研究的探索 。关于解磷和分泌生长激素微生
物的研究已有一段时间 ,但发展甚慢。苜蓿
根瘤菌的溶磷和分泌生长激素研究 ,目前尚
未见报道 ,但在实验室工作中 ,发现苜蓿根瘤
菌存在溶磷和分泌生长激素能力 ,建议通过
研究进一步证实 ,如果苜蓿根瘤菌存在溶磷
和分泌生长激素能力 ,将会开辟豆科植物根
瘤菌研究的新领域。
2.6　苜蓿根系是根瘤形成的载体 ,不同种植
地龄 、不同土壤环境的苜蓿根系直根 、侧根 、
毛根比例变化较大 ,种植年限越短 ,侧根 、毛
根占有比例越大 ,且根皮幼嫩 ,根瘤菌易于侵
染 ,结瘤率高 。随种植年限的增加 , 毛根减
—67—
师尚礼　苜蓿根瘤菌固氮研究进展及浅评
少 ,根皮老化 ,根瘤菌难于侵染 ,根瘤较少。
毛根的多少与幼嫩程度是苜蓿根瘤形成多少
的关键 ,主根截断 、施肥 、菌根等可促进侧根 、
毛根的生长 。因此 ,侧根 、毛根形成的诱导因
子及其诱导机理的研究应成为当前提高根瘤
菌结瘤的又一重点。随之 ,高龄苜蓿因根瘤
减少而带来的氮素供应缺乏问题也是苜蓿栽
培技术需要解决的问题。
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