全 文 ：收稿日期:2010-08-16;　修订日期:2011-02-16
基金项目:国家科技支撑计划(No.2010BAD02B04);
湖北省科技攻关计划项目(No.2007AA301B62);
湖北省教育厅项目(No.Q20101610)
作者简介:崔永明(1978-),男(汉族),河南驻马店人 ,现任武汉纺织大
学副教授 ,博士学位 ,主要从事植物资源开发与应用研究工作.
＊通讯作者简介:陈　悟(1968-),男(汉族),湖北黄冈人 ,现任武汉纺织
大学副教授 ,博士学位 ,主要从事苎麻清洁生产研究工作.
苎麻叶中绿原酸提取工艺的响应面法优化
崔永明 ,靖海瑞 ,李晶晶 ,张　贤 ,祝　荻 ,陈　悟＊
(纺织印染清洁生产教育部工程研究中心 ,武汉纺织大学 ,湖北 武汉　430073)
摘要:目的 优化苎麻叶中绿原酸超声提取工艺。方法 利用单因素实验确定苎麻叶中绿原酸超声提取工艺条件的响应
面中心值 , 通过响应面法和 MATLAB7.0对提取工艺条件进行优化。结果 优化的提取工艺参数为:乙醇体积分数 77%,
固液比 1∶16,提取时间 11 min。在此工艺条件下绿原酸的提取率高达 0.248%, 与模型预测值 0.253%基本相符。结论
超声提取法是一种高效提取苎麻叶中绿原酸的方法 ,通过响应面法得到一个能较好预测实验结果的模型方程。
关键词:苎麻叶;　超声辅助提取;　绿原酸;　响应面法;　优化
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805, 2011.08.028
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2011)08-1865-02
OptimizationofExtractionforChlorogenicAcidfromRamieLeavesbyResponseSurface
Method
CUIYong-ming,JINGHai-rui,LIJing-jing, ZHANGXian, ZHUDi,CHENWu＊
(EngineeringResearchCenterforCleanProductionofTextilePrinting, MinistryofEducation, WuhanTextileU-
niversity, Wuhan430073 , China)
Abstract:ObjectiveTogettheultrasonic-assistedextractionoptimizationmethodologyofchlorogenicacidfromramieleaves.
MethodsThesinglefactorexperimentsdesignwasadoptedtodeterminetheexperimentalcenterfactorvalueofulrasonic-assis-
tedextractionfactorsofchlorogenicacidfromramieleaves.Furthermore, theoptimalconditionsweredeterminedtogetthemaxi-
malextractionvaluewithResponseSurfaceMethodologybymodelingtoolsMATLAB.ResultsTheoptimumextractionconditions
wereasfollows:volumefractionofethanol77%, ratioofsolidtoliquid1:16 andextractingtime11 min.Undertheoptimalcondi-
tions, theobtainedexperimentalvalueofchlorogenicacidextractionratewas0.248%, coincidingperfectlywiththepredictive
valueof0.253%.ConclusionUtrasonic-assistedextractionisakindofefficientandrapidmethodforextractionofchlorogenic
acidfromramieleavesandamodelequationgotthroughtheresponsesurfacemethodcanbeusedtopredicttheexperimentre-
sults.
Keywords:Ramieleaves;　Utrasonic-assistedextraction;　Chlorogenicacid;　ResponseSurfaceMethodology;　Opti-
mization
　　苎麻 Boehmerianivea(Linn.)Gaudich属于荨麻科苎麻属植
物 , 我国的苎麻产量约占全世界苎麻产量的 90%以上 ,在国际上
称为 “中国草” [ 1] 。苎麻不仅是重要的纤维作物 , 还是我国传统
医学常用的中药之一 ,我国民间利用苎麻治疗疾病的历史十分悠
久。明朝李时珍在著名的医学著作《本草纲目》中对苎麻的药用
功能做了详细的记载和阐述 , 认为苎麻有安胎 、清热 、止血功
效 [ 2] 。
我国苎麻常年种植面积 20万公顷左右 , 原麻亩产为 300 kg
左右 , 而对于占植株重量 40%左右的苎麻叶大多都废弃还田 ,或
者焚烧 , 浪费大量资源 ,且对环境产生一定的不良影响 [ 3] 。研究
表明苎麻叶含有多种生物活性成分 , 如超氧化物歧化酶 、多酚和
绿原酸等 , 其中绿原酸具有抗氧化作用 、清除体内自由基 、抑制突
变 、抗肿瘤 、保肝利胆和抗菌等生物活性 [ 4 ～ 7] ,广泛应用于食品 、
保健 、医药和日用化工等多个领域 [ 8] 。因此 , 研究苎麻叶中的绿
原酸等有效成分的提取分离工艺对于合理综合开发苎麻资源具
有重要意义。
1　材料与仪器
1.1　材料 干燥苎麻叶 、甲醇 、乙醇 、蒸馏水 、石油醚 、丙酮 、醋酸
乙酯 、绿原酸标准品(纯度 99.9%)等。
1.2　仪器 电子天平 、超声波清洗器 、JY92 -Ⅱ超声波细胞粉碎
仪 、旋转蒸发器 、UU-1201紫外可见分光光度计 、 5810R高速冷
冻离心机等。
2　方法
2.1　单因素实验 称取 1 g干燥苎麻叶粉 , 加入 25 ml石油醚 , 置
于超声波细胞粉碎仪中超声处理 10min(脱去叶绿素等脂溶性杂
质),然后过滤 , 去滤渣自然晾干 , 然后加入一定体积的乙醇水溶
液 , 置于超声波细胞粉碎仪中超声处理一定时间 , 离心过滤 ,滤液
稀释一定比例后按标准曲线法在 326 nm处测定其吸光度 ,根据
回归方程换算提取液中绿原酸含量 ,计算绿原酸提取率。
2.2　Box-Benhnken实验 根据 Box-Benhnken实验设计原理 ,
结合单因素实验结果 ,选取对苎麻叶中绿原酸提取率影响显著的
3个因素:乙醇体积分数 、固液比和提取时间 , 采用 3因素 3水平
的响应面分析方法 ,设计中心组合实验。
2.3　标准曲线的绘制 准确称取 5.0 mg绿原酸标准品 , 甲醇溶
解 , 用 25ml容量瓶定容 ,配制成 0.2 mg/ml的绿原酸标准品。取
1.00, 1.50, 2.00, 2.50, 3.00 ml和 3.50 ml配制好的绿原酸标准
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.8 时珍国医国药 2011年第 22卷第 8期
品于试管中 , 加入甲醇补足 5.00 ml。摇匀 , 326 nm处测吸光度 ,
以吸光度 A为纵坐标 、标准品的浓度 C为横坐标 , 绘制标准曲
线 , 得回归方程为 A=-0.047 4+65.69C, R2 =0.999 4。
3　结果与讨论
3.1　单因素实验
3.1.1　最佳提取剂浓度的确定 称取 1g干燥苎麻叶粉 5份 ,各
加入 25ml石油醚 , 置于超声波细胞粉碎仪中超声处理 10 min,
然后过滤 , 去滤渣自然晾干后 ,分别加入 15 ml蒸馏水 、30%乙醇
水溶液 、50%乙醇水溶液 、70%乙醇水溶液 、90%乙醇水溶液 , 置
于超声波细胞粉碎仪中超声处理 10 min, 提取液过滤 ,将滤液分
别用蒸馏水 、 30%乙醇水溶液 、 50%乙醇水溶液 、 70%乙醇水溶
液 、90%乙醇水溶液稀释 10倍 , 分别用提取溶剂做对照 , 在 326
nm波长下测量 5份稀释样品的吸光度 ,根据标准曲线计算提取
率。实验结果见图 1。
图 1　乙醇浓度对提取率的影响
由图 1可知 , 随着乙醇浓度的增大 ,提取率不断提高 , 当乙醇
浓度为 70%时 , 提取率最高 , 继续增大乙醇浓度 , 提取率有所下
降 , 因此 ,最佳提取剂为 70%乙醇。
3.1.2　最佳提取剂用量的确定 分别称取 1 g干燥苎麻叶粉 5
份 , 各加入 25 ml石油醚 , 置于超声波细胞粉碎仪中超声处理 10
min,然后过滤 , 去滤渣自然晾干后 , 分别加入 5, 10, 15, 20, 30 ml
70%乙醇水溶液(对应提取剂用量分别为 5, 10, 15, 20, 30倍)置
于超声波细胞粉碎仪中超声处理 10 min, 过滤 , 将滤液分别稀释
20, 10, 6.67, 5, 3.33倍 , 在 326 nm波长下分别测定 5份稀释样品
的吸光度 , 根据标准曲线计算提取率。结果见图 2。
图 2　提取剂用量对提取率的影响
由图 2可知 , 提取剂用量小于 15倍量时 , 提取率随着提取剂
用量的增大而提高 , 但当提取剂用量高于 15倍量时 , 再增大提取
剂用量 , 提取率不再增加 ,因此考虑成本因素 ,最佳提取剂用量为
15倍。
3.1.3　最佳提取时间的确定 称取 1 g干燥苎麻叶粉 5份 , 各加
入 25ml石油醚 ,置于超声波细胞粉碎仪中超声处理 10 min, 然
后过滤 , 取滤渣自然晾干后 ,各加入 15 ml70%乙醇水溶液置于
超声波细胞粉碎仪中分别超声处理 5, 10, 15, 20, 30 min, 然后过
滤提取液 , 各稀释 10倍后 ,在 326 nm波长下分别测量 5份稀释
样品的吸光度 , 根据标准曲线计算提取率。实验结果见图 3。
由图 3可知 , 随着提取时间的延长 ,提取率不断提高 , 当提取
时间超过 20min后 ,提取率不再增加 ,所以最佳提取时间应为 20
min。
3.2　响应面分析法优化提取工艺条件
3.2.1　Box-Benhnken实验结果 见表 1。实验 1 ～ 12为析因实
验 , 13 ～ 15为中心实验。 其中:A=(乙醇体积分数 -70)/20,
B=(提取时间 -15)/5, C=(固液比 -15)/5。各因素的水平根
据单因素实验选择 ,以能够反映整个因素变化过程为准 , 以得到
较好的回归方程。如果某因素对结果的影响很大 ,可以扩大水平
的范围以期得到好的回归模型 , 如果选择的水平范围太窄 , 则不
足以反映该因素的变化过程。
图 3　提取时间对提取率的影响
表 1　Box-Benhnken设计方案及实验结果
实验
号
编码值
A B C
实际值
乙醇浓度
(%)
超声时间
/min 固液比
提取率
(%)
1 0 -1 -1 70 10 1∶10 0.120
2 1 0 -1 90 15 1∶10 0.123
3 1 -1 0 90 10 1∶15 0.155
4 0 1 1 70 20 1∶20 0.215
5 0 -1 1 70 10 1∶20 0.160
6 -1 0 -1 50 15 1∶10 0.104
7 0 0 0 70 15 1∶15 0.170
8 0 0 0 70 15 1∶15 0.173
9 0 0 0 70 15 1∶15 0.171
10 -1 -1 0 50 10 1∶15 0.131
11 -1 1 0 50 20 1∶15 0.184
12 1 1 0 90 20 1∶15 0.167
13 1 0 1 90 15 1∶20 0.15
14 -1 0 1 50 15 1∶20 0.173
15 0 1 -1 70 20 1∶10 0.135
3.2.2　回归模型建立 对表 1中苎麻叶绿原酸提取率 Y及 3个
因素 X1 、X2 、X3的数值 , 利用 MATLAB中的多元回归函数进行拟
合 , 得到回归模型方程:R1 =0.171 333 +0.007 250 00A+
0.015 125 0B+0.018 375 0C-0.020 916 7A×A+0.008 833 33B
×B-0.019 166 7C×C-0.010 250 0A×B-0.004 250 00A×C
+0.013 500 0B×C
回归方程的方差分析见表 2。
表 2　回归方程的方差分析
来源 平方和 自由度 均方 F Prob>F
回归模型 0.009 444 9 0.001 049 6.684 656 0.025 0
A-A 4.21E-04 1 4.21E-04 2.678 628 0.162 6
B-B 0.001 83 1 0.001 83 11.658 08 0.019 0
C-C 0.002 701 1 0.002 701 17.206 44 0.008 9
AB 0.000 42 1 0.000 42 2.677 036 0.162 7
AC 7.23E-05 1 7.23E-05 0.460 4 0.527 6
BC 0.000 729 1 0.000 729 4.643 805 0.083 7
A＊A 0.001 615 1 0.001 615 10.290 33 0.023 8
B＊B 2.88E-04 1 2.88E-04 1.835 243 0.233 5
C＊C 0.001356 1 0.001356 8.640 473 0.032 3
残差 0.000785 5 1.57E-04
失拟项 7.80E-04 3 2.60E-04 111.464 3 0.008 9
净误差 4.67E-06 2 2.33E-06
总误差 0.010 229 14 R2=0.923 3
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时珍国医国药 2011年第 22卷第 8期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.8
回归方程相关系数R2 =0.923 3,表明回归拟合良好 , 由 F检
验 , 当 Prob>F值小于 0.05即可认为该指标显著 , 当小于 0.01
时即为高度显著(Prob>F即为 F检验的 P值),由表中数据可以
看出 , 固液比对提取率的影响是高度显著的。利用 MATLAB的
求导函数(dif)对方程模型求一阶偏导得到最优化值对应的方
程 , 再利用线性方程函数(solve)求出最优化值。即乙醇浓度为
77 %, 超声辅助提取时间为 11 min, 固液比为 1∶16时 , 该模型
预测的绿原酸提取率最大 ,提取率预测值为 0.253%。
3.2.3　验证实验 当乙醇浓度为 77 %、超声辅助提取时间为 11
min、固液比为 1∶16时 , 苎麻叶中绿原酸提取率为 0.248%,与预
测值 0.253%相吻合 ,说明该模型可以较好地预测绿原酸提取情
况。
4　结论
在单因素实验的基础上探索了用响应面法优化苎麻叶中绿
原酸超声提取工艺参数。 获得最佳工艺条件为:乙醇体积分数
77%、提取剂用量 16倍 、提取时间 11 min, 预测的最大提取率为
0.253%, 在此工艺条件下苎麻叶中绿原酸的实际提取率为
0.248%, 与预测值相吻合。实验结果表明响应面分析法为优化
天然产物有效成分提取工艺提供了有效的工具。
参考文献:
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tumorcelstreatedwithcafeicacidandchlorogenicacid[ J] .Vibra-
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收稿日期:2010-07-04;　修订日期:2010-10-10
基金项目:新疆石河子大学科学研究发展计划“自然科学与技术创新 ”项
目(No.ZRKX2008004)
作者简介:段海燕(1985-),女(汉族),陕西西安人 ,现为石河子大学在读
硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事天然产物的研究与开发工作.
＊通讯作者简介:曹　红(1969-),女(汉族),安徽卢江人 ,现任石河子大
学化学化工学院副教授 , 博士学位 ,主要从事生物催化与酶工程研究工
作.
洋葱中蒜氨酸酶的提取分离及酶活力测定
段海燕 ,陈思羽 ,李炳奇 ,曹　红＊
(石河子大学化学化工学院 ,新疆 石河子　832001)
摘要:目的 优选洋葱中蒜氨酸酶的提取工艺 , 并测定酶活力。方法 首先建立了三波长分光光度法测定蒜氨酸酶活力 ,
然后以新疆洋葱为原料 ,采用硫酸铵盐析法 、PEG8000沉淀法和 PEG6000沉淀法分别对蒜氨酸酶进行提取分离 , 同时还
考察了蒜氨酸酶底物 -蒜氨酸的提取方法。结果 三波长分光光度法的检测波长为 λ1 =426 nm、λ2 =446 nm、λ3 =506
nm;回归方程 ΔA=0.912 63C+ 0.006 98,相关系数 r=0.999 8;方法回收率为 99.2% ～ 108.4%, RSD为 2.41%。硫酸
铵盐析法 、PEG8000沉淀法和 PEG6000沉淀法沉淀蒜氨酸酶的最佳饱和度分别是 45%, 20%, 20%;最佳料液比 1∶1, 最
佳打浆时间 2 min, 而蒜氨酸酶的最佳提取方法是 20% PEG8000沉淀法;底物蒜氨酸的最佳提取方法是微波灭酶法。结
论 研究结果为今后蒜氨酸酶提取工艺的进一步优化提供了指导。
关键词:洋葱;　蒜氨酸酶;　提取分离;　三波长分光光度法;　酶活
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2011.08.029
中图分类号:R284.2　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2011)08-1867-04
　　洋葱 AlliumcepaL., 又名玉葱 、葱头 、圆葱 , 百合科葱属 , 两
年生草本植物 [ 1] , 是公认的药食两用蔬菜 , 素有 “蔬菜皇后 ”之美
称。近代医学研究发现 , 洋葱具有预防心脑血管病 、降血脂 、平
喘 、抗血小板凝聚 、消炎抑菌 、防癌抗癌 、利尿止泻等功效 [ 2] , 其
功效成分主要是由蒜氨酸酶催化裂解蒜氨酸生成的含硫化合物
-蒜素 [ 3] 。其实 , 在完整的洋葱细胞内 , 蒜氨酸酶和底物蒜氨酸
是分隔存在的 , 蒜氨酸酶存在于液泡中 , 而蒜氨酸存在于细胞质
中。当细胞受伤时 , 蒜氨酸酶就会和蒜氨酸相遇 , 发生反应 ,产生
丙酮酸 、氨以及包括蒜素在内的含硫化合物 , 其反应过程如图 1
所示 [ 4] 。然而 , 由于功效成分 -蒜素的分离 、提取或人工合成十
分困难 , 化学性质极不稳定 , 易分解 ,无法长期保存。目前国内外
的研究思路是从洋葱中提取化学性质相对稳定的蒜氨酸及蒜氨
酸酶 , 然后科学组方 , 制成蒜氨酸 /蒜酶复合制剂 , 让其在体内释
放蒜素等有效成分 , 充分发挥疗效 [ 5 , 6] 。因此 , 洋葱中蒜氨酸酶
的研究与开发对果蔬产品的深加工和药用保健都具有较强的现
实意义 。
蒜氨酸酶的酶活测定一般采用紫外分光光度法。由于丙酮
酸可与 2, 4-二硝基苯肼反应 , 且加碱处理后形成的棕红色 2, 4
-二硝基苯腙有特征吸收峰 ,因此可利用丙酮酸这一特征性反应
测得丙酮酸生成量 ,以推测蒜氨酸酶的酶活力 [ 7, 8] 。但由于蒜氨
酸酶和蒜氨酸均存在于洋葱中 , 提取蒜氨酸酶和蒜氨酸时 , 难免
会在提取物中形成丙酮酸背景值。因此 ,采用单波长紫外分光光
度法测定丙酮酸生成量时 , 易受背景值 、干扰组分 、溶液浑浊 、吸
收池不干净等因素的影响而产生较大的测量误差。而三波长紫
外分光光度法测得的 ΔA值只与待测组分的浓度有关 , 而与干扰
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