全 文 ：现代医药卫生2006年22卷第15期
金刷把(CladoniafalaxAbbayes)为石蕊科植物松石蕊的全
体,属于寄生地衣类植物,主要分布于陕西,四川等地,具有镇
静、消炎、止痛的功能,主治癫痫、精神分裂、神经衰弱、头目眩
晕等症,是一种陕西民间用的中草药[1]。近年来的研究表明,有
些细胞毒类药物如阿霉素、秋水仙碱、山油柑碱等[2]可以作用于
细胞膜,从而发挥细胞毒作用,并认为这与抑制肿瘤细胞的生
长有关,因此,细胞膜成为一种新型的作用靶点[3],可反映出药
物分子与细胞膜及膜受体的某种作用关系,文献报道以红细胞
作为研究对象的较多[4,5]。我们据此把红细胞做成细胞膜色谱柱
(celmembranestationaryphase,CMSP),利用液相色谱法进行大
量药物筛选,并以秋水仙碱跟踪分离,最后以阿霉素为阳性药,
利用MTT比色法验证药理作用。本文采用的兔红细胞膜色谱法
(celmembranechromatography,CMC)是一种新型的生物亲合
色谱[6],筛选出了金刷把中对HeLa细胞体外生长有抑制杀伤作
用的细胞毒性成分。
1 实验材料
1.1 仪器与试药:ThermoFinnigam液相色谱仪器(美国):Spec-
traSYSTEMP2000溶剂输送泵、SpectraSERIESUV100检测器,
ANASTAR色谱工作站(天津东康公司),磁力搅拌器,Hermle
zk401型低温冷冻高速离心机 (德国),二氧化碳培养箱(Her-
aeus),超净工作台(苏净集团安泰公司),倒置显微镜(XDS-
1B),BIO-RAD550型自动酶标读数仪(日本),96孔培养板。
甲醇、乙醇、石油醚、乙醚、氯仿、正己烷、乙酸乙酯、正丁
醇、二甲亚砜等均为分析纯 (西安化学试剂厂)。MTT,RP-
MI1640,胰蛋白酶(华美公司),阿霉素(西安交通大学第一医院
药剂科),三重蒸水(本实验室自制)。
1.2 实验动物及细胞株:健康家兔,雌雄不限(西安交通大学
实验动物中心);HeLa细胞株(中国科学院上海生物化学与细胞
生物学研究所,西安交通大学癌症研究所馈赠)。
2 金刷把药材的提取分离
2.1 初步分析:取原药材2kg,粉碎成粗粉,用95%乙醇加热回
流提取2次,每次3小时,合并提取液,回收乙醇至无醇味,加水
适量,分别以石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到JSB-1、
JSB-2、JSB-3、JSB-4、JSB-5共5个部分,经细胞膜色谱法筛选,
并与对照药品秋水仙碱(见图1A)比较,表明JSB-2有类似对照
品的保留峰(见图1B),是其中可能含活性成分的部位。
2.2 JSB-2进一步分离:以柱层析硅胶为填料,湿法装柱并用
洗脱液平衡柱,将JSB-2用硅胶拌样后上柱分离,采用氯仿/甲
醇下行洗脱,经薄层色谱等各种跟踪分析后,最终得JSB-2A、
JSB-2B两份样,经筛选后得出JSB-2A是其中可能含活性成分
的部位。对JSB-2A又进行柱层析分离,以正己烷/乙酸乙酯作为
洗脱剂,得到JSB-2A1~JSB-2A10共10份样,经CMC色谱筛选得
【摘要】目的:发现金刷把中具有细胞毒活性成分并研究其对HeLa细胞生长的抑制杀伤作用。方法:采用液-固柱层析色谱法对
金刷把进行分离,用兔红细胞膜色谱模型跟踪筛选,并结合MTT比色法测定其细胞毒活性。结果:金刷把乙醚萃取部位是具有细胞
毒活性的有效部位,而从中经过多步分离得到的成分是其有效成分。结论:采用此CMC模型,从金刷把中筛选分离得到的有效成分
经验证具有一定的抑制杀伤癌细胞作用。因此,红细胞色谱模型作为筛选具有细胞毒成分的新模型,基本上可以从分子水平上反映
细胞毒性成分与细胞膜及膜受体之间的某种作用关系,在色谱过程中表现出明显的保留特性。
【关键词】细胞膜色谱;金刷把;HeLa细胞;MTT比色法
文章编号:1009-5519(2006)15-2303-02 中图分类号:R28 文献标识码:A
用细胞膜色谱法分析金刷把中具有细胞毒活性的有效成分
张 博 1,贺浪冲 2
(1.西安医学院药学系,陕西 西安710068;2.西安交通大学药学院,陕西 西安710068)
3 讨论
放置IUD因具有安全、长效、简便、可逆而成为广大育龄妇
女选用的长效避孕方法。但因有带器妊娠 、环下移、脱落、阴道
出血等均给育龄群众带来一定的心理负担。因此选择一种副作
用少、脱落率低、续用率高的IUD也是广大育龄妇女的愿望。活
性元宫IUD是我国研制成功的新一代宫内节育器,选用优质不
锈钢丝、纯钢丝制造,性能稳定,不老化,不变质,可放置20年以
上,具有结构符合子宫形态和子宫动力学原理,弹性适中,对子
宫无刺激,无损伤等特点,是一种有效率高、不良反应小、安全
可靠的IUD。
3.1 避孕效果:本组显示放置IUD后24个月累计带器妊娠率观
察组(1.33%)明显低于对照组(4%),提示活性元宫IUD的避孕
效果高于药铜165IUD;脱落率观察组(1.33%)明显低于对照组
(7.33%),活性元宫IUD脱落率低原因,可能与其结构符合子宫形
态和子宫动力学原理、弹性适中有关。在子宫收缩时IUD随之产
生弹性变化,以适应宫腔形态,避免了对子宫产生的机械性刺
激,从而有效的降低了子宫的排异反应[1]。而IUD脱落是影响IUD
续用的主要原因。放置IUD的技术是否熟练直接影响IUD的续用
率和可接受性,所以提高放置技术也是防止IUD脱落的关键。
3.2 不良反应:使用IUD主要的不良反应为月经过多、经期延
长、月经淋漓不净、腰腹疼痛等,亦是因症取出的主要原因。活
性元宫200型IUD与药铜165IUD均含有铜丝及消炎痛,均有改
善出血、消炎、减少副作用等特点,不带尾丝可减少因尾丝引起
的逆行性感染和不适.本文两组放置24个月后累计因症取出率
观察组(2%)低于对照组(4%),这与元宫IUD具有结构符合子宫
形状、弹性适中,对子宫无刺激、无损伤等优点有关。
综合所述,活性元宫IUD避孕效果显著、脱落率低、不良反
应少、续用率高,是一种安全、高效的宫内节育器,值得临床推
广使用。
参考文献:
[1] 张 伟,田九玲,张淑斌,等.放置活性元宫IUD与TCU220CIUD24
个月临床效果观察[J].中国计划生育学杂志.2005,13(12):108.
收稿日期:2006-03-10
2303
现代医药卫生2006年22卷第15期
出JSB-2A1(黄色),JSB-2A2(红色),JSB-2A3(土红色)为有保
留部位,显示出其中可能含活性成分。
2.3 物质的纯化:取JSB-2A2适量,以氯仿进行结晶,得到一种
结晶,再多次重结晶得到白色片状结晶体(G),经筛选该物质有
保留,显示其可能具有活性(见图1C)。
3 对结晶体(G)进行体外细胞毒性实验研究
3.1 HeLa细胞的传代培养:HeLa细胞株在含10%小牛血清RP-
MI1640培养液中(含0.1%青霉素,链霉素)培养,并置于37℃,
5%二氧化碳饱和湿度的培养箱内培养备用。
3.2 MTT比色法测G的细胞毒活性:取对数生长期的HeLa细
胞,胰蛋白酶消化,制成4×104/ml细胞悬液,置入96孔培养板内,
每孔200μl,培养24小时。实验设阴性组,阳性组(阿霉素)及各
种药物实验组。将G分别配成终浓度为80,40,20,10,5μg/ml5
个浓度,加在96孔板内,每孔加20μl,每种剂量6个平行孔。药
物作用44小时后,加入MTT20μl,37℃继续培养4小时,小心吸
去上清液,每孔加入二甲亚砜(DMSO)200μl,微量震荡器震荡
5分钟,自动酶标读数仪(λ=490nm)测光密度,计算药物对HeLa
细胞的抑制率。HeLa细胞存活率=抗癌药物组光密度值(OD)/细
胞对照组光密度值(OD)×100%,抑制率=100%-存活率[7]。
3.3 光镜形态学观察:细胞进入对数生长期后,加入不同浓度
药物,定时观察各组分细胞形态的变化。药物作用24小时以后,
加药组的细胞逐渐变圆,体积变小,胞内颗粒增多,核变大,细
胞透明度降低,HeLa细胞明显受到抑制,且随药物浓度的增
加,形态发生变化的细胞数越来越多,存活率逐渐降低,抑制率
逐渐增加,IC50=18.49mg/L(见图2)。未加药组细胞则无明显改
变,贴壁、展开、生长良好。
3.4 统计学处理:每份样本平行测定6孔,数据均以x±s表示。
(见表1)。
4 讨论
细胞膜色谱是一种新型的亲合色谱,将其用于新药研究
中,具有筛选速度快,效率高,可反映药物分子与受体作用特性
的优点[9]。本文利用红细胞膜色谱法筛选药物,快速定位,从陕
西民间用药金刷把中初步筛选出几种可能具有细胞毒性的部
位,并对其中一种结合MTT比色法进行了药理学研究,表明其
对肿瘤细胞有一定的抑制杀伤作用。
MTT比色法的基本原理是存在于活细胞线粒体呼吸链上
的琥珀酸脱氢酶能脱下琥珀酸的氢原子,而死细胞没有这一性
质,黄色的MTT接受氢原子,被还原成蓝紫色的甲臢结晶,用DM-
SO溶解,在波长490nm下,用酶标仪测定反映甲臢量的吸光度
值,就能定量的反映细胞数与细胞活性的变化。该法的结果准
确、可靠,是一种常用的细胞毒类药物体外细胞毒性实验的测
定方法[8,9]。
鉴于金刷把中物质成分与细胞毒性的关系为首次研究,故
选用通用的癌细胞株HeLa细胞进行研究[10],并运用MTT比色法
研究金刷把中活性成分对HeLa细胞生长的影响,为以后各种深
入研究打下基础。
参考文献:
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1395.
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收稿日期:2006-03-21
1 A
2 B
3 C
组 别
对照组
ADM组
药物组(μm/L)
5
10
20
40
80
光密度(OD)值
0.318±0.025
0.115±0.035
0.275±0.051
0.221±0.027
0.146±0.046
0.114±0.020
0.089±0.020
存活率(%)
37.10
86.48
69.50
45.91
35.85
27.99
抑制率(%)
62.90
13.52
30.50
54.09
64.15
72.01
表1 MTT法测定金刷把中活性成分对HeLa细胞的影响(n=6,x±s)
图1 秋水仙碱(A)、JSB-2(B)、结晶体G(C)
在兔红细胞CMSP柱上的保留图
注:1— 秋水仙碱;2— JSB-2;3—结晶体G
图2 G对HeLa细胞体外生长的影响
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