全 文 ：时珍国医国药 2 0 0 5年第 6 1卷第 2 期 L H I S IZH N E MD N E IC I EN D A M AT ER IA M ED IR CA E SR E A CH Z O SV ( L )
.
16 N (〕 . 2
生物活性跟踪分离法
筛选当归挥发油 中的有效成分
赵惠茹 ` , 杨广德 2 , 贺浪冲 2
(1
. 陕西医学高等专科学校 ,陕西 西安 7 1 0 0 6 8 ; 2 . 西安交通大学 医学院 ,陕西 西安 7 10 0 6 1)
摘要 : 目的 : 筛选 当归挥发油 中对主动脉血 管有舒 张作 用 的有效成分 。 方 法 : 采用 细胞膜 色谱 法 ( c M C ) 筛选 、 高效液相 色
谱法分 离 , 并 结合 离体药理 实验确 定 当归挥发油 中的有效成 分 。 结果 : 在当 归挥发 油 中分 离 出对主动脉血 管有舒张作 用
的 2 种有效成分 。 结论 : 化合物在血 管 CM C 模型 上的保 留特性和其 药理作 用有显著 的相 关性 。
关键词 : 生物 活性跟踪分 离 ; 细胞膜 色语 ; 当 归 ; 挥发 油 ; 有效成分
中图分类号 : R 9 2 7 文献标识码 : A 文章编号 : 1 0 0 8一 0 8 0 5 ( 2 0 0 5 ) 0 2一 0 1 1 2一 0 2
S e r e e n i n g t h e E f f e e t i v e C o n s t i t u e n t s i n E s s e n t i a l 0 11 o f A n g e l ica s i n e n s i s b y B i o a e t i v i t y 一
g u i d e d I s o l a t i o n
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C a n d t e 、 t if ie d b y p l l a r m a e o lo g ie a l t r ia l in v i t r o
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K e y w o r d s : B i o a e t i v i t y 一 g u id o d is o la t io n ; C e ll m e m b r a n e e e h r o m a t o g r a p h y ; A n召 e llc a s l’ ` e n , “ ; E S S e n t ia l o 一l ;
E f f e e t一v e e o n s t i t u e n t s
当 归 为伞 形 科 多 年 生 植物 当归 A , `g 亡zi c a s i n e 、 , 。 ( o li v . )
。 , l、 . 的干燥根 。 近代中药药理学研究表明 l[J , 当归具有扩 张血 管
和降压等作用 。而 当归挥发油为当归 中对血管有显著生理 活性的
有效部位曰 . 其含量仅 占 。 、 3% 、 但组成成分却十分复杂 。 应用经
典的天然药物提取分离方法确定其有效成分周期长 ,命中率相对
较低 。 细胞膜色谱法 ( C e ll M e m b r a n e。 C h r o m a t o g r a p l: y , c M e ) 〔3」
是一种新的生物亲和 色谱法 , 它能有效地将药 物体内作用过程在
体外进行模拟研究 , 该方法是 以 生物 活性分子间相互作用 为基
础 , 活性组分在 C M C 上 的保留具有特殊的药理学 意义 。 在特定
的 C M C 筛选 模型上 , 可在实验 的任何阶段及 时跟踪 分离产 物 ,
经药理实验验证 , 直接确 定中药中的某种活性成分 。 本筛选方法
快速 、 简捷 、 命中率高 。 本 实验报道用 CM C 模 型筛选 、 高效液相
色谱法分离与药理实验验证相结合的方法 , 确定当归挥发油中对
主动脉血管有舒张作用的有效成分 。
1 材料 、 仪器与试药
1
.
1 材料与仪器 薄层层析硅胶 G (6 。 型 , 中国青岛海洋化工集
团公司 ) , 葡 聚糖凝胶 S e p h a d e x L H 一 2 0 、 层析用硅胶 ( 1 0 0 一 2 0 0
目 , 上海五四化学试剂厂 ) 。 日本岛津高效液相色谱系列 (包括 L C
一 1 0 A 、 p 泵 、 s P D 一 M l o A v p 二极管阵列检测器 ) 以及色谱工作
站 ; 八 S s z s o A 超声振荡仪 ( A u t o 、 e i e n e e 公 司 ) ; S H Z一 9 5 型循环
水式多用真空泵 (河南巩义市英峪予华仪器 厂 ) 。 张力换能器 (上
海 医科大学第 一 医学院 ) ; X W T 一 4 64 型台式 自动 平衡记 录 仪
收稿 日期 : 2 0 0 4一 0 9一 10 ; 修订 日期 : 2 0 04 一 1 2一 2 0
作者简介 : 赵惠茄 (工97 2一 ) . 女 (汉族 ) . 陕 西 西 安人 , 现任陕 西 医学高等专
科学校讲师 硕士学往 . 主要从事中药鉴 定及有效成分的 质量控制研 究
工作 .
(上海大华仪器厂 ) 。
健康家兔 , 雌雄不 限 , 由西安交通大学 医学院实验动物中心
提供 。 取其胸主动脉制备细胞膜 。
1
.
2 试药 当归 (经西安交大药学系杨广德老师鉴定为 、如 g el 。 一 d
、 、 。 众 ( O h v . ) D ie 卜 . ) , 石 油醚 、 氯仿 、 醋酸 乙酷 、 甲醇 、 磷酸氢二
钠等均 为分析纯 。 甲醇 (色谱纯 , 深圳丛云科技有 限公 司 ) ;三重蒸
馏水 。 重酒石酸去 甲肾上 腺素注射液 (2 m g , 10 只 1 m l , 武汉制药
厂 ) ;盐酸维拉帕米片 ;氯化钠 (河南焦作市化工三 厂 ) ; 氯化 钾 (西
安化学 试剂厂 ) ;葡萄糖 (西 安化学试剂厂 ) ;氯化镁 (西安 化学 试
剂厂 ) ;氯化钙 (西安化学试剂厂 ) ; 三经 甲基氨基 甲烷 (北 京益利
精细化学品有限公 司 ) ; 氯化镁 (西安化学试剂 厂 ) ; 氯化钙 (西安
化学试剂厂 ) ;异丙醇 (西安 化玻站化学厂 ) 。 所用试剂均 为分析
纯 。
2 方法与结果
2
.
1 当归挥发油 (简写为 D G Y ) 的柱色谱法分离 以水蒸气蒸馏
法提取当归中的挥发油 , 以层析硅胶为填料 , 石油醚湿法装柱 , 用
洗脱液平衡 Z h 后 , 将当归挥发 油上 柱分离 , 采 用石油 醚 一醋酸
乙醋梯度下行洗脱方法 , 每 2 0 m l 收集一份洗脱液 , 回收溶剂 ,残
余物用 毗咤溶解 , 得到不 同极性 的分离样品 21 份 (依次编号 为
D G Y
一
l ~ D G Y
一
2 1 )
。
2
.
2 当归挥发油中不 同组分在血管细胞膜色谱固定 相柱上的保
留特性
2
.
2
,
1 固定相的制备 按照文献川方法 , 取健康家兔 I 只 , 颈 动
脉放血处死 , 迅速取胸主动脉 , 放人冰冷的生理 盐水中 , 剥去血管
及 脂肪 , 加适 量生理盐水匀浆 , 低 温 ( 4 C )离 心 10 m , n ( 1 70 o r /
m i
n
)
, 弃去沉淀 , 上清液于 4 C 离心 1 ( ) m in ( 1 ( ) () ( ) () r / n 、 i n ) , 沉淀
1 1 2
L ISH IZ H EN MD N E IC I E AN D M AT ER I A MD E IC AR E S ER A CH 2 0 0 5V OL
.
6 N 1 O
.
2 时珍 国医国药 2 0 0 5年第 16 卷第 2 期
加 土。 m ml ol /T r i s一 H CI缓冲液 ( p H = 7. 4 ), 超
声 1 (} m l n , 于 1 2 0 0 O r / m in 离心 l o m , n ,得到血
管细胞膜 按文献叼方法制备血管细胞膜固定
丰目。
2
.
2
.
2 不 同组分在血 管细胞膜色谱固定相柱
上的保留特性 将 D G Y 一 1一 D G Y一 2 1 分别 以
适量甲醇溶解 , 制备成供试品溶液 , 分别 吸取 5
~ l(J 川在兔血管细胞膜 固定相柱上 , 以 维拉帕
米 (简写为 V P )作为模 型药物 , 在 同样条件下 ,
依次注人血管细胞膜色谱柱分析 , 结果发现其
中 只有 2 个馏分 的样 品 (编号 为 D G Y 一 3 和
DG Y 一 4 )有类似于当归挥发油的保留特性 (见
图 1 ) ,而其它样 品均没有保 留 。 这就表明 : D G Y
一 3 和 D G Y 一 4 为当归挥发油中对血管细胞膜
及膜受体有作用的活性组分 。
别在 A , B 两峰的峰谷 、 峰腰和峰顶选取五点进行全波长 ( 190 一 80 0 n m ) 扫描 , 可见
D G Y 一 3 和 D G Y 一 4 只在紫外区有 吸收 。 在 它们各自的色谱图上 、 峰腰和峰顶 的
三点光谱图几乎完全重合 。 对组分 A 、 B 的进一步纯化 与结构鉴定正在进行中 。
2
.
4 组分 A , B 的药理 作用测定 以模 型药物维拉帕米 为对 照 , 对组分 A , B 进行
了离体动脉条药理实验 。 结果可见 ; 组分 A 对去 甲肾上腺素所诱发 的血管收缩有
显著的抑制作用 , 而组分 B 的抑制作用较弱 (见 图 3 ) 。 表 明组分 A 、 B 为当归挥发
油 中对主动脉血管有舒张作用的有效成分 。
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图 1 V P . D G Y一 3 和 D G Y 一 4 在免血管细胞
膜色谱模型上 的保 留特性
2
、
3 D G Y 一 3 和 D G Y 一 4 的高效液相色谱法
分离 以甲醇一水 (6 5 : 35 )作为流动相 , 流速 1 . 。
m l /m i
n , 检测波长 2 3 6 n m ;柱温为室温 。 在 O D S
柱 ( L ie h r o s o r b C l : 柱 , 1 5 0 m n1 X 4 . 6 m m , 5 拼m
粒径 )上 , 将 D G Y 一 3 、 D G Y一 4 和 D G Y 分别配
成 1(J 拼g / m l 的 甲醇溶液 , 各吸取 5 川 进样 , 结
果各样 品均可分离得到十 余个色谱峰 ,其中在
7
.
5 分和 8 . 5 分附近 , 3 个样 品各有 一色谱 峰
A
,
B 出现 (见图 2) 。 经计算得 出 : D G Y 中 A 的
含量为 71 . 5 4% , B 的含量为 20 . 85 % , D G Y 一 3
中 B 占 9 3 . 9 4线 , D G Y 一 4 中 A 占 9 2 , 5 9写 。 分
lg C / 19 / m g
·
L
」
图 3 组分 A 、 B 和 V P 对去甲肾上腺素所致动脉条收缩的抑制率
3 讨论
3
.
1 柱色谱分离条件的选择 实验中曾选用 4 种 固定相 和 5 种溶剂系统进行洗
脱 。 结果 可见 : 用薄层层析硅胶 G 作 固定相 , 分别 以石 油醚 、 氯仿 、 石油醚一醋酸 乙
醋做洗脱剂时 , 洗脱 速度慢 , 组分易扩散 ;用葡聚糖凝胶 S eP 八a d e x L H一 20 作 固定
相 , 甲醇为洗脱剂和用兔主动脉细胞膜作 固定相 , N a Z H P O 、 (P H 一 7 . 4 . 50 m m ol /
L ) 为洗脱剂时 ,样 品中各组分同时出柱 , 分离效果不好 ;用层析 硅胶作 固定 相 , 氯
仿洗脱时 , 样品拖尾严重 ;而选用层析硅胶作固定相 , 石油 醚一醋酸 乙醋梯 度洗脱 ,
分离效果较好 。
3
.
2 高效液相色谱条件的选择 考 虑到 当归 挥发 油极性小 的特点 , 选用 O D S 柱
CL l e h r o s o r b C l 。柱 、 1 5 0 m m X 4 . 6 m m , 5 拜rn 粒径 ) 、 曾选用甲醇一水 ( 8 0 , 2 0 ) , 甲醇
一水 (7 O : 3 0) 、 甲醇 一水 ( 65 : 3 5 ) 、 甲醇 一水 ( 60 : ,l0 )作为流 动相 。 可见 甲醇 比例增
大 , A 、 B 两峰不能完全分开 , 甲醇 比例减小 , A 、 B 两峰拖 尾且保 留时 间延长 , 而采
用 甲醇 一水 ( 6 5 : 3 5 )作为流动 相 , 流速 1 . 0 m l / m in . 可以 得到峰形较好且保 留时 间
适中的色谱图 ;检测波长 23 6 n m ;柱温 为室温 。
应用生物活性跟踪分离 的方法确定了 当归挥发 油中对 主动脉血管 有舒张作
用的有效成分 ,该方法灵敏 、快速 、 可靠 。 但是对于 中药的综合药理作用 ,还需通过
多种活性筛选模型来反映 。 对组分 A 、 B 的进一步 纯化 与结构鉴定正在进行 中 。
参考文献 :
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