全 文 ：用细胞膜色谱模型筛选长春七抑制 H e La细胞增殖的活性成分
张宇洁 , 贺浪冲 ` (西安交通大学医学院 ,陕西 西安 71肠 l)
摘要 : 目的 筛选药用植物长春七中具有细胞毒性作用的活性成分 。 方法 用细胞膜色语模型 , 筛选条件 : 红细胞膜色谱柱
(50 ~
x Z
ln )
, 流动相为三蒸水 , 柱温 37 ℃ , 检测波长 24 nm , 流速 O Z mIJ · 而 n 一 ` , 以 阿霉素为付照进行筛选 ;对筛选得到的
活性成分用紫外 、 红外和质谱方 法测定结构 , 并与文献数据比较确定为蛇床子素 ;并用 M T I, 法测定 了其对 eH u 细胞增殖的抑
制作用 。 结果 长春七所含蛇床子素在红细胞膜色谱模型 系统中 , 具有类似于阿霉素的保留特性 ; 蛇床子素可抑制 H e l丑 细胞
增殖 , 且随着浓度增加 而抑制作用增强 , 最大抑制率达 76 . 6 % ,半数抑制浓度为 or . o 一 1 1 . 0 陀 · mL 一 ’ 。 结论 红细胞膜色语模
型可用于筛选药用植物 中的细胞毒性成分 , 长春七所含蛇床子素能够作用于红细胞膜及膜蛋白表面 , 并对 H e l a 细胞增殖有较
强的抑制作用 。
关键词 : 细胞膜色谱法 ; 长春七 ;蛇床子素 ; 1 1e U 细胞
中图分类号 : R石5 7 . 7 文献标识码 : A 文章编号 : 10 1 一 , 叫 (2X(j 5 )肠 一 以 63 一 03
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长春七为伞形科岩风属植物长春七 ( 几6毋汉兀 is
bue tho
~
is) 的干燥根 ,性温 , 味辛 、甘 ,具有祛风散
寒 ,活血止痛的功效 。 长春七 中的中性油和酚酸具
有镇痛 、镇静作用 , 中性油还有一定解热和抗关节炎
作用川 。 有研究表明 ,用细胞膜作为抗癌药物的筛
选靶标川 , 部分具有非特异性的抗肿瘤药物与红细
胞膜及其膜蛋白的作用有一定的选择性〔3 一 4 1 , 并与
抗肿瘤活性有一定的相关性 。 本实验利用细胞膜色
谱 ( e e l l m e mb aner c h or l n a to脚p h y
,
e M e )模型 [ , 一 7 ] , 用
兔血红细胞膜固定相 , 以阿霉素为对照药物 ,筛选长
春七中与红细胞膜及膜蛋 白有亲和作用 的活性成
分 ,并用 M T T实验法对活性成分抑制 eH肠 细胞增
殖作用进行了分析 。
1 材 料
1
.
1 仪器 与试药
hS im
a 〔h u 高效液相系统 , 包括 CL 一 10A T甲 色谱
泵 , Sp D 一 10 A叩 紫外检测器 ( 日本岛津公司 ;) AN A S -
AT R 色谱工作站 (天津东康科技有限公司 ) ; D5G 0 31
型酶联免疫检测仪 (南京华东电子集团股份有限公
司 ) 。
irT
s 一H CI (上海三浦化工有限公司 ) ;氯化钾 , 氯
化钠 ,硫酸镁 ,二甲基亚矾 ( D M S o) 等均为分析纯 ;三
重蒸馏水 ;柱色谱 、薄层色谱硅胶 (中国青岛海洋化
工集团 ) 。
Bp M I
一
1翻 0 培养基 ( U fe eT c h n 0 1iog cs 公司 ) ;小牛
血清 (杭州四季青公司 ) ;唾哇蓝 ( M IT ,美国 is g rn a 公
苍金项目: 国家自然科学基金资助项目 ( 2X( 刀5 03(j ,刃 37 17 34 )
作者简介 : 张宇洁 , 女 ,硕士研究生 “ 通讯作者 :贺浪冲 ,教授 ,博士生导师 elT : (能 9 ) 8 26 554 5 l E一画 l : hel c @ 几面 l . xj ut ,咖 . cn
中国药学杂志 2X() 5 年 3 月第 4O 卷第 6 期 hC 认 外“ 斤几 J , 2侧乃 赫又几大 , 肠2. 40 No . 6 · 4 6 3
司 ) ; 阿霉素 (明治医药有限公司 ) 。
长春七药材 ,采自陕西秦巴山区太白县 ,经西安
交通大学药学院生药学教研室王军宪鉴定为长春七
〔幼 a ,。 t站 b ue l入口 ir n记 n , is ( iF s e h . ) D C . 〕。
1
.
2 动物
健康大耳白兔 , 体重 1 . 8 一 2 . 0 k g (西安交通大
学动物实验中心 ) 。
1
.
3 细胞株
人宫颈癌细胞株 eH 肠细胞 (中国科学院上海细
胞研究所 ) 。
2 方法与结果
2
.
1 活性部位 的筛选
2
.
1
.
1 筛选条件 自制红细胞膜色谱柱 ( 50 ~ x Z
~ )
上8几流动相 : 三蒸水 ; 柱温 : 37 ℃ ;检测波长 :州
nI
;流速 : 0 . 2 mL
·
ha n
一 ’ ;平衡 1 . 0 h 后进样分析 。
2
.
1
.
2 供试品溶液制备 取长春七药粉适量 (约 1
吨 ) , 95 % 乙醇回流提取 3 次 ,每次 Z h ,合并提取液 ,
回收乙醇得提取物 。 提取物加适量水分散后 ,依次
用石油醚 、 乙醚 、醋酸乙醋 、 正丁醇萃取 ,包括母液共
得到 5 个不同极性的萃取部位 ,用 c c Q一A , c c Q一 B ,
c c Q
一
c
,
c c Q
一
D
,
c c Q
一
E 表示 。 分别取各萃取部位适
量 , 甲醇溶解 、离心 , 上清液作为供试品溶液 。
2
.
1
.
3 筛选结果 在上述 “ 筛选条件 ” 下 , 以阿霉素
为对照药物 , 分别吸取各供试品溶液 5 汕 进样分
析 ,结果发现 c CQ一 A 和阿霉素有类似的色谱保留特
性 ,见图 1 ,表明 CCQ一A 中含有与红细胞膜及膜蛋白
有作用的活性组分 。
个纯化合物 , 记作 C C令sA o 。 同法对 c cQ一 lA 一 Ag
进行 c M c 筛选 。 结果发现 c CQ一5A 和 c CQ一 sA o 在
柱上有保留 ,见图 2 ,表明 C CQ一 5A 0 是与红细胞膜及
膜蛋白有作用的活性成分 。
图 1 阿霉素 ( A ) , CC令A ( B) 在 R B CMC 柱上的保留色谱图
l 一 阿霉素保留峰 ; 2 一 C C令A保留峰
月 9 1 C I川 J n坦句邵明巧 of a 《 lir bl as it ne ( A )山】d C C令A ( B ) on ht e
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l 一 re le int 叨 l” 欧 of a山 bl朋 Iine ; 2 一 re te 川oln l犯 ak of C CQ月 A
2
.
2 活性成分的筛选
对 C CQ一 (A 约 or g )进行硅胶柱色谱分离 ,用石
油醚 一乙醚梯度洗脱 , 薄层色谱检识收集的洗脱液 ,
获得洗脱样品 9 份 , 分别用 c c Q一A I 一 Ag 表示 。 其
中 C CQ一A S 有晶体析出 , 经过反复重结晶步骤后 , 纯
化得到一 白色针状结晶 , 用薄层色谱 3 种不 同展开
剂展开分析 ,均为一个蓝紫色荧光色斑点 ,认为是一
·
4 64
·
hC 认 月钻加 J , 2厌万 J和乞诚 ,脚 . 40 oN . 吞
图 2 c c令5A ( A )和 c c令A 50 ( B) 在 BR MC c 柱上的保留色谱
图
l 一 c CQ
一
5A 保留峰 ;2 一 CCQ, A , 保留峰
扔 9 Z C肠or阳 tr 〕gr 阴 15 of CCQ一 5A ( )A a n d CCQ 一 5A 0( )B on het
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1一 , 月曰” j二 p姐 k J C C令5A浮 一 , et n幻朋 户公 of C (:母 A久〕
2
.
3 活性成分的结构鉴定
c c Q
一
sA o 为白色针晶 , mP 82 一 83 ℃ ; VU , IR , M S
数据与文献侧报道的蛇床子素数据一致 , 确定该成
分为蛇床子素 。
.2 4 细胞毒性实验
取 C CQ一5A 0( 蛇床子素 )适量用 75 % 乙醇助溶 ,
R p M L 164 0 培养基稀释 , 使培养板不同药物终度分
别为 5 , 6 . 2 , 12 . 5 , 25 . 0 , 50 . 0 , 10 . 0 路 · mL 一 ` , 且乙醇
的终浓度低于 1 . 0 % [’。 J。 阿霉素作为阳性对照 药
物 ,溶媒 ( 1 . 0 % 乙醇 )为阴性对照 ,采用 M TT 法 (四
氮哩盐比色法 ) 。 取对数期生长的细胞 , 0 . 25 % 的胰
酶消化 3 一 5 而 n , 吹打成均匀的细胞悬液图 ,加人 %
孔培养板 , 每孔约 1 x l护个细胞 , 培养 24 h 后加人
受试药物 ,每个浓度设 6 个复孔 ,并以培养液设空白
对照孔 。 37℃ , 5% COZ 培养 4 s h 后 , 加人 5 毗 · mL 一 ’
M竹工作液 20 匹 ,混匀 , 37 ℃孵育 4 h 。 取出小心吸
去培养液 ,每孔加人 20 拜L DM so ,振荡 or 而 n ,酶联
免疫检测仪 于 570 mn 处 测定 各孔 A 值 。 抑制
率% = (对照组 A 值 一 药敏组 A 值 ) / (对照组 A
值 一 空白组 A 值 ) x 10 % ,并绘制药物浓度 一抑制率
曲线 ,求半数抑制浓度 ( I蝙 ) 。
结果表明 ,蛇床子素能明显抑制 H e肠 细胞的增
殖 ,最大抑制率达 76 . 6% , 半数抑制浓度为 or . 0 -
1
.
0 鸿 · mL 一 ’ ,抑制率曲线见图 3 。
3 讨 论
细胞膜色谱是一种新型的亲合色谱法 ,将其用
于新药研究中 , 具有筛选速度快 , 效率高 , 可反映药
物分子与蛋白受体作用特性的优点 。 由于红细胞膜
的脂质含量高 ,本实验选用红细胞膜色谱法筛选药
物 ,快速定位 , 所用兔红细胞膜固定相系根据文献
币画两孚薪歌骊函燕涯嚎丽甭漂不丽
H PL C 同时测定复方布洛芬软胶囊中布洛芬 、 对乙酞氨基酚的含量
张宏武 ,郭文敏 ` , 杨汉煌 , 李云立 , 张莉 ,周桂荣 (石药集 团中奇制药技术 (石家庄 )有限公司 ,河北 石家庄 05 05 1 )
摘要 : 目的 采用高效液相 色谱法 同时测定复方布洛芬软胶囊中布洛芬和对 乙酞氨基酚的含量 。 方法 采用氰基色谱柱 , 以
磷酸盐缓冲液 ( p H 6 6卜甲醇 (印 : o4 )为流动相 , 流速为 1 . 0 m l ·而 n 一 ’ , 检侧波长为 223 nl , 柱温 30 ℃ , 外标 法测 定 。 结果 布洛
芬和对 乙酞氨基酚与 已知杂质叶氛基酚 、 对氯苯乙酞胺之间能够达到很好分离 ,理论板数以对 乙酞氨基酚峰计为 12 6% , 以布
洛芬峰计为 4 18 ;布洛芬的线性范围为 0 . 21 一 124 、 86 华答 n让 一 ’ , 厂 = 。 .卯 9 9 ( 。 = 9) , 平均 回收率为 9 . 80 % , sH D = o 、 26 % ; 对乙
酞氨基酚的线性范围为 0 . 17 一 l( ” . 14 滩 ·撇 J 一 ’ , : = 0 . 99 9 ( n = 9) , 平均 回收率为 9 . 82 % , sR D = 0 . 28 % ; 两组分精密度分别为
0
.
31 % 和 0 . 36 % , 结果 良好 。 结论 该法能够同时准确侧定两组分的含量 , 而且简便 、准确 、快速 , 可用于批次样品的含量测定
及质量控制 。
关键词 : 布洛芬 ; 对 乙酞氨基酚 ;软胶囊 ; 含量侧定 ;高效液相色谱法
中图分类号 : 9R 27 文献标识码 : A 文章编号 : 10 1 一 24 94( 2〕 ) 5 )既 - 《州吃5 一 03
1死 t e n 刘in a it on of i b叩 r o fe n a n d aP r a c e加nL 10 1 in os ft ca 哪u 】es b y H P L C
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l`玻 ) ( 月弘如创于“朋召 ) oC . ,加 , 从乒硬翻之。 咭 05 05 1 , hC 乙na )
月昭 T R A C I , : ( ) B J E C T I V E 『l份, e s thal l s h a 】I P C m e ht 记 fo : th e d e t e n in an t i o n of ib u p or l论n a l l d l〕a r a ` e t田 1〕 0 1 in 5 0 1) e聊沮 e s . ME[ T HO D 6
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图 3 不 同浓度蛇床 子素对 H e[ , 细胞的体外抑制率 . n 二 3
月 9 3 Ihn ib iot 尽 ar te ` fj o s ht o l a t d汪卜, 1 )n t eocn e n 。妞 t j朋 on ht o pm
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l流面 io n of H e恤 c e l . 几 = 3
阶 7 ]方法 自行制备 。 我们从秦巴山区特有药材长春
七中初步筛选出儿种可能具有细胞毒性的成分 , 并
对其中的蛇床子素结合 M T’ 比色法进行 了药效学
研究 , 表明其对肿瘤细胞有一定的抑制杀伤作用 。
活细胞的代谢水平与 ND A 合成水平呈平行关
系 ,活细胞线粒体脱氢酶能将黄色的 M T’ 还原成蓝
紫色的甲瞪 ,死细胞则无此能力 。 因此可用 M I T 还
原产物 比色法推测待检样品内细胞的死亡和增殖程
度 。 目前国内外已将此法广泛应用于化疗药敏实验
及抗癌新药筛选工作 。
被研究药物长春七通过细胞膜色谱法的跟踪分
离筛选 ,得到的蛇床子素是活性成分 ,在蛇床子素的
M rT 实验中 , 阴性组的细胞呈梭形或不规则形 ,贴壁
生长 。 加药组的细胞形态发生改变 ,光镜下可见细
胞逐渐变圆固缩 , 间隙加大 ,有凋亡小体出现 ,呈 明
显的细胞凋亡形态 ,且随浓度增高这种现象越明显 。
其半数抑制率在 10 一 1 1路 · rnL 一 `内。 实验表明红细
胞膜色谱法筛选结果与药理作用之间存在较好的相
关性 ,因此可以利用此模型对大量的天然药用植物
进行快速筛选 , 以促进细胞毒性候选药物的开发 。
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[ 7 ] H
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作者简介 : 张宏武 ,男 ,硕士 ’ 通讯作者 : 郭文敏 , 女 , 硕士 eT l : ( 0 3 1 1 )7 896 85 2 E一~ 卜 C抽 】哪 1.@ yha 侧 〕 . c om . cn
中国药学杂志 2〕 巧年 3 月第如 卷第 6 期 hC 讯 子叩k 艺n 了, 2亡兀巧 乍轰砚八大 , l b l . 40 入d . 6 · 46 5