全 文 ：第 33 卷第 1 期
Vol． 33，No． 1
草 业 科 学
PRATACULTURAL SCIENCE
75-85
1 /2016
http:cykx． lzu． edu． cn
DOI:10． 11829 / j． issn． 1001-0629． 2015-0266
郭云，王铁梅．基于 RNA-Seq技术的苜蓿根蘖性状发生相关下调基因．草业科学，2016，33(1) :75-85．
Guo Y，Wang T M． The down regulated genes related with creeping-rooted characteristics of alfalfa based on the RNA-seq． Pratacultural Sci-
ence，2016，33(1) :
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75-85．
植物
生产层
基于 RNA-Seq技术的苜蓿根蘖性状
发生相关下调基因
郭 云1，王铁梅1，2
(1．北京林业大学林学院，北京 100083;2．北京林业大学草地资源与生态研究中心，北京 100083)
摘要:为了从分子水平上分析苜蓿(Medicago sativa)根蘖性状的发生机制，对根蘖型苜蓿的根蘖与非根蘖根部进行
RNA-seq转录组文库构建，并分析差异表达基因及其功能。分别提取品系“BL-101”的根蘖型苜蓿根蘖与非根蘖部位总
RNA，利用磁珠法分离 mRNA后通过 PCR扩增构建 RNA-Seq转录组文库，并对差异表达基因进行分析，得到差异表达
基因 15 978 条，本研究重点分析下调基因，通过生物过程分类，发现与根蘖性状发生有关的表达下调的基因为 5 个，经
生物学信息分析确定，其中 2 个属于 Lon蛋白酶家族，其余分别属于植物肌动蛋白酶家族，硫氧还蛋白和脂氧合酶，其
与植物抗逆性相关，且与植物激素 ABA的调控有关。研究结果可以为探讨苜蓿根蘖性状发生的分子机制提供理论依
据。
关键词:苜蓿;根系生长;生物信息学;脱落酸
中图分类号:S551+ ． 703;Q943． 2 文献标识码:A 文章编号:1001-0629(2016)1-0075-11*
The down regulated genes related with creeping-rooted
characteristics of alfalfa based on the RNA-seq
Guo Yun1，Wang Tie-mei1，2
(1． College of Forestry，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China;
2． Grassland Resources and Ecology Research Center of Beijing Forestry University，Beijing 100083，China)
Abstract:In order to understand the mechanism of alfalfa creeping-rooted characteristics at the molecular level，the
transcriptome library of non creeping-rooted parts and the creeping-rooted parts of alfalfa variety“BL-101”with creep-
ing-rooted characteristics were constructed and the differentially expressed genes and their functions were analyzed． The
results showed that there were totally 15 978 differentially expressed genes，including five down regulated genes involved
in the biological rooting processes． For these 5 genes，2 genes belonged to Lon protease family which associated with the
regulation of plant hormone ABA and the other 3 genes belong to plant actin protease family，thioredoxin and lipoxygen-
ase，respectively． These results could provid the theory basis to understand the molecular mechanism of creeping-rooted
characteristics．
Key words:alfalfa;root growth;information biology;ABA
Corresponding author:Wang Tie-mei E-mail:alfalfa@ 126． com
* 收稿日期:2015-05-08 接受日期:2015-10-09
基金项目:国家自然科学基金———基于 RNA-seq技术的苜蓿根蘖性状发生分子机制研究(31201843) ;北京林业大学校级大学生创新项目———
基于 RNA-seq技术的苜蓿根蘖性状发生分子机制的研究(X201410022009)
第一作者:郭云(1993-) ，女，浙江嘉兴人，在读本科生，主要从事牧草种质资源研究。E-mail:guoyun199310@ 163． com
通信作者:王铁梅(1981-) ，女，四川内江人，讲师，博士，主要从事牧草遗传资源与育种。E-mail:alfalfa@ 126． com
草 业 科 学 第 33 卷
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苜蓿(Medicago sativa)作为牧草之王，是当前生态
建设中应用最为广泛的生态草之一［1］。在形态学方
面，根蘖型苜蓿与普通紫花苜蓿相比，主根上会生长出
很多侧生水平根，在侧根上会有膨大根蘖节，这些根蘖
节距离不等且可以形成新芽继而长出地面形成新的枝
条，因此根蘖性状的根系分布更广［2］。研究表明，根
蘖性状具有优良的抗寒性［3-5］、耐牧性［6-8］、耐旱性。
近年来，国内外学者对于苜蓿发生根蘖性状的机理取
得了较多的成果。在形态发生机制方面，根蘖与非根
蘖苜蓿在水平根上根蘖节的数量上比较，根蘖性状的
节数显著高于非根蘖性状;根蘖苜蓿在水平根上存在
原生丘状组织，而非根蘖苜蓿没有该原生丘状组
织［9］。在生理机制方面，通过测定根系酯酶及内源激
素含量动态得出酯酶同工酶可能与苜蓿调控发生根蘖
性状的基因表达有关;但对于苜蓿根蘖与非根蘖苜蓿
性状的遗传差异仍然缺少分子水平的研究［10］。因此，
通过对根蘖部位与非根蘖部位的差异表达基因筛选分
析进行功能预测，得出可能与苜蓿根蘖性状发生有关
的基因，以期为探讨苜蓿根蘖性状发生的分子机制提
供理论依据。
转录组是指某一细胞在特定发育阶段或者生理条
件下全部基因表达的总和，表示了每一个基因在该状
态下的身份和表达水平［11］，包括编码蛋白的 mRNA和
非编码蛋白的 RNA，是基因组遗传信息与蛋白质组的
生物功能之间的桥梁［12］。转录组研究是研究结构及
基因功能的基础，而转录组在揭示基因组中的功能元
件中是必需的［13］。随着高通量测序技术的快速发展，
RNA测序(RNA-seq)将是转录组学中一个重要的技
术手段。
RNA-seq 技术是新崛起的转录组学研究技术［14］。
该技术可以对数百万个 DNA 分子同时进行测序［15］，
这使得对一个物种的转录组或基因组进行细致地分析
成为可能［16］，是具有里程碑意义的技术。高通量测序
有三大优点，第一是其利用芯片测序可以在百万个点
上同时阅读测序，第二是其具有完美的定量功能，第三
是价格低廉［15］。早有较多学者还基于 RNA-Seq 技术
用来研究不同基因的差异表达。Zhang 等［17］以水稻
(Oryza sativa)愈伤组织、根尖、茎尖等为材料进行转录
组测序，Jiao 等［18］使用高通量测序分析玉米(Zea
mays)叶片的转录组，均十分成功。
为了从分子水平理解苜蓿根蘖性状的发生机制，
本研究对苜蓿根蘖部位与非根蘖部位进行了 RNA-Seq
测序，对与根系相关差异表达基因进行生物学信息分
析，希望从分子角度把握与根蘖发生性状的基因。
1 试验材料与方法
1． 1 材料和主要试剂
试验材料选用品种品系为“BL-101”的根蘖型苜
蓿，于根糵性状表达最明显的生育期进行取样，植株年
龄为 3 年。“BL-101”品系是一种新品系，种植于北京
林业大学草业科学系顺义苜蓿试验基地，为单株种植。
采用混合取样，分别挖取 5 株表现出根蘖性状植株的
根蘖芽和根蘖节之间的部分与未表现根蘖性状的植株
的水平根。
主要试剂为 PolyA Tracted mRNA Isolation System
3 (Promega 公司)、Clontech PCR-SelectTM cDNA Sub-
traction Kit(北京科百奥生物技术有限公司)和 Trizol
Reagent (天根生化公司) ，其余的化学试剂是国产的
分析纯。
分别提取根蘖性状与非根蘖性状根部的总 RNA
来构建转录组基因文库，然后进行测序，对庞大的表达
上下调的基因表达量数据进行分析，通过生物信息学
分析确定基因功能，找到与根蘖性状发生的基因。
1． 2 试验方法
本试验采用 Trizol 试剂方法提取苜蓿根部总
RNA，使用 1% 琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测
RNA的浓度和纯度。采用磁珠法分离 mRNA，以 mR-
NA为模板，用六碱基随机引物合成第 1 条cDNA链，随
后加入缓冲液、RNase、dNTPs 和 DNA polymerase Ⅰ双
链 cDNA链。经试剂盒纯化并加 EB 缓冲液洗脱之后
做末端修复并加 Poly(A)连接测序接头，回收目的片
段进行 PCR扩增，获得完整文库。采用高通量测序方
法进行测序。通过 BLAST 等［19-20］网站、Gene Ontolo-
gy［21-22］功能显著性富集分析以及 DNAMAN 生物信息
学软件对基因序列检测并进行生物信息学分析。
2 结果与分析
2． 1 表达差异的下调基因
在根蘖与非根蘖测序后，表达下调的基因及其表
达差异倍数、同源性比对如表 1 所示。
得到差异表达量最高的是细胞色素和硫氧还蛋
白。将上述表达下调的基因按参与生物过程分类，差
异表达基因中其中 9 个为未知的功能基因，其他已知
功能基因中主要包括硫氧还蛋白、蛋白激酶、天冬酰胺
合成酶、依赖 ATP的蛋白质和脂氧合酶等。差异表达
显著的功能为 8 类，大部分基因功能与抗逆性、信号传
导有关，具体如表 2 所示。
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第 1 期 郭 云 等:基于 RNA-Seq技术的苜蓿根蘖性状发生相关下调基因
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表 1 根系相关表达下调基因分析表
Table 1 Analysis of down regulated gene related with root tissue (CR/NCR)
序号
Gene
number
基因 ID
Gene ID
非根蘖
表达量
NCR-RPK
M
根蘖中
表达量
CR-RPK
M
表达量
差异倍数
log2 Ratio
(CR/NCR)
同源性比对
Blast nr
1 gnl |UG |Mtr#S5343678 11． 63 0． 39 －4． 89
原名:细胞色素 P45071D9;替换名:细胞色素
P450 CP3
RecName: Full = CytochromeP45071D9; Alt-
Name:Full =Cytochrome P450 CP3
2 gnl |UG |Mtr#S5346888 10． 74 0． 73 －3． 89
细胞色素 P450 单氧酶 CYP71D64［蒺藜苜蓿］
Cytochrome P450 monooxygenase CYP71D64
［Medicago truncatula］
3 gnl |UG |Mtr#S5343205 38． 61 2． 82 －3． 77 硫氧还蛋白
h7［蒺藜苜蓿］
Thioredoxin h7［Medicago truncatula］
4 gnl |UG |Mtr#S22892404 9． 043 0． 81 －3． 49
海藻糖磷酸磷酸酶［紫花苜蓿］
Trehalose-6-phosphate phosphatase［Medicago sa-
tiva］
5 gnl |UG |Mtr#S22894179 11． 60 1． 23 －3． 24 周期蛋白类似物
［蒺藜苜蓿］
Cyclin-like F-box［Medicago truncatula］
6 gnl |UG |Mtr#S5343150 54． 26 6． 84 －2． 99 未知
［西红柿］
Unknown［Solanum lycopersicum］
7 gnl |UG |Mtr#S5343555 34． 53 6． 09 －2． 50 －
8 gnl |UG |Mtr#S5345670 9 548． 00 1 845． 80 －2． 37 －
9 gnl |UG |Mtr#S5310703 21． 50 5． 20 －2． 05 －
10 gnl |UG |Mtr#S5311976 21． 31 5． 69 －1． 90 预测蛋白
［毛果杨］
Predicted protein［Populus trichocarpa］
11 gnl |UG |Mtr#S2289203 69． 27 21． 57 －1． 68 组氨酸激酶
1［白羽扇豆］
Histidine kinase 1［Lupinus albus］
12 gnl |UG |Mtr#S5342067 57． 06 21． 03 －1． 44
大豆脂氧合酶-B的晶体结构，链 A
Chain A，Crystal structure of Soybean Lipoxygen-
ase-B
13 gnl |UG |Mtr#S22895426 87． 36 32． 71 －1． 42 未知
［西红柿］
Unknown［Solanum lycopersicum］
14 gnl |UG |Mtr#S22894624 146． 70 56． 26 －1． 38 未命名蛋白产物
［葡萄］
Unnamed protein product［Vitis vinifera］
15 gnl |UG |Mtr#S22895025 128． 00 50． 31 －1． 35
PWWP域［蒺藜苜蓿］
PWWP［Medicago truncatula］
16 gnl |UG |Mtr#S5372550 53． 52 21． 26 －1． 33
公认的依赖 ATP的蛋白质 La［蓖麻］
ATP-dependent protease La， putative［Ricinus
communis］
17 gnl |UG |Mtr#S5342849 346． 90 138． 88 －1． 32 －
18 gnl |UG |Mtr#S22318361 34． 69 14． 84 －1． 23 硝酸还原酶
［大豆］
Nitrate reductase［Glycine max］
19 gnl |UG |Mtr#S5342972 172． 90 76． 49 －1． 18
公认的泛素连接酶 E3［蓖麻］
E3 ubiquitin protein ligase up12，putative［Rici-
nus communis］
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草 业 科 学 第 33 卷
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续表 1
序号
Gene
number
基因 ID
Gene ID
非根蘖
表达量
NCR-RPK
M
根蘖中
表达量
CR-RPK
M
表达量
差异倍数
log2 Ratio
(CR/NCR)
同源性比对
Blast nr
20 gnl |UG |Mtr#S5345250 99． 17 44． 23 －1． 16 未知
［水稻］
Unknown［Glycine max］
21 gnl |UG |Mtr#S31825440 243． 90 109． 32 －1． 16
原名:根系，天冬酰胺合成酶［谷氨酰胺水解］;
替换名:谷氨酰胺依赖的天冬酰胺合成酶
Recname:Full =Asparagine synthetase，root［glu-
tamine-hydrolyzing］ AltName:Full = Glutamine-
dependent asparagine synthetase
22 gnl |UG |Mtr#S5424404 56． 53 25． 37 －1． 16 未知蛋白
［鹰嘴豆］
Unknown protein［Cicer arietinum］
23 gnl |UG |Mtr#S5338024 146． 00 65． 63 －1． 15
原名:根系，天冬酰胺合成酶［谷氨酰胺水解］;
替换名:谷氨酰胺依赖的天冬酰胺合成酶 Rec-
Name:Full = Asparagine synthetase，root［gluta-
mine-hydrolyzing］AltName:Full = Glutamine-de-
pendent asparagine synthetase
24 gnl |UG |Mtr#S5348324 127． 80 59． 60 －1． 10 半胱氨酸蛋白酶
［紫花苜蓿］
Cysteine protease［Medicago sativa］
25 gnl |UG |Mtr#S5343006 525． 30 252． 56 －1． 06 脂氧合酶
LOXN3［豌豆］
Lipoxygenase LOXN3［Pisum sativum］
26 gnl |UG |Mtr#S22895877 122． 20 59． 01 －1． 05 不溶性冷球蛋白
［蒺藜苜蓿］
Cig3，related［Medicago truncatula］
27 gnl |UG |Mtr#S22893368 223． 90 108． 75 －1． 04
钙调素结合蛋白［玉山筷子芥］
Calmodulin-binding protein ［Arabidopsis lyrata
subsp． lyrata］
28 gnl |UG |Mtr#S7095310 62． 75 30． 89 －1． 02
公认的依赖 ATP的蛋白质 La［蓖麻］
ATP-dependent protease La，putative ［Ricinus
communis］
29 gnl |UG |Mtr#S5343182 41． 82 20． 91 －1． 00
丝氨酸 /睾丸特异性丝氨酸蛋白磷酸酶和 bis
(5-nucleosyl)-四磷酸酶［紫花苜蓿］
Serine / threonine-specific protein phosphatase and
bis (5-nucleosyl )-tetraphosphatase ［Medicago
truncatula］
2． 2 5 个下调基因的生物学分析
通过 Blast基因功能分析，29 个下调基因，得出可
能与根系生长有关的基因有 5 个，基因 ID分别为 gnl |
UG |Mtr#S7095310，gnl |UG |Mtr#S5424404，gnl |UG |Mtr
#S5372550，gnl | UG | Mtr#S5343205 和 gnl | UG | Mtr #
S5342067。将这 5 个与根蘖相关的表达下调基因通过
同源性对比和生物信息学分析从而推测其功能。
2． 2． 1 gnl | UG | Mtr#S7095310 基因的序列分析与功
能预测 通过美国国立生物技术信息中心(National
Center for Biotechnology Information，NCBI)网站的
Blastx 比对功能，基因gnl | UG | Mtr#S7095310同源
表 2 表达下调基因的差异基因主要功能分类
Table 2 Classification of gene function in
difference cut genes expression
功能分类
Classification of gene function
基因数目
The number of gene
抗逆性 Defence 8
能量代谢 Energy 3
转录作用 Transcription 1
信号传导 Signal transduction 4
氮代谢 Nitrogen metabolism 1
免疫方面 Immunity 1
Lon蛋白酶 Lon protease 2
未知蛋白 Unknown 9
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性分别与鹰嘴豆、菜豆、大豆、蒺藜苜蓿、牵牛花、麻风
树相同，同源百分比为 37%(表 3)。且运用 DNAMAN
软件将目的基因与这些基因进行比对，总体相似度为
69． 15%，该基因属于 Lon蛋白酶基因家族。此外对目
的基因进行蛋白结构域分析，结果也表明其为 Lon 蛋
白酶。Lon 蛋白酶是一类依赖 ATP 的丝氨酸蛋白酶，
广泛分布于原核生物和真核生物的丝氨酸类型蛋白
酶，属于 AAA 蛋白酶超家族。
2． 2． 2 gnl | UG | Mtr#S5372550 基因的序列分析与功
能预测 通过 NCBI 网站的 Blastx 比对功能，对 gnl |
UG |Mtr#S5372550 基因进行同源性对比，同源性最高
的是豌豆、蒺藜苜蓿和鹰嘴豆，其次是长喙田菁、菜豆、
大豆、麻风树(表 4)。运用 DNAMAN软件将目的基因
与这些基因进行比对，总体相似度为 70． 14%。在上
述植物中同源性较高的都是果胶酯酶，但是利用 Inter-
ProScan软件对其基因编码的蛋白结构域进行分析，结
果表明，该基因属于 Lon 蛋白酶家族和依赖 ATP的蛋
白酶，即与基因 gnl |UG |Mtr#S7095310 的功能相类似。
2． 2． 3 gnl | UG | Mtr#S5424404 基因的序列分析与功
能预测 通过 NCBI 网站的 Blastx 比对功能，对 gnl |
UG |Mtr#S5424404 基因进行同源性对比，与鹰嘴豆、
表 3 gnl | UG |Mtr#S7095310 基因 Blastx同源性对比分析
Table 3 Homology comparison analysis of gnl | UG |Mtr# S7095310 gene
基因收录号
Accession
描述
Description
同源百分比
Query coverage /%
XP_004511756． 1
Lon蛋白，过氧化物酶［鹰嘴豆］
PREDICTED:lon protease homolog 2，peroxisomal-like［Cicer arietinum］
37
XP_007155738． 1 假定蛋白
［菜豆］
Jypothetical protein PHAVU_003G2274000g［Phaseolus vulgaris］
37
XP_003524333． 1
Lon蛋白，过氧化物酶［大豆］
PREDICTED:lon protease homolog 2，peroxisomal-like［Glycine max］
37
KEH31576． 1
Lon蛋白［蒺藜苜蓿］
lon-related ATP-dependent protease，putative［Medicago truncatula］
37
EPS62878． 1
Lon蛋白［牵牛花］
ATP-dependent Lon protease［Ipomoea nil］
37
KDP45972． 1 假定蛋白
［麻风树］
Hypothetical protein JCGZ_11875［Jatropha curcas］
37
XP_003611421． 1
Lon蛋白［蒺藜苜蓿］
Lon protease-like protein［Medicago truncatula］
37
表 4 gnl | UG |Mtr#S5372550 基因 Blastx同源性对比分析
Table 4 Homology comparison analysis of gnl | UG |Mtr# S5372550 gene
基因收录号
Accession
描述
Description
同源百分比
Query coverage /%
BAC67662． 1 果胶甲酯酶［豌豆］Pectin methylesterase［Pisum sativum］ 94
XP_003622688． 1 果胶酯酶［蒺藜苜蓿］Pectinesterase［Medicago truncatula］ 94
XP_004492228． 1 果胶酯酶［鹰嘴豆］Pectinesterase 2． 1-like［Cicer arietinum］ 94
CAD29733． 1 果胶酯酶［长喙田菁］Pectin methylesterase［Sesbania rostrata］ 89
XP_006573891． 1 果胶酯酶
/果胶酯酶抑制剂［大豆］
Pectinesterase /pectinesterase inhibitor 18-like［Glycine max］
83
XP_007157170． 1 假定蛋白
［菜豆］
Hypothetical protein PHAVU_002G048500g［Phaseolus vulgaris］
89
KDP20786． 1 假定蛋白［麻风树］Hypothetical protein JCGZ_21257［Jatropha curcas］ 75
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大豆、菜豆、可可树、碧桃、梅的同源性均为 49%(表
5) ，其中在可可树中发现为 ACT结构域。其属于一种
肌动蛋白，保守性很高，由 377 个氨基酸残基组成。且
运用 DNAMAN软件将目的基因进行与上述基因比对，
总体的相似性为 67． 23%，同时利用 InterProScan 软件
对其基因编码的蛋白结构域进行分析，进一步证实了
该基因属于 ACT基因家族。
2． 2． 4 gnl | UG | Mtr#S5343205 基因的序列分析与功
能预测 通过 NCBI 网站的 Blastx 比对功能，对 gnl |
UG |Mtr#S5343205 基因进行同源性对比，与蒺藜苜蓿、
鹰嘴豆、大豆、菜豆、野生大豆的同源性均在52% ～
57%(表 6) ，且几乎在所有种类中该基因均是硫氧还
蛋白。其分子量约为 12 kD，具有一个保守的活性中
心 Trp-Cys-Gly(Ala)-Pro-Cys［23］。且运用 DNAMAN软
件将目的基因进行与上述基因比对，总体的相似性为
79． 31%，同时利用 InterProScan 软件对其基因编码的
蛋白结构域进行分析，也同样证实了该基因编码的蛋
白是硫氧还蛋白。
2． 2． 5 gnl | UG | Mtr#S5342067 基因的序列分析与功
能预测 通过 NCBI 网站的 Blastx 比对功能，对 gnl |
UG |Mtr#S5342067 基因进行同源性对比，与蒺藜苜
蓿、鹰嘴豆、大豆、菜豆的同源性均在 72% ～ 96%(表
7) ，且几乎在所有种类中该基因均是脂氧合酶。分
子质量范围一般在 90 000 ～ 100 000，是由酶蛋白由
单肽链组成的一种含非血红素铁蛋白的氧合酶，属
氧化还原酶［24］。且运用 DNAMAN 软件将目的基因
进行与上述基因比对，总体的相似性为69． 64%，同
时利用 InterProScan 软件对该基因编码的蛋白结构
域进行分析，也同样证实了该基因编码的蛋白是脂
氧合酶。
表 5 gnl | UG |Mtr# 5424404 基因 Blastx同源性对比分析
Table 5 Homology comparison analysis of gnl | UG |Mtr# S5424404 gene
基因收录号
Accession
描述
Description
同源百分比
Query coverage /%
XP_004514319． 1 无特征蛋白
［鹰嘴豆］
Uncharacterized protein LOC101500937［Cicer arietinum］
49
XP_006599014． 1 无特征蛋白
［大豆］
Uncharacterized protein LOC100818506 isoform X2［Glycine max］
49
XP_007161678． 1 假定蛋白
［菜豆］
Hypothetical protein PHAVU_001G089200g［Phaseolus vulgaris］
49
XP_007031924． 1 ACT蛋白［可可树］ACT domain repeat 6［Theobroma cacao］ 49
XP_007215389． 1 假定蛋白
［碧桃］
Hypothetical protein PRUPE_ppa005796mg［Prunus persica］
49
XP_008231090． 1 无特征蛋白
［梅］
Uncharacterized protein LOC103330312 isoform X2［Prunus mume］
49
表 6 gnl | UG |Mtr# 5343205 基因 Blastx同源性对比分析
Table 6 Homology comparison analysis of gnl | UG |Mtr# S5343205 gene
基因收录号
Accession
描述
Description
同源百分比
Query coverage /%
XP_003613549． 1 硫氧还蛋白［蒺藜苜蓿］Thioredoxin H2［Medicago truncatula］ 57
XP_006599014． 1 预测
:硫氧还蛋白［鹰嘴豆］
PREDICTED:thioredoxin H2-like［Cicer arietinum］
57
XP_007161678． 1 预测
:硫氧还蛋白 H2 类似物［大豆］
PREDICTED:thioredoxin H2-like［Glycine max］
57
XP_007031924． 1 假定蛋白
［菜豆］
Hypothetical protein PHAVU 002G068000q［Phaseolus vulqaris］
57
XP_007215389． 1 硫氧还蛋白［蒺藜苜蓿］Thioredoxin［Medicago truncatula］ 56
XP_008231090． 1 硫氧还蛋白［野生大豆］Thioredoxin H2［Glycine soja］ 52
08
第 1 期 郭 云 等:基于 RNA-Seq技术的苜蓿根蘖性状发生相关下调基因
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表 7 gnl | UG |Mtr# 5342067 基因 Blastx同源性对比分析
Table 7 Homology comparison analysis of gnl | UG |Mtr# S5342067 gene
基因收录号
Accession
描述
Description
同源百分比
Query coverage /%
XP_003627187． 1 脂氧合酶［蒺藜苜蓿］Lipoxygenase［Medicago truncatula］ 96
XP_006599014． 1 预测
:种子亚油酸酯脂氧合酶［鹰嘴豆］
PREDICTED:seed linoleate 9S-lipoxygenase-2-like［Cicer arietinum］
93
XP_007161678． 1 预测
:种子亚油酸酯脂氧合酶［蒺藜苜蓿］
Seed linoleate 9S-lipoxygenase［Medicago truncatula］
96
XP_007031924． 1 脂氧合酶
［菜豆］RecName:Full = Linoleate 9S-lipoxygenase;AltName:
Full = lipoxygenase［Lens culinaris］
95
XP_007215389． 1 脂氧合酶
［大豆］
lipoxygenase L-5［Glycine max］
72
XP_008231090． 1 假定蛋白
［菜豆］
Hypothetical protein PHAVU 010G135900q［Phaseolus vulqaris］
88
2． 3 Lon蛋白酶基因在植物中的功能
Lon蛋白酶是一类依赖 ATP的蛋白酶家族，分子
量约为 106 kDa。它是细菌和线粒体中的 Lon 蛋白
酶的同系物，可以形成有活性的同质寡聚复合体。
Lon蛋白酶属于 AAA+超家族［25］。Lon 蛋白酶活性
对于维持细胞体内平衡、蛋白质控制和代谢调控起
着重要作用［26］。李笑一［27］指出拟南芥(Arabidopsis
thaliana)中有 4 个编码 Lon 的基因，其中 Lon1 既定
位于线粒体又定位于叶绿体，在线粒体中其主要功
能是响应三羧酸循环中复合物Ⅱ与复合物Ⅳ的酶的
活性，Lon4 突变体对干旱胁迫和高盐胁迫均比野生
型敏感，此外，Lon4 蛋白酶可能参与 ABA 信号途径
中的蛋白降解。
2． 4 ACT基因在植物中的功能
肌动蛋白是由一条肽链组成的球形蛋白质，有两
个结构域，分子量在 43 000 bp 左右。通过研究过
ActS /ActR双组份系统酸调节基因的功能分析，确定
了其可以调节苜蓿中华根瘤菌对酸性环境的适应［28］。
此外，植物生长过程中控制向性生长的机理目前还不
是很清楚，但是有研究表明，淀粉粒与内质网与植物向
性生长有关，且细胞质的流动对淀粉粒的沉积影响很
大，因此植物微丝对植物细胞感受重力起了重要的作
用［29］，从而得出植物肌动蛋白(ACT)在生理功能上可
能影响和控制植物的向性生长。在生长着的拟南芥根
毛中，细胞核与顶点的距离是固定的，是细胞核顶端的
肌动蛋白束阻止了其向顶端移动［30］，因此，肌动蛋白
在根系生长过程中促进根毛伸长生长，是细胞顶端生
长的动力。此外，仍有研究表明，在拟南芥中编码肌动
蛋白的相关基因发生突变，则拟南芥的根毛细胞变得
弯曲［31］，进一步证明植物肌动蛋白表达量若下调，导
致根毛的垂直生长和顶端生长，从而可能导致根系侧
根或根蘖节的发生。
2． 5 硫氧还蛋白在植物中的功能
硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)是一类广泛存在于
动物、植物以及细菌细胞的低分子量的蛋白质，分子量
约为 12 kD［23］。蛋白质组学的发展已经发现了很多线
粒体中硫氧还蛋白的潜在靶标，但是它们具体在植物
不同部位所起的作用仍然不是很清楚。刘东等［32］指
出硫氧还蛋白对植物自交不亲合过程起调控作用。在
叶绿体中，硫氧还蛋白是参与并且调节植物光合作
用［33］。在植物抗逆性方面，许多学者已经通过试验验
证硫氧还蛋白的 Trx部分通过生化反应对植物抗逆性
进行调控。细胞内的氧化还原状态是决定植物抵御生
物和非生物胁迫的一个重要指标，而 Trx 部分就是通
过自身的氧化还原反应来进行调节的。夏德习等［34］
利用拟南芥通过转基因试验得出植物体内的硫氧还蛋
白不仅自身具有抗逆境胁迫能力，同时，还可以通过对
抗逆基因的表达的调控来起作用，在植物的抗逆系统
中起较重要的作用。
2． 6 脂氧合酶在植物中的功能
脂氧合酶(LOX)是植物体内一种同工酶，在植物
的生长发育及抵御机械伤害、病虫侵染等逆境过程起
到重要的调节作用［24］。此外，LOX在植物生理功能中
对植物的生长衰老、抗病反应都有一定的作用。植物
18
草 业 科 学 第 33 卷
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LOX的生理功能是为植物激素提供合成前体物如茉
莉酸(JA)等［35］，其代谢产物中含有对细胞膜具有一
定的破坏作用的活性氧和氧自由基，因而参与植物的
衰老和抗病性过敏坏死反应［36-37］。此外，LOX 对植物
的衰老起着非常重要的作用，LOX 过氧化产物可导致
组织衰老，运作机制主要包括抑制叶绿体的光化学活
性、促进合成蛋白质酶类的失活［24］。脂氧合酶除了与
植物的衰老有关，也是植物抗逆境胁迫的重要酶。研
究表明，当植物体要面临许多环境胁迫因素，如缺水、
病原感染、高温或低温、氧胁迫和紫外辐射等都可诱
导单个或多个 LOX基因的响应表达，LOX在植物抗逆
性等方面起着重要作用［38］。且已有研究表明，在动、
植物受到环境胁迫而产生的诱导响应中，脂氧合酶
(Lipoxy genase)扮演重要的角色［39-40］。
3 讨论与结论
苜蓿根蘖性状是遗传和环境相互作用的结果［2］。
在遗传性方面，根蘖性状则属复杂的数量性状，遗传力
较低环境对根蘖性状的影响较大［41］。为了全面具体
了解分子机制上苜蓿发生根蘖性状的机理，本研究采
取苜蓿根蘖部位与非根蘖部位进行 RNA-Seq 技术分
析，发现差异基因 15 978 个，其中在表达上调的基因
中，经王晓娜［42］分析得出有两个是参与根系生长的，
该基因属于 AP2 家族的 RAV 转录因子，其对赤霉素
的诱导发生响应，使转录因子表达，进而通过生化反应
使相关蛋白质合成。下调的基因有 5 个，为本研究的
重点，其分别属于 Lon蛋白酶家族，植物肌动蛋白家族
硫氧还蛋白和脂氧合酶(表 8)。
表 8 参与苜蓿根系生长调控的表达量下调的基因分析表
Table 8 Analysis of down regulated gene related with alfalfa root growth regulation
序号
Number
Gene ID 基因家族
Gene family
功能简介
Function
1 gnl |UG |Mtr#S7095310
Lon 蛋白酶
Lon protease
与抗旱性、抗盐性有关;参与 ABA信号途径降解
Related to drought resistance，salt resistance;involved in ABA sig-
naling pathway degradation
2 gnl |UG |Mtr#S5372550
Lon 蛋白酶
Lon protease
与抗旱性、抗盐性有关;参与 ABA信号途径降解
Related to drought resistance，salt resistance;involved in ABA sig-
naling pathway degradation
3 gnl |UG |Mtr#S5424404
ACT 基因家族
The ACT gene
f-amilies
调节根瘤菌对酸环境的适应、与植物顶端生长、向性生长有关
Adjust the rhizobia on the acid environment adaptation，related to
the top of a plant growth，tropism
4 gnl |UG |Mtr#S5343205 硫氧还蛋白
Thioredoxin
抗逆性
Stress resistance
5 gnl |UG |Mtr#S5342067 脂氧合酶
Lipoxygenase
促进衰老，抗逆性
Promote the aging;resistance
脱落酸(ABA)作为一种重要的胁迫激素的观点
已被人们广泛接受［43］。研究证实，植株在干旱情况
下，会启动脱落酸合成系统，根部 ABA 累积是一种主
要的信号物质，经木质部的传导到达叶片，通过一系列
生化反应使蒸腾作用减少［44］。此外，高菲和张金
鹏［45］测出根蘖型苜蓿的脱落酸(ABA)的含量高于非
根蘖型苜蓿，从而推测 ABA的含量与根蘖发生的程度
有关，且根系中 GA和 ABA的含量与根系水平根总量
呈正相关［46］。Lon 蛋白酶的存在使植物对于干旱胁
迫和高盐胁迫更加敏感，并且参与 ABA信号途径的降
解，使植物根系 ABA 含量降低。因此，苜蓿发生根蘖
性状时，一般是在环境较干旱时发生的，由 ABA 的诱
导作为外界刺激产生信号，导致编码 Lon 蛋白的基因
表达下调，有助于苜蓿在干旱情况下发生根蘖性状，且
ABA在根系的积累通过生物过程提高了植株的抗旱
性。
编码植物肌动蛋白的基因在根蘖性状中的表达量
下调。肌动蛋白在生理功能上可以感受重力方向，与
植物向性生长有很大关系，也控制顶端生长优势。苜
蓿发生根蘖性状时根系编码植物肌动蛋白的基因表达
下降，从而控制植物根系向地下生长的能力下降，有利
于植株根系产生较多水平侧根，从而可以进一步产生
28
第 1 期 郭 云 等:基于 RNA-Seq技术的苜蓿根蘖性状发生相关下调基因
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根蘖性状。此外，植物肌动蛋白的下降使根系的顶端
优势现象减弱，同样也利于根蘖性状侧根的生长发育。
硫氧还蛋白和脂氧合酶都是与植物抗逆性有关
的，且他们具有调控与抗逆性有关的基因的表达，而这
两个基因的表达量的下降使植物根系抗逆性的能力下
降，从而进一步加强了植物中 ABA 的积累，促使植物
根系产生根蘖性状。
综上所述，参与苜蓿根蘖性状调控表达基因，有受
到植物根部内源激素脱落酸的诱导。且根蘖性状是由
于受到生长过程中各种外界因素的影响以及内部多个
基因的响应和调控，从而通过内源激素的变化完成的。
通过 Lon蛋白酶家族、植物肌动蛋白、硫氧还蛋白和脂
氧合酶表达量的下降调控根蘖性状的发生。
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(责任编辑 王芳)
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