全 文 ：响应面分析法优化柿叶总黄酮提取工艺
王 兰，赵 麟 (陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安 710021)
摘要 ［目的］优化柿叶(FOLIUM KAKI)总黄酮的提取工艺。［方法］在单因素试验基础上，采用响应面分析法对影响柿叶总黄酮提取
率的主要因素(提取温度、料液比和乙醇体积分数)进行优化，建立了影响因素与响应值之间的函数关系。［结果］柿叶总黄酮最佳提取
工艺为:提取温度 74． 05 ℃，料液比 1∶35． 01，乙醇体积分数 65． 78%，在此条件下，提取率最高达 4． 041%。［结论］采用响应面法对柿叶
总黄酮的提取条件进行优化合理可靠。
关键词 柿叶;黄酮;提取;响应面分析
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)03 －01370 －04
Optimization of the Extraction Technology of Total Flavone from FOLIUM KAKI Using Response Surface Analysis
WANG Lan et al (College of Life Science and Engineering，Shannxi University of Science and Technology，Xi’an，Shannxi 710021)
Abstract ［Objective］The research aimed to optimize the extraction technology of total flavone from FOLIUM KAKI．［Method］Based on the sin-
gle factor experiment，the main factors effecting the extraction rate of total flavone of FOLIUM KAKI were optimized by response surface analysis，
and the functional relationship of response and factors was established．［Result］The best extraction technology of total flavone of FOLIUM KAKI
was:extraction temperature 74． 05 ℃，the ratio of soild to liquid 1∶35． 01，alcohol concentration 65． 78% ． Under this condition，the extraction rate
can reach 4． 041% ．［Conclusion］It is reasonable and reliable of optimizing the conditions of extracting the total flavone from FOLIUM KAKI by
response surface analysis． respons respons
Key words FOLIUM KAKI;Flavone;Extraction;Response surface analysis
作者简介 王兰(1963 － )，女，辽宁沈阳人，教授，从事药物与功能
性食品研究。
收稿日期 2010-10-27
柿叶(FOLIUM KAKI)为柿科植物柿(Diospyros kaki L．
f．)的新鲜或干燥叶，其味苦、性寒［1］，具有抗菌消炎、生津止
渴、清热解毒、润肺强心、镇咳止血、抗癌防癌等多种医疗保
健功能［2］。柿叶中含有丰富的 VC、芦丁、胆碱、黄酮苷、胡萝
卜素、多种氨基酸及铁、锌、钙等对人体健康有益的营养成
分［3］。近年来，大量药理试验研究表明，黄酮类化合物有降
脂、抗血栓、抗氧化、抗衰老、清除自由基、抗心律失常等作
用，因而广泛用于医药、食品等行业，具有极广的开发应用前
景［4］。响应面分析法(Response surface methodology，RSM)是
利用合理的试验设计，采用多元二次回归方程拟合因素与响
应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最佳工
艺参数，解决多变量问题的一种统计方法［5］。目前，国内已
发表的文献中还未发现有用响应面法对柿叶总黄酮提取工
艺进行优化的报道［6］。为此，笔者在单因素试验基础上，采
用响应面法分析优化柿叶总黄酮提取工艺条件。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 供试药材。柿叶(日本甜柿) ，于 2009 年 10 月份采
自陕西中药研究所院内，干燥后粉碎过 40目筛，置于干燥器
中保存备用。
1． 1． 2 主要试剂。芦丁(中国药品生物制品检验所 批号:
100080-200707) ;无水乙醇、石油醚、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝
酸铝，均为分析纯。
1． 1． 3 主要仪器。HH-S4 型电热恒温水浴锅，购自北京科
伟永兴仪器有限公司;BS224S型电子天平，购自北京利多斯
仪器系统有限公司;FW100 型高速万能粉碎机，购自天津市
泰斯特仪器有限公司;CS101-2A型电热鼓风干燥箱，购自中
国重庆银河试验仪器有限公司;SP-752(PC)型紫外可见分光
光度计，购自上海光谱仪器有限公司;SHB-B95 型循环水式
多用真空泵，购自郑州长城科工贸易有限公司。
1． 2 方法
1． 2． 1 标准品溶液的配制。精密称取芦丁标准品 24． 3 mg，
用 70%乙醇溶解并定容至 100 ml容量瓶中，得浓度为 0． 243
mg /ml的芦丁标准溶液。
1． 2． 2 标准曲线的绘制。准确吸取芦丁标准溶液 0、1、2、3、
4、5、6 ml于 25 ml容量瓶中，补水至 6 ml，加入 5%NaNO2 溶
液 1 ml，摇匀，静置 6 min。加入 10%Al(NO3)3 溶液1 ml，摇
匀，静置6 min。加入1 mol /L NaOH溶液10 ml，摇匀，用水定
容，摇匀，静置 15 min后于波长 510 nm处测定吸光度值，得
吸光度值与浓度之间的回归方程为:y = 11． 777x － 0． 011 8，
(r =0． 999 7) ，标准品溶液浓度在 10 ～ 60 μl /ml 范围内与吸
光度值呈良好的线性关系。
1． 2． 3 原料的预处理。精确称取 30． 0 g 柿叶粉(过 40 目
筛) ，加入 300 ml石油醚，在 70 ℃下提取 3 h，除去脂类和油
溶性物质。
1． 2． 4 单因素试验。
1． 2． 4． 1 乙醇体积分数的选择。精确称取 3． 0 g 干燥柿叶
粉，固定提取温度为 60 ℃，料液比为 1∶30(W/V，下同) ，选择
乙醇体积分数分别为 50%、60%、70%、80%、90%回流提取 1
h，提取 1次，考察乙醇体积分数对总黄酮提取效果的影响。
1． 2． 4． 2 料液比的选择。精确称取 3． 0 g干燥柿叶粉，固定
提取温度为 60 ℃，乙醇体积分数为 70%，选择料液比分别为
1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60回流提取 1 h，提取 1次，考察
料液比对总黄酮提取效果的影响。
1． 2． 4． 3 提取温度的选择。精确称取 3． 0 g干燥柿叶粉，固
定乙醇体积分数为 70%，料液比为 1∶30，选择提取温度分别
为 50、60、70、80、90 ℃回流提取 1 h，提取 1次，考察提取温度
对总黄酮提取效果的影响。
1． 2． 4． 4 提取时间的选择。精确称取 3． 0 g干燥柿叶粉，固
定提取温度为 60 ℃，乙醇体积分数为 70%，料液比为 1∶30，
选择提取时间分别为 30、60、90、120、150 min，各回流提取 1
责任编辑 姜丽 责任校对 况玲玲安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(3):1370 － 1373
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.03.052
次，考察提取时间对总黄酮提取效果的影响。
1． 2． 4． 5 提取次数的选择。精确称取 3． 0 g干燥柿叶粉，固
定提取温度为 60 ℃，乙醇体积分数为 70%，料液比为 1∶30，
回流提取 1 h，分别提取 1、2、3、4次，考察提取次数对总黄酮
提取效果的影响。
1． 2． 5 响应面优化试验。根据 Box-Benhnken的中心组合试
验设计原理，结合单因素试验结果，选取乙醇体积分数、提取
温度、料液比 3个因素，每个因素 3个水平，在确定提取次数
为 1次、提取时间为 1 h的情况下，用 Design expert 7． 1． 6 软
件设计 3因素 3水平响应面分析试验，对柿叶总黄酮的提取
工艺进行优化。因素与水平设计见表 1。
表 1 响应面试验因素与水平设计
Table 1 The table of Level factors of Response surface experiment
水平
Level
因素
提取温度∥℃
Extraction
temperature
料液比
Materials and
liquids ratio B
乙醇体积分数∥%
Ethanol size
percentages
－1 60 1∶30 60
0 70 1∶40 70
1 80 1∶50 80
1． 2． 6 柿叶总黄酮的提取及测定。精确称取脱脂后的柿叶
粉 2． 0 g，加入一定体积分数的乙醇溶液，按相应的提取条件
回流提取，抽滤后用相应浓度的提取溶剂定容至 100 ml作为
待测液，吸取待测液 1 ml，按照“1． 2． 2”的方法测定吸光度
值。将吸光值带入标准曲线公式得出浓度(x) ，总黄酮提取
率计算公式为:
总黄酮提取率 = C ×25 ×100V × w ×100%
式中，C为标准曲线求出的浓度 mg /ml;w 为柿叶粉的重量
(g) ;V为柿叶提取液取样量 ml;100 为提取液定容于100 ml
后提取液的总体积;25为稀释倍数。
2．结果与分析
2． 1 单因素试验结果
2． 1． 1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响。由图 1 可
知，柿叶总黄酮提取率随着乙醇体积分数的增大而升高，当
乙醇体积分数为 70%时达到最大值，之后提取率降低。这可
能是因为柿叶总黄酮主要是以黄酮苷元和糖苷 2 种形式存
在，苷元成分易溶于乙醇，糖苷易于溶于水，在 70%乙醇体积
分数下，水与乙醇达到最佳比例所致。故乙醇体积分数以
70%为宜。
2． 1． 2 料液比对总黄酮提取率的影响。由图 2可知，柿叶总
黄酮提取率随着乙醇用量的增大而呈现上升的趋势，但增加
的幅度不大，且当料液比为 1∶40 时，趋于稳定。故料液比以
1∶40为宜。
2． 1． 3 提取温度对总黄酮提取率的影响。由图 3 可知，柿
叶总黄酮提取率随着温度的升高而增大，当提取温度为 70
℃时提取率达到最大值，之后随着温度的增高，提取率开始
下降。这可能是因为在温度增高时，柿叶中的可溶性蛋白溶
出变性，增大了提取溶剂的黏度，从而阻碍了黄酮类物质从
细胞中溶出，进而降低了黄酮的提取率。故提取温度以 70
℃为宜。
图 1 乙醇体积分数对柿叶总黄酮提取率的影响
Fig． 1 The influence of ethanol concentration on extraction of
total flavone from persimmon leaf
图 2 料液比对柿叶总黄酮提取率的影响
Fig． 2 The influence of solid-liquid ratio on extraction of total
flavone from persimmon leaf
图 3 提取温度对柿叶总黄酮提取率的影响
Fig． 3 The influence of extracting temperature on extraction of
total flavone from persimmon leaf
2． 1． 4 提取时间对总黄酮提取率的影响。由图 4 可知，随
着提取时间的增加，柿叶总黄酮提取率较稳定，变幅不大。
根据经济原则，提取时间以 60 min为宜。
2． 1． 5 提取次数对总黄酮提取率的影响。由图 5 可知，随
着提取次数的增加，柿叶总黄酮提取率呈缓慢上升的趋势，
但是上升程度不大。本着节约成本、省时的原则，提取次数
以 1次为宜。
2． 2 响应面试验结果 利用 Design expert 7． 1． 6软件对表 2
的结果进行多元线性回归拟合，得到总黄酮提取率对提取温
度(A)、料液比(B)、乙醇体积分数(C)的二次多项回归方程
为:Y = －40． 170 83 +0． 523 97 A －0． 324 31 B +0． 931 17 C +
0． 001 205 AB －0． 001 505 AC + 0． 004 395 BC － 0． 003 143 A2
－ 0． 001 063 B2 － 0． 007 363 C2。
经方差分析可知，模型 P值为 0． 003 6 ﹤ 0． 01，为极显
173139 卷 3 期 王 兰等 响应面分析法优化柿叶总黄酮提取工艺
图 4 提取时间对柿叶总黄酮提取率的影响
Fig． 4 The influence of extracting time on extraction of total fla-
vone from persimmon leaf
图 5 提取次数对柿叶总黄酮提取率的影响
Fig． 5 The influence of extracting times on extraction of total
flavone from persimmon leaf
著，说明此模型模拟可靠;模型相关系数 R2 = 0． 966 3，说明
响应值(提取率)的变化有 96． 63%来源于所选变量，模型拟
合度很好;同时，Adeq Precision信噪比为10． 328，一般信噪比
大于 4是合理的，该模型有很强的信号。综上所述，该模型
能够很好地解释响应值的变化，方法可靠，得到的回归方程
模拟真实的 3因素 3水平的分析是可行的。另外，乙醇体积
分数(C)、提取温度(A)、料液比和乙醇体积分数的交互作用
(BC)和乙醇体积分数平方项(C2)对总黄酮提取率的影响极
显著;而料液比(B)和提取温度平方项(A2)对总黄酮提取率
的影响显著，说明模型的拟合度好。
影响柿叶总黄酮提取率的因素按影响大小依次为:乙醇体
积分数 ＞提取温度 ＞料液比。响应面分析结果见图6 ～8。
表 2 响应面试验结果
Table． 2 The results of response surface design of experiments
试验号
Test No．
A B C
提取率∥%
Extraction rate
1 0 0 0 3． 864
2 0 －1 1 2． 495
3 0 0 0 3． 841
4 0 0 0 3． 808
5 0 1 －1 2． 616
6 0 1 1 2． 841
7 －1 －1 0 3． 249
8 －1 0 －1 2． 729
9 －1 0 1 2． 514
10 1 －1 0 3． 747
11 1 1 0 3． 826
12 1 0 －1 3． 361
13 1 0 1 2． 544
14 0 －1 －1 4． 028
15 －1 1 0 2． 846
图 6 提取温度和料液比对总黄酮提取率影响的响应面与等高线(C =0)
Fig． 6 Response Surface of interrelated influence of temperature and the solid-liquid ratio to flavonoids rate (C =0)
由图 6 ～ 8 可以直观地看出，乙醇体积分数和料液比之
间的交互作用对柿叶总黄酮的提取率影响显著，而乙醇体积
分数和提取温度的交互作用次之，表现在曲面比较陡，并且
等高线呈现椭圆状;提取温度和料液比之间的交互作用对柿
叶总黄酮的提取率影响不显著，表现在曲面比较平滑。另
外，还可看出，乙醇体积分数和提取温度对柿叶提取率影响
都极其显著，这也进一步证明了该模型的合理性与可信性，
因为柿叶总黄酮在水和乙醇中均有一定的溶解性，当二者配
比适宜时，黄酮类物质的溶出才能达到更好地溶出;而温度
的改变，则会改变提取溶剂的黏度，从而可能会影响总黄酮
从细胞中的溶出，进而影响到提取率。
2． 3 验证性试验 对回归模型进行分析，得出最佳提取条
件为:提取温度 74． 05 ℃，料液比 1 ∶35． 01，乙醇体积分数
65． 78%，在此条件下提取率为 4． 041%。为操作方便，采用
提取温度为 75 ℃，料液比为 1∶35，乙醇体积分数为 65%，1 h
水浴回流提取 1 次进行验证试验，测得总黄酮提取率为
3． 987%，结果与预测值相差不大，这表明响应面法优化柿叶
黄酮的提取工艺是准确可靠的。
2731 安徽农业科学 2011年
图 7 乙醇体积分数和提取温度对总黄酮提取率影响的响应面与等高线(B =0)
Fig． 7 Response Surface of interrelated influence of temperature and ethanol concentration to flavonoids rate (B =0)
图 8 乙醇体积分数和料液比对总黄酮提取率影响的响应面与等高线(A =0)
Fig． 8 Response Surface of interrelated influence of ethanol concentration and the solid-liquid ratio to flavonoids rate (A =0)
3 结论
响应面法克服了正交设计只能处理离散的水平值，只能
精确到某一个具体的水平点，而无法找出整个区域上因素的
最佳组合和响应值的最优值的缺陷。根据 Box-Behnken中心
组合设计法及响应面分析法，利用 Design expert 7． 1． 6软件，
对柿叶黄酮的提取进行优化，并且表明了该方法真实可信。
通过该方法得出最佳提取工艺为:乙醇体积分数 65． 78%，料
液比 1∶35． 01，提取温度 74． 05 ℃，在此条件下柿叶总黄酮提
取率为 4． 041%，比优化前单因素试验的提取率有很大提高。
这表明利用响应面分析法优化柿叶总黄酮提取是可行的。
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