全 文 ：食品研究与开发2010年 12月第 31卷第 12期
分析要求。
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收稿日期：2010-07-13
红枣（Zizyphus Jujuba Mill．）又名中华大枣、大枣、 华枣，是鼠李科枣属植物枣树的果实，与桃、杏、李、栗
并称为“五果”。红枣含有丰富的营养成分，主要化学
成分有：糖类（鲜果含糖量在 30 %~40 %以上，干果在
80 %~85 %）、蛋白质和氨基酸（干果蛋白质含量为
2.40 g/100 g~3.22 g/100 g）、黄酮、腺苷和皂苷类、有机
枣核中 11S球蛋白的纯化与表征
刘文营 1，童军茂 1，李美良 2，张建 1，2，*
（1.石河子大学食品学院，新疆石河子 832003;2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）
摘 要：以红枣（Ziziphus jujube Mill.）核为原料，探索一条提取枣核 11S球蛋白的方法。将枣核粉碎粗提，然后离心去
掉杂质，再将得到的上清液用 20 %~50 %的硫酸铵进行分级盐析。离心得到的蛋白粗提液经透析后，用 DEAE-
Sepharose弱阴离子交换层析和 Superdex 200 prep grade凝胶过滤层析进一步分离纯化。SDS-PAGE电泳结果表明，枣
核球蛋白含有 2种亚基，分子量分别为 26 ku和 26.5 ku，Native-PAGE电泳测得分子量约为 210 ku。蛋白质的 2个亚
基的 N端序列结果显示为 11S球蛋白。
关键词：枣核；11S球蛋白；分离；纯化；表征
Purification and Characterization of the 11S Globulin Protein from Chinese Jujube (Ziziphus Jujube Mill.) Seeds
LIU Wen-ying1，TONG Jun-mao1，LI Mei-liang2，ZHANG Jian1，2，*
（1. College of Food，Shihezi University，Shihezi 832003，Xinjiang，China；2. College of Food Science and Nutritional
Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）
Abstact: A study was carried out to explore a means to extract 11S globulin from Chinese jujube seeds. Crude
extracts from broke Chinese jujube seeds was centrifugalized to get ride of impurities, then adjusted to 20 %-
50 %（NH4）2SO4 to salt fractionalion. The protein was further purified by ion exchange chromatography in
DEAE-Sepharose and Superdex 200 prep grade gel filtration colunmns. Native-PAGE purified the molecular
weight of 11S globulin was about 210 000 and SDS-PAGE analyzed 11S globulin subunits were separated as two
peptides（26 000 and 26 500）. N-terminal sequencing of the two subunits, which had associated 11S globulin-
like protein,showed the protein isolated was 11S globulin.
Key words: Chinese jujube（Ziziphus jujubeMill．）seeds；11S globulin；isolation；purification；characterization
基金项目：石河子大学“263”青年骨干教师资助项目（SP04015）
作者简介：刘文营（1983—），男（汉），硕士，从事农产品加工与贮藏工
程方面的研究。
*通信作者：张建（1979—），男，讲师，博士，从事食品化学研究工作。
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检测分析
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食品研究与开发 2010年 12月第 31卷第 12期
酸和三萜类、维生素、矿物质元素、生物碱和甾醇，另外
还含有树脂、黏液质、香豆素类衍生物、儿茶酚、鞣质和
挥发油等[1-3]。研究发现红枣具有很高的功能特性，主要
表现在：抗癌作用、养肝护肝作用、养血补气作用、抗过
敏作用、康复和抗疲劳作用、安神益气、养颜作用和防
治心血管疾病的作用[4-10]。
红枣的食用和药用特性加上枣树具有抗盐碱、耐
瘠薄，既抗旱又耐涝，具有很强的适应性和国家的退耕
还林政策以及各地方的特色林果业发展规划，红枣的
种植面积大幅增加，北起内蒙古，南到海南，西至新疆，
东到沿海各省均有分布。据统计，至 2007年，全国枣树
面积约 150万公顷，鲜红枣年总产量达 305万 t，约占
世界总产量的 98％以上[11-12]。目前红枣除了鲜食外，主
要用于加工红枣酒、红枣醋和红枣饮料等。如果按 1万t
红枣可产生 3 000 t枣核来计算，目前每年至少产生
75万 t的枣核加工副产物，至今鲜见对枣核中蛋白质
研究的报道。
种子贮藏蛋白是一类非常重要的植物蛋白，它不
仅为种子萌发提供氮源和氨基酸，也为人类提供高蛋
白食物。贮藏蛋白在蛋白体内的含量很高（占蛋白体
重的 70 %~80 %），但其种类主要有 7-8S豌豆球蛋白
（vicilin）、11S 豆球蛋白 （legumin）、醇溶谷蛋白
（prolamin）和谷蛋白（glutelin）等几种[13]。本项研究不仅
可以丰富人们对于贮藏蛋白的分布情况的了解和对
枣核中的活性物质的研究，而且为枣资源的综合利用
提供实验参考和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
枣核（自产）：聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpy rrolidone，
PVP）：Amresco进口分装；DEAE-Sepharose和Superdex
200 prep grade（聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶）：GE-Heahhcare
Bio-Sciences AB公司产品；NaN3：美国 Amresco公司；
Tris：美国 Amresco公司；PVDF膜：美国 Bio-Rad公
司；其它试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
粉碎机（HY-08）：北京环亚天元机械技术有限公
司；匀浆机（JYL-610）：九阳股份有限公司；常压生物
层析系统（Bio-Rad Biologic LP）：美国 Bio-Rad 公司；
高速冷冻离心机（CR20GⅡ）：日本日立公司；超滤装置
（Stirred Cell 8050）：美国 Millipore 公司；超纯水器
（2000D）：北京长风仪器仪表公司；稳压稳流电泳仪
（DYYⅡ）：北京六一仪器厂；电泳槽（Mini-PROTEAN 3
Cell）：美国 Bio-Rad公司；凝胶成像分析系统（Tanon-
2500）：天能科技（上海）有限公司；微量移液器：德国
Eppendorf 公司；N 端测序仪器（Procise 491）：美国
Applied Biosystems公司。
1.3 蛋白提取纯化
1.3.1 枣核 11S球蛋白的提取
将 1 kg去杂的枣核浸泡于 2倍体积的蒸馏水中，
置于 4℃冷库中约 12 h。将枣核用粉碎机在低温下粉
碎，过 40目筛，然后浸泡于 3倍体积的提取液（50mmol/L
KH2PO4-Na2HPO4，pH7.5，1 % PVP）中，并用内切式匀
浆机匀浆 2 min，用纱布过滤，去除杂质。将收集到的滤
液在冷库中静置 1 h，以 12 000 r/min离心 10 min，弃去
沉淀，取上清液，即为粗提液[14]。
1.3.2 粗提液的分级盐析
采用 20 %~50 %的（NH4）2SO4盐析。在粗提液中
缓慢加入 20 %的（NH4）2SO4晶体，完全溶解后低温静
置 3 h，然后于 12 000 r/min、4℃下离心 30 min，弃去沉
淀，得到上清液。在上清液中缓慢加入 50%的（NH4）2SO4
晶体，完全溶解后低温静置 3 h，然后于 12 000 r/min、
4 ℃下离心 30 min，弃去上清液，得到沉淀，即为粗提
蛋白。将沉淀溶于 2倍体积提取溶液中，以 12000 r/min、
4 ℃离心 10 min，去除不溶于水的沉淀，收集上清液。
将上清液在 4 ℃、pH 7.5 的 PBS 缓冲液（50 mmol/L
KH2PO4-Na2HPO4）中进行透析，将透析得到的溶液过
0.22 μm的水系膜，滤液储藏于 4 ℃冰箱中，以待进一
步纯化。
1.3.3 弱阴离子交换柱层析
用 50 mmol/L pH 7.5的 PBS平衡 DEAE-Sepharose
后，将盐析后透析所得过滤液进行弱阴离子交换柱
（1.6 cm×50 cm）层析，用 4倍体积 PBS（pH7.5）洗脱，再
用含 0~1.0 mol/L NaCl 的 400 mL PBS（pH7.5）进行梯
度洗脱，流速为 1.0 mL/min，5 mL/管分管收集。然后用
SDS-PAGE电泳检测后将含有 11S球蛋白的收集液浓
缩，以待进一步纯化。
1.3.4 凝胶过滤柱层析
用含有 0.15mol/L NaCl的 PBS（50 mmol/L，pH 7.5）
平衡 Superdex 200 prep grade柱( 1.6 cm×120 cm)，再用
相同的缓冲液进行洗脱，流速为 0.4 mL/min，5 mL/管
分管收集。
1.4 枣核 11S球蛋白的表征
1.4.1 SDS-PAGE检测蛋白质纯度及亚基分子量
样品和缓冲溶液体积比为 1∶2，缓冲溶液中含有
25 %甘油、12.5 % Tris-HC1（pH6.8，0.5 mol/L）、2 %
SDS、1 %溴酚兰和 5 %巯基乙醇，充分混合后在 95℃
的水浴中保持 6 min，参照 Laemmli 等 [15]的方法进行
检测分析
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食品研究与开发2010年 12月第 31卷第 12期
SDS-PAGE检测。
1.4.2 Native-PAGE检测蛋白质分子量
样品和缓冲溶液体积比为 1∶2，缓冲溶液中含有
25 %甘油、12.5 %Tris-HC1（0.5 mol/L，pH6.8）和 1 %溴
酚兰，充分混合后参照文献[15]方法进行 Native-PAGE
检测。
1.5 枣核 11S球蛋白的 N端序列测定
将纯化的蛋白进行 SDS-PAGE电泳，然后将凝胶
上样品条带通过电转膜转移到 PVDF膜上，转膜样品
Edman降解后进行氨基酸序列分析[16]。
2 结果分析
2.1 枣核 11S球蛋白的离子交换与凝胶过滤层析
将透析过的样品使用 0.22 μm微滤膜微滤后进行
离子交换层析，使用 0~1.0mol/L NaCl梯度盐洗脱（图1）。
将目标蛋白的样品浓缩后进行凝胶过滤层析，同样
SDS-PAGE检测得到纯化的蛋白样品（ZSG）（图2）。
2.2 枣核 11S球蛋白的亚基及分子量分析
将得到的蛋白质的 SDS-PAGE 和 Native-PAGE
电泳结果（图 3），进行纯度检验并运用凝胶成像分析
系统进行亚基和分子量分析。
结果显示：蛋白分子量为 210 ku（图 3B），蛋白含
有 2种亚基，分子量分别为 26 ku和 26.5 ku（图 3A）。
2.3 枣核 11S球蛋白的 N端氨基酸序列分析
对枣核 11S球蛋白的 2条亚基 N端序列测定，大
小为 26.5 ku的亚基 L1:GLEETVCSLRLKENI；大小为
26.0 ku的亚基 L2:GVEETICTLRLLENI。2段序列使用
NCBI（美国国家生物信息中心）的 BLAST序列数据库
中进行网上搜索，发现没有与分离出的蛋白完全相同
的序列，说明是一种新的蛋白，但又发现两者均与已经
收录的山核桃（CIG）和榛果（CAG）11S球蛋白的氨基
酸序列匹配的最为完好，由图 3比较发现 26.5 ku条带
的 15个氨基酸序列中有 12个与 CAG的一致，占 80%，
有 11个与 CIG的一致，占 73.3 %；26.0 ku的条带有
12个分别于 CAG和 CIG的一致，占 80 %。可以确定
图 1 枣核 11S球蛋白离子交换层析图
Fig.1 Profile of ion-exchange column chromatography of the 11S
globulin protein from Chinese jujube（Ziziphus jujube Mill．）seeds
图 2 枣核 11S球蛋白凝胶过滤层析图
Fig.2 Profile of gel filtration chromatography of the 11S globulin
protein from Chinese jujube（Ziziphus jujube Mill．）seeds
图 3 11S球蛋白的 SDS电泳（A）和 Native电泳（B）分析
Fig.3 Native-PAGE (B) and SDS-PAGE (A) analysis of purified
11S globulin protein
图 3 枣核 11S球蛋白 L1、L2两亚基与 CAG和 CIG亚基 N端序
列分析
Fig.3 NH2-terminal amino sequence analysis of subunit L1, L2
from Chinese jujube（Ziziphus jujube Mill．）seeds and subunits
from CAG and CIG
m
V
Elution time/min
m
V
Elution time/min
A B
检测分析
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分离出的为 11S球蛋白。
3 结论与讨论
建立了一套分离纯化枣核中 11S球蛋白的方法，
利用 SDS-PAGE 和 Native-PAGE 凝胶电泳对 11S 球
蛋白分离纯化进行了分析鉴定。结果显示经过分级盐
析、透析、离子交换和凝胶过滤柱层析可以得到纯的
11S球蛋白。该蛋白含有 2个亚基，分子量为 26 ku和
26.5 ku，大小非常接近，分子量为 210 ku，与之前报道
的 11S球蛋白家族的亚基、分子量大小范围有明显的
差异，具有独特性，这一定程度上说明了 11S球蛋白的
多样性，为探索物种多样性和物种的进化亲缘关系提
供了一定的参考[17]。
11S球蛋白为种子贮藏蛋白，本文对枣核中的蛋
白质进行了分析，填补了对枣核蛋白质研究的空白。
从枣核中分离纯化得到 11S球蛋白，为进行后续的理
化分析比较奠定了基础，为枣核蛋白的研究开发提供
了借鉴，并且为枣资源的开发利用、枣加工废弃物的综
合利用提供了科学参考。
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