全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod ResDev 2006 , 18:792-795
文章编号:1001-6880(2006)05-0792-04
　
　
　收稿日期:2005-12-16　　　接受日期:2006-02-22
　基金项目:国家自然科学基金项目(30370158)
＊通讯作者 Tel:86-21-62232019;E-mai l:wjqu@bio.ecnu.edu.cn
硬软蒺藜 rDNA-ITS基因序列的测定和比较
张素军 ,瞿伟菁＊ ,李　进
(华东师范大学生命科学学院 , 上海 200062)
摘　要:用 CTAB 法提取总 DNA ,合成位于 18 S rDNA和 26 S rDNA上的两条各 20 bp 的引物 , 通过 PCR扩增 ITS
的全序列 ,对 PCR产物直接测序 , 分别获得了硬蒺藜(Tribulus terrestris L.)和软蒺藜(Atriplex centralasiatica Iljin)的
核糖体 RNA 基因— rDNA内转录间隔区(ribosomal DNA internal transcribed spacer , rDNA-ITS)的序列 643 bp 和 607
bp ,其碱基总差异率为 36.16%, 其中 , ITS1 的碱基差异率为 55.81% ;5.8 S 的碱基差异率为 6.59%;ITS2 的碱基
差异率为 56.77%。这种差异 , 以及基因序列本身 , 为硬软蒺藜的区别和种质资源鉴定提供了分子依据。
关键词:硬蒺藜;软蒺藜;核糖体 DNA内转录间隔区;PCR扩增;种质鉴定
中图分类号:R282.5;Q949.745.1 文献标识码:A
Fingerprinting of Nucleotide Sequences of Ribosomal DNA Internal
Transcribed Spacer in Tribulus terrestris L.and Atriplex centralasiatica Iljin
ZHANG Su-jun ,QU Wei-jing＊ , LI Jin
(School of Life Science , East China Normal University , Shanghai 200062 , China)
Abstract:To distinguish YING-JI-LI(Tribulus terrestris L.)from RUAN-JI-LI(Atriplex centralasiatica Iljin)under molecular
conditions , which are sometimes used unidentified in traditional Chinese medicine , the nucleotide sequences of ribosomal DNA
internal transcribed spacer(rDNA-ITS)of each were achieved using polymerase chain reaction(PCR)followed by an immediate
determination of sequences of PCR amplifications.643 bp nucleotides of ITS of YING-JI-LI were attained which showed a
36.16% diversity compared to 607 bp nucleotides of RUAN-JI-LI.Meanwhile , the sequences of ITS1 and ITS2 have the diver-
sities of 55.81% and 56.77%, respectively , while 5.8 S showing 6.59%.Therefore , all of the diversities , as well as the ITS
sequence itself , guarantee a DNA fingerprint for identification of YING-JI-LI and RUAN-JI-LI.
Key words:YING-JI-LI(Tribulus terrestris L.);RUAN-JI-LI(Atriplex centralasiatica Iljin);ribosomal DNA internal transcribed
spacer;PCR amplification;species identification
　　硬蒺藜为蒺藜科(Zygophyllaceae)植物蒺藜
(Tribulus terrestris L.)的 果实 , 软蒺藜 是藜 科
(Chenopodiaceae)植物中亚滨藜(Atriplex centralasiati-
ca Iljin)的果实 。由于硬 、软蒺藜在外形的相似性 ,
加上某些地区民间误传 ,常将软蒺藜作为硬蒺藜的
混淆品或代用品 ,处方皆称白蒺藜[ 1 ,2] 。临床上异
物同名同用的现象 ,反映了生药品种源头的混乱 ,为
了有效地控制中药材质量 ,实现中药现代化 ,从源头
上解决中药品种问题就显得极为重要。本文从硬 、
软蒺藜的种质DNA差异入手 ,对核糖体 DNA(riboso-
mal DNA , rDNA)的内转录间隔区(internal transcribed
spacer , ITS)的基因序列进行了测定 ,旨在为硬 、软蒺
藜的种质鉴定提供分子水平上的依据。
1　材料和方法
1.1　实验材料
硬 、软蒺藜于 2004年 8月份采自山东省 ,经华
东师范大学生命科学学院李宏庆副教授鉴定为蒺藜
(Tribulus terrestris L.)和中亚滨藜(Atriplex centralasi-
atica Iljin)的果实。取此果实 ,75%乙醇消毒 3 min ,
蒸馏水充分冲洗后 ,于 55 ℃烘箱中烘干 ,研钵中研
成极细粉末 ,置干燥器内备用。所用试剂除特别说
明外都为分析纯 ,水为双蒸水。
1.2　总DNA的提取和检测
1.2.1　DNA的提取
采用 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)法。
相关试剂及设备进行严格的灭菌处理。取样品 0.1
g ,置于 5 mL 的离心管中 ,加入 2 mL 预热到65 ℃的
1×CTAB 缓冲液[ Tris(trihydroxymethylaminomethane)-
DOI :10.16333/j.1001-6880.2006.05.020
HCl(pH 8.0)50 mmol/L , NaCl 0.7 mol/L , EDTA
(ethylenediaminetetraacetic acid , pH 8.0)10 mmol/L ,
CTAB 4%(W/V), β-巯基乙醇(β-mercapto ethanol ,
0.10%(V/V)] ,置 65 ℃的水浴中温育 90 min ,并轻
轻转动离心管 ,混合物冷至室温后加入等体积的 Tis
平衡酚(phenol Tris , pH 8.0),抽提 15 min , 10000 rpm
离心 10 min ,取上清液置另一离心管中 ,加入等体积
的酚/氯仿/异戊醇(phenol/chloroform/ isoamyl alco-
hol ,25:24∶1 ,V/V/V)抽提 10 min ,10000 rpm 离心 5
min ,取上清 ,再加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1 ,V/
V),抽提 10 min ,10000 rpm离心 5 min ,取上清 ,加入
2倍体积-20 ℃预冷的无水乙醇(ethanol absolute),混
匀 ,在-20 ℃下静置40 min后 ,缓慢摇匀 ,3000 rpm 离
心2 min ,弃上清 ,沉淀用适量 70%乙醇洗涤2次 ,每
次2 min ,再用无水乙醇漂洗 1次 ,室温下干燥 ,最后
加入 500 μL 灭菌双蒸水溶解 ,分装后于-20 ℃贮存
备用 。
1.2.2　DNA琼脂糖凝胶电泳
分别取上述硬 、软蒺藜的 DNA 溶液 50 μL , 在
1.5%琼脂糖凝胶上用 1×TAE 电泳缓冲液进行电
泳 ,溴化乙锭(ethidium bromide , EB)染色后 ,在 Viber
Lourmat凝胶成像系统(Viber Lourmat Imaging System ,
Marne la Vallée ,France)上进行观察和拍照。
1.2.3　DNA的纯度和浓度测定
取硬 、软蒺藜的 DNA 溶液各 50μL ,稀释 25倍 ,
在紫外-可见分光光度计(UV-VIS 8500 ,上海天美科
学仪器公司)上测定 260 nm 和 280 nm 处的吸光度
(A)值 ,以 A260/ A280估算 DNA 的纯度 ,并以 1.0 A260
值约相当于50 μg/mL 的 DNA计算其相应浓度 。
1.3　ITS扩增 和产物纯化
1.3.1　ITS 扩增
ITS的扩增采用双引物相向扩增 ,扩增引物(上
海Sangon公司合成)为位于 18 S rDNA上的 ITSP1:
5′-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′和位于 26 S rDNA
上的 ITSP4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′, 扩增
rDNA的 ITS(ITS1 和 ITS2)和 5.8 S 区段约 700 bp。
PCR反应体系为 50 μL[ 模板 DNA 约 0.5 μg , 10
mmol/L Tris-HCl(pH 8.3),50 mmol/L KCl ,1.5mmol/
L MgCL2 , 4 种 dNTP(dATP 、dGTP 、dCTP 和 dTTP)各
0.2 mmol/L , 1.2 U TaqDNA 聚合酶 , 每种引物各 25
pmol ,适量无菌双蒸水] 。反应在 PCR仪(PCR Sprint
Temperature Cycling System , Thermo Hybaid)上进行 。
扩增程序为:94 ℃预变性5 min;然后进入如下30个
循环:94 ℃变性 1 min ,55 ℃退火 45 s , 72 ℃延伸 1
min ,72 ℃延伸 5 min。产物于 4 ℃保存 。
1.3.2　PCR产物的检测和纯化
从 PCR产物中取出 5 μL ,在 1.5%琼脂糖凝胶
上用 1×TAE 电泳缓冲液进行电泳 , EB 染色 , 在
Viber Lourmat成像系统上进行观察和拍照 。产物用
DNA快速纯化/回收试剂盒(北京鼎国生物技术有
限公司)进行纯化 ,按试剂盒操作说明进行 ,纯化后
的产物加无菌双蒸水至总体积为 50 μL。
1.4　ITS序列的测定和分析
测序由上海 Sangon公司完成。测序引物(上海
Sangon公司合成)除了上述两个扩增用引物外 ,又补
充位于 5.8 S上的两个引物 ITSP2和 ITSP3:
ITSP2:5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′
ITSP3:5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′
从而使 ITS1和 ITS2两片段在正反方向测序 ,以保证
序列的准确性 。ITS 序列通过 Contig Express 拼接软
件进行拼接并根据 Chromas图谱进行人工校正而确
定 。所得序列用 DNAMAN软件进行比对分析。
2　结果
2.1　DNA检测
硬蒺藜总 DNA 的 A260/ A280比值为 1.60 ,软蒺
藜为 1.56 ,其浓度分别为 78.75 μg/mL 和 79.5 μg/
mL。电泳结果见 Fig.1。
图 1　硬 、软蒺藜的总 DNA 琼脂糖凝胶电泳
Fig.1 　Agarose gel electrophoresis of DNA from YING-JI-LI
(Tribulus terrestris) and RUAN-JI-LI(Atriplex cen-
tralasiatica)
2.2　PCR产物电泳检测
硬 、软蒺藜的 PCR产物经 1.5%琼脂糖凝胶电
泳后显示专一条带 ,分子量分别在 700 bp 左右 ,如
Fig.2 所示 。
793Vol.18 张素军等:硬软蒺藜 rDNA-ITS基因序列的测定和比较 　
图 2　硬 、软蒺藜 rDNA-PCR 产物琼脂糖凝胶电泳
Fig.2　Agarose gel electrophoresis of PCR amplifications of rD-
NA-ITS from YING-JI-LI(Tribulus terrestris)and RU-
AN-JI-LI(Atriplex centralasiatica)
2.3　rDNA-ITS碱基序列
　　　图 3　硬 、软蒺藜 rDNA的 ITS1 序列比较
1.硬蒺藜;2.软蒺藜
Fig.3　Alignment of ITS1 nucleotide sepuences of rDNA from
YING-JI-LI(Tribulus terrestris), shown as 1 , and RUAN-
JI-LI(Atriplex centralasiatica), shown as 2.
　　所测硬蒺藜的 rDNA-ITS 的 742 bp序列中 ,除了
42 bp的 18 S部分序列和 57 bp的 26 S 部分序列外 ,
ITS序列(包括 5.8 S)全长为 643 bp ,(g +c)含量为
59.88%,其中 ITS1为 267 bp ,(g+c)含量为 58.8%,
5.8 S为 167 bp ,(g +c)含量为 54.5%, ITS2 为 209
bp ,(g+c)含量为65.6%;而所测软蒺藜的 706 bp 的
rDNA-ITS 碱基序列其中 ,除了 42 bp 的 18 S 部分序
列 ,57 bp的 26 S部分序列外 , ITS序列(包括 5.8 S)
全长为607 bp ,(g+c)含量为 58.65%,其中 ITS1序
列长度为 220 bp ,(g +c)含量为 60.9%, 5.8 S 序列
长度为 162 bp ,(g+c)含量为 54.3%, ITS2序列长度
为225 bp ,(g+c)含量为59.6%。硬蒺藜的 ITS序列
全长比软蒺藜多 36 bp ,(g +c)含量相差 1.24%,碱
基总差异率为 36.16%,其中 , ITS1序列比软蒺藜多
47 bp , (g +c)含量相差-2.1%, 碱基差异率为
55.81% ;5.8 S序列比软蒺藜多 5 bp ,(g+c)含量
相差 0.2%,碱基差异率为 6.59%;ITS2序列比软蒺
藜少 16 bp , (g +c)含量相差 6%,碱基差异率为
56.77%。分别见 Fig.3 ,4 ,5。
　　　图 4　硬 、软蒺藜 rDNA的 5.8S序列比较
1.硬蒺藜;2.软蒺藜
Fig.4　Alignment of 5.8S nucleotide sepuences of rDNA from
YINGJILI(Tribulus terrestris), shown as 1 , and RUAN-
JILI(Atriplex centralasiatica), shown as 2.
　　　图 5　硬 、软蒺藜 rDNA的 ITS2 序列比较
1.硬蒺藜;2.软蒺藜
Fig.5　Alignment of ITS2 nucleotide sepuences of rDNA from
YINGJILI(Tribulus terrestris), shown as 1 , and RUAN-
JILI(Atriplex centralasiatica), shown as 2.
3　讨论
中药内在质量不稳定是制约中药现代化的瓶
颈 ,生药品种混乱是其中的重要因素之一 ,从源头上
对中药进行监控是实现中药质量可控的重要一环 ,
其中从分子水平上对中药(特别是外形上易混淆的)
进行种质基原鉴定往往具有不可替代的作用。
高等植物 rDNA-ITS序列的进化速度较快 ,且与
植物生活型呈相关性 ,近年已被广泛用于植物种内
变异和种间 、近缘属间的分子系统学研究[ 3 ,4] 。在
中药研究方面 , ITS 则被用来进行药材基原植物的
鉴定和道地性研究 ,能成功地对外形相似而极易混
淆的药材原植物进行分子鉴定而加以区分 ,并发现
不同分布区的中药材在 ITS 序列上存在一定的差
异 ,从而对中药材的道地性在分子水平上提供了一
定的理论依据[ 5-7] 。
硬蒺藜用药历史悠久 ,我国第一部本草专著《神
农本草经》将其列为上品 ,在历代本草中都有记载 ,
794 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.18
在我国分布广泛而且通用 ,但由于基原混淆和误用 ,
使其临床功效受到限制。本文对硬 、软蒺藜的 ITS
序列的测定发现 ,二者 ITS 序列在碱基长度及碱基
组成上都存在很大的差异(Fig.3 ,4 , 5),即使是十分
保守的 5.8 S ,其差异率也达到了 6.59%(Fig.4)。
硬 、软蒺藜 ITS 序列之间的这种差异 ,以及序列本
身 ,成为二者(尤其是外形模糊时)在分子水平上进
行基原鉴定的重要基础。因而 ,硬 、软蒺藜 ITS 基因
序列的阐明为其以及其他可能混淆品的区分和鉴定
提供了分子水平的依据 。另外 ,我们对几个不同产
地的硬 、软蒺藜的 ITS序列进行测定 ,没有发现地域
上的碱基差异 ,但硬蒺藜与 GenBank 上发表的生长
于北美洲的 Tribulus terrestris 的 ITS 序列(登录号:
AY260972)比较[ 8] ,还是存在着一定的差异 ,这说明
同种植物的 ITS 具有地域进化上的差异性 ,这也正
是 ITS在中药道地性研究应用中的理论基础 ,然而 ,
硬 、软蒺藜(尤其是硬蒺藜)的 ITS 序列在国内是否
具有地域进化上的差异性 ,尚需作进一步研究 。
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