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黑曲霉发酵法辅助提取芒萁黄酮及其抗氧化研究



全 文 :基金 项 目:广 东 省 自 然 基 金 项 目 (编 号:8151009001000029;
10151009001000011);广东省科技厅计划项目(编号:
2008B021100013)
作者简介:曾伟(1986-),男,广东工业大学在读硕士研究生。
E-mail:f12593006@126.com
通讯作者:丁利君
收稿日期:2012-02-10
第28卷第3期
2 0 1 2年5月
OOD&MACHINERY
食 品 与 机 械
Vol.28,No.3
May.2 0 1 2
10.3969/j.issn.1003-5788.2012.03.032
黑曲霉发酵法辅助提取芒萁黄酮及其抗氧化研究
Study on extraction of flavonoids fromdicranopteris linearis assisted with
Aspergillus niger fermentation and its antioxidant research
曾 伟
ZENG Wei
 
丁利君
DING Li-jun
 
黄聪华
HUANG Cong-hua
 
黎银珠
LI Yin-zhu
(广东工业大学轻工化工学院,广东 广州 510006)
(School of Chemical Engineering and Light Industry,Guangdong University of
Technology,Guangzhou,Guangdong510006,China)
摘要:该试验旨在确定黑曲霉发酵法辅助提取芒萁黄酮的最
佳提取工艺,并探讨其抗氧化性。采用黑曲霉发酵法制备混
合酶液的方法,通过单因素试验、正交试验确定提取芒萁黄
酮的最佳条件,并通过测定芒萁黄酮对羟基自由基、DPPH
的清除作用和还原力的分析,对其抗氧化活性进行研究。结
果表明,黑曲霉发酵法制备复合酶液,提取芒萁黄酮的最佳
条件为加酶量2.5mL,pH 5.0,于70℃下酶解2h;黑曲霉
产复合酶辅助提取率最高,由不加酶的 6.66% 提高到
11.67%,芒萁黄酮提取物有良好的清除羟基自由基的能力。
关键词:芒萁;黄酮;黑曲霉;抗氧化
Abstract:The flavonoids of dicranopteris linearis was extracted with
enzyme-assisted method of fermentation of Aspergillus,the optimum
extraction process was determined,and its antioxidant activity was
researched. Methods:the mixed enzyme was prepared with
Aspergillus fermentation,the best extraction conditions were deter-
mined by single-factor experiments and orthogonal test,and its an-
tioxidant activity was analyzed.Results:the optimum extraction
conditions were the amount of enzyme to 2.5mL,pH value of 5.0,
at 70℃for 2h.Aspergillus enzyme-assisted extraction produced the
highest rate,increased from 6.66%(without enzyme)to 11.67%,
The flavonoids had good scavenging ability to hydroxyl radicals,and
had good antioxidant activity and good prospects of development.
Keywords:dicranopteris linearis;flavonoids;aspergillus;antioxi-
dant
芒萁 (dicranopteris linearis),又名铁狼萁,是水龙骨目
里白科芒萁属的蕨类植物,广泛分布于中国长江以南各省
区。芒萁有很好的药用价值,其根茎及叶可治冻伤,能清热
解毒,袪瘀消肿止血[1]。它含有糖类、有机酸、黄酮类、皂苷、
强心苷、蒽醌类等有效成分,特别是总黄酮含量丰富。研
究[2,3]表明,黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、防止心血管疾
病、消炎、抗过敏、镇痛、抗菌、抗病毒等作用。目前,提取黄
酮类化合物的方法很多,如有机溶剂提取[4]、超声波[5]、超临
界流体萃取[6,7]、微波法[8]、酶法[9,10]等,而未见发酵法辅助
提取黄酮的相关报道。该法通过微生物发酵法产生复合酶
制剂,并以之分解植物细胞壁中的木质素、纤维素等大分子
物质,促进有效成分的浸出,相对超声波、超临界流体萃取、
微波法而言,设备简单,成本低。故本试验采用微生物发酵
法辅助提取芒萁黄酮,优化其提取工艺,分析其抗氧化活性,
为芒萁资源的开发与利用提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
芒萁:采摘于广州大学城。将新鲜芒萁去杂洗净,于
80℃烘干后粉碎,过80目筛,密封保存,备用。
芦丁:上海润捷化学试剂有限公司;
邻苯三酚:分析纯,天津福晨化学试剂厂;
其他试剂:均为国产分析纯;
黑曲霉:由广东工业大学轻工化工学院学院微生物实验
室提供;
固体发酵基础培养基:麸皮10g(250mL三角瓶),水
15mL,参照文献[11]制备。
1.2 主要仪器
双光束紫外可见分光光度仪:TU-1901,北京普析通用
仪器有限责任公司;
微波消解仪:XT-9900型,上海新拓微波溶样测试技术
有限公司。
511
1.3 试验方法
1.3.1 制备混合酶液 斜面培养方法挑取黑曲霉斜面保藏
菌种,接于斜面培养基培养后,用无菌水将斜面上的孢子洗
下。将1mL孢子悬液接入固体发酵培养基,于600r/min
35℃条件下震荡培养4d,50℃干燥48h,粉碎,过60目筛,
制成粉状干菌备用。称取0.500g粉状干菌,加20mL水溶
解,磁力搅拌10min,用水定容至50mL,摇匀,在4℃下存
放2d,过滤,得混合酶液,备用[12,13]。
1.3.2 总黄酮含量的测定 参照文献[8]。
1.3.3 芒萁黄酮对羟基自由基的清除作用 根据文献[14]
修改如下:在10mL试管中依次加入9mmol/L Fe2+1mL,
8.8mmol/L H2O21mL,摇匀,静置10min;取不同浓度的
样品溶液2mL,摇匀,静置10min,再加入9mmol/L水杨
酸-乙醇溶液1mL,摇匀,静置30min后,于510nm处测其
吸光值,其清除率按式(1)计算:
E= 1-Ax-AjA( )0 ×100% (1)
式中:
E——— 羟基自由基的清除率,%;
A0——— 空白对照液的吸光值;
Ax——— 加入不同黄酮浓度样品的溶液吸光值;
Aj——— 不加水杨酸的吸光值。
在文献[14]的基础上,式(1)中引入Aj是为了消除样液
本身对测定结果的干扰。
1.3.4 芒萁黄酮对DPPH的清除作用 根据文献[15]修改
如下:取不同黄酮浓度的样品(0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,
0.12 mg/mL)1 mL,与 0.5 mmoL/mL 的 DPPH 溶 液
0.25mL混合,加乙醇至10mL,在黑暗中37℃放置20min,
在517nm 测定其吸光值 Ai;0.5mmol/mL DPPH 溶液
0.25mL与1mL乙醇混合,摇匀,加乙醇至10mL,在黑暗中
37℃放置20min,在517nm测定其吸光值A0;不同浓度样
品1mL与0.25mL乙醇混合,摇匀,加乙醇至10mL,在黑
暗中37℃ 放置20min,在517nm测定其吸光值Aj。以乙醇
为空白调零。其抑制率按式(2)计算:
I= 1-Ai-AjA( )0 ×100% (2)
式中: 
I——— 抑制率,%;
A0——— 空白对照液的吸光值;
Ai——— 加入不同浓度样品的溶液吸光值;
Aj——— 样液在测定波长的吸光值。
在文献[15]的基础上,在式(2)中引入Aj是为了消除样
液本身对测定结果的干扰。
1.3.5 芒萁黄酮对还原力的影响 参照文献[16]。
2 结果与分析
2.1 黑曲霉发酵法提取芒萁黄酮的单因素试验结果
2.1.1 温度对芒萁黄酮提取效果的影响  准确称量芒萁
粉末5.0g,加入酶液2.5mL,无菌水100mL,pH 7,分别于
23(室温),30,40,50,60,70℃下浸提1.5h后,抽滤,定容至
250mL,测定总黄酮含量,分析提取温度对芒萁黄酮提取量
的影响。由图1可知,随着浸提温度的提高,芒萁黄酮的提
取率逐渐增加;在60℃后,提取率增加幅度变小,以下试验
选取60℃为提取温度。







Ex
tra
ct
io
n
pe
rc
en
ta
ge
of
fla
vo
no
id
/%
浸提温度
Temperature/℃

1
2
3
4
5
6
7
0
室温 7060504030 80
图1 提取温度对芒萁黄酮提取效果的影响
Figure 1 The influence of the temperature of extraction
of flavonoid fromDicranopteris linearis
2.1.2 浸提时间对芒萁黄酮提取效果的影响 准确称量芒
萁粉末5.0g,加入酶液2.5mL,无菌水100mL,于pH 7,
60℃下分别浸提0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0h,抽滤,定容至
250mL,测定总黄酮含量,分析浸提时间对芒萁黄酮提取量
的影响。由图2可知,随着浸提时间的增加,芒萁黄酮提取
量也呈增加趋势,但浸提时间超过1.5h后,增幅变小,以下
处理中,均采用1.5h提取。








Ex
tra
ct
io
n
pe
rc
en
ta
ge
of
fla
vo
no
id
/%
浸提时间
Time/h
6.0
5.2
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
6.2
6.4
6.6
5.0
5.4
5.6
5.8
图2 提取时间对芒萁黄酮提取率的影响
Figure 2 The influence of the time of extraction
of flavonoid fromDicranopteris linearis
2.1.3 酶液添加量对提取效果的影响 准确称量芒萁粉末
5.0g,酶液添加量分别为0,15,20,25,30,35mL,无菌水
100mL,于pH 7,60℃下浸提1.5h,抽滤,定容至250mL,
测定总黄酮含量,确定加酶液的量对芒萁黄酮提取量的影
响。由图3可知,加入酶液,芒萁黄酮提取率增加;随着加酶
量的增加而增加,增加到1.5mL后,芒萁黄酮提取率的增幅
逐渐减小。
2.1.4 pH值对芒萁黄酮提取效果的影响 准确称量芒萁
粉末5.0g,加入无菌水100mL,分别调节pH值至4,5,6,
611
提取与活性   2012年第3期
7,8,并加入黑曲霉酶液1.5mL于60℃下浸提1.5h,测定
总黄酮含量,分析pH值对芒萁黄酮提取量的影响。由图4
可知,黑曲霉在pH值为5时,芒萁黄酮的提取量达到最高。







Ex
tra
ct
io
n
pe
rc
en
ta
ge
of
fla
vo
no
id
/ %
酶液量
Enzyme volume/mL
1
2
3
4
5
6
8
0
0.0

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
7
图3 酶液量对芒萁黄酮提取效果的影响
Figure 3 The inluence of enzyme volume on extraction of
flavonoid fromDicranopteris linearis







Ex
tra
ct
io
n
pe
rc
en
ta
ge
of
fla
vo
no
id
/ %
pH
6.6
5.8
4 5 6 7 8
6.8
7.0
7.2
5.4
6.0
6.2
6.4

5.6
图4 pH值对芒萁黄酮提取效果的影响
Figure 4 The influence of pH value on extraction
of flavonoid fromDicranopteris linearis
2.2 黑曲霉提取芒萁黄酮正交试验及其结果
采用黑曲霉制备复合酶用于辅助提取芒萁黄酮,考虑到
各因素之间的相互作用,在单因素试验的基础上,对提取温
度、浸提时间、加酶量、pH值进行四因素三水平的正交试验,
从中确定微生物辅助提取芒萁黄酮的最佳提取条件,因素水
平见表1,试验设计及结果见表2。
表1 因素水平表
Table 1 Factors and levels
因素 A温度/℃ B作用时间/h  C加酶量/mL  D pH
1  60  1.0  2.5  4
2  65  1.5  3.0  5
3  70  2.0  3.5  6
由表2可知,最优组合是A3B3C3D2,即温度为70℃、加
酶量为3.5mL、时间为2h、pH值为5.0。各因素对芒萁黄
酮提取率的影响大小顺序为A>B>C>D,即提取温度对芒
萁黄酮提取率的影响比较大,主要是因为温度对酶活有较大
的影响。综合考虑各方面的影响,pH值选择5.0,加酶量为
2.5mL,即最佳提取条件为加酶量2.5mL,pH 值5.0,于
70℃酶解2h。黑曲霉发酵产生的复合酶,具有多种活性较
强的酶系,如纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、蛋白酶等,可将原料
中的纤维素等大分子化合物降解,从而破坏植物的细胞壁,
促进有效成分的提取。验证实验表明,在温度为70℃、加酶
量为2.5mL、时间为2h、pH值为5.0的条件下,芒萁黄酮
的提取率为11.67%。
表2 L9(34)正交试验设计及结果
Table 2 Analyze and results of the L9(34)
orthogonal array design
因素 A  B  C  D 黄酮提取率/%
1  1  1  1  1  6.81
2  1  2  2  2  7.79
3  1  3  3  3  8.33
4  2  1  2  3  8.87
5  2  2  3  1  9.14
6  2  3  1  2  9.77
7  3  1  3  2  10.93
8  3  2  1  3  9.41
9  3  3  2  1  11.56
K1 22.93  26.61  25.99  27.51
K2 27.78  26.34  28.22  28.49
K3 31.90  29.66  28.40  26.61
K1 7.64  8.87  8.66  9.17
K2 9.26  8.78  9.41  9.50
K3 10.63  9.89  9.47  8.87
R  2.99  1.11  0.81  0.63
A>B>C>


2.3 芒萁黄酮的抗氧化试验结果
2.3.1 芒萁黄酮对·OH 清除作用 由图5可知,对羟基
自由基的清除率随着芒萁总黄酮的增加而增加,其IC50 为
1.22mg/mL。表明芒萁黄酮对清除羟基自由基具有较好的
效果,有良好的抗氧化作用。




Sc
av
en
gi
ng
ac
tiv
ity
/%
芒萁黄酮浓度
Concentration of D. dichotoma flavonoids/(mg·mL-1)
10
0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
y=30.789x+12.417
R2=0.998
20
30
40
50
60
70
80
图5 芒萁黄酮对羟基自由基的清除作用
Figure 5 The influence of D.dichotoma
flavonoids on·OH
711
第28卷第3期 曾 伟等:黑曲霉发酵法辅助提取芒萁黄酮及其抗氧化研究  
2.3.2 芒萁黄酮对DPPH清除能力 由图6可知,随着芒
萁黄酮浓度的增加,对DPPH清除能力随之提高,芒萁黄酮
表现出一定的对DPPH清除能力。

DP
PH




Sc
av
en
gi
ng
ac
tiv
ity
/%
芒萁黄酮浓度
Concentration of D. dichotoma flavonoids/(mg·mL-1)
10
0
0.10

20
30
40
50
60
0.080.060.040.02 0.12
图6 芒萁黄酮对DPPH的清除效果
Figure 6 The influence of D.dichotoma
flavonoids on DPPH
2.3.3 芒萁黄酮对还原能力的影响 由图7可知,芒萁黄
酮的还原力随其浓度的增加而增加,表明芒萁黄酮有较强的
给予电子的倾向,使自由基转变成更稳定的状态,从而实现
其抗氧化作用。



Re
du
ci
ng
po
we
r
芒萁黄酮浓度
Concentration of D. dichotoma flavonoids/(mg·mL-1)
0
0.30
0.011
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.0090.0070.005 0.013

图7 芒萁黄酮对还原力的影响
Figure 7 The effect of D.dichotoma flavonoids
on reducing power
3 结论
采用黑曲霉发酵制取复合酶,辅助提取芒萁黄酮,不但
可以有效提高黄酮得率,还可以大大降低生产成本,为芒萁
的进一步开发提供了科学依据。芒萁黄酮有很好的抗氧化
性。关于芒萁黄酮的具体结构还需要进一步研究探讨。
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食品科学,2009,30(15):90~93.
全球液态乳制品消费持续增长
信 息 窗
第五期利乐乳业指数近日正式发布。 报告预测,未
来 3 年全球液态乳制品需求将持续增长, 液态乳制品
消费年复合增长率将从 2008 年至 2011 年间的 2.5%上
升到 2011 年至 2014 年间的 2.9%。
报告指出,发展中市场的 27 亿低收入消费者对包
装液态乳制品需求将稳步提升, 其乳制品消费量将从
2011 年的 700 亿 L 左右增长至 2014 年的约 800 亿 L,
成为乳业未来最主要的增长点之一。
报告分析显示,乳酸饮料、婴幼儿牛奶与风味奶有
望成为需求增长最快的品类。 其中,乳酸饮料凭借价廉
物美而赢得亚洲低收入消费者钟爱,2011 年至 2014 年
间其消费年复合增长率有望高达 11.9%;其次是婴幼儿
牛奶,预计其同期年复合增长率将为 9.0%。风味牛奶同
样价格低廉、 备受好评, 预计其同期年复合增长率为
4.8%
(来源:www.foodmate.net)
811
提取与活性   2012年第3期