全 文 ：　 　２０１４，Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．１２化学与生物工程
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
２４
基金项目：湖南省教育厅重点项目（１２Ａ０６３），湖南农业大学青年科学基金项目（１３ＱＮ１０）
收稿日期：２０１４－０７－３０
作者简介：郑重谊（１９８２－），男，湖南岳阳人，讲师，研究方向：微生物资源与利用，Ｅ－ｍａｉｌ：２６３０５５５７＠ｑｑ．ｃｏｍ。
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－５４２５．２０１４．１２．００７
黑毛茶中产单宁酶真菌的筛选及产酶条件研究
郑重谊１，王娇娇２，资　云２，张冬雪２，周　辉２
（１．湖南农业大学研究生院，湖南 长沙４１０１２８；２．湖南农业大学食品科技学院，湖南 长沙４１０１２８）
摘　要：采用富含单宁酸的平板培养基对黑毛茶中产单宁酶的真菌进行筛选，经纯化后初步鉴定该菌为黑曲霉，并
对其中一株黑曲霉 ＷＣ－２产单宁酶的发酵条件以及发酵培养基的组成进行了优化。优化后的条件为：五倍子渣含量
８０％，外加碳源为α－乳糖、添加量１％，外加氮源为硝酸铵、添加量０．５％，发酵温度３７℃，发酵时间７２ｈ。在此条件下，
单宁酶活力最高达到２７．０６Ｕ·ｇ－１。
关键词：单宁酶；黑曲霉；固态发酵；没食子酸
中图分类号：ＴＱ　９２０　ＴＳ　２７２．７　　　　文献标识码：Ａ　　　　文章编号：１６７２－５４２５（２０１４）１２－００２４－０４
　　湖南黑茶是以湖南黑毛茶（老青茶）为原料蒸压成
形的紧压茶的总称，它的加工包括杀青、揉捻、渥堆、干
燥等多道工序，其中渥堆是关键工序［１］，通过霉菌、酵
母、细菌等微生物的发酵［２］，形成黑毛茶的独特风
味［３］。温琼英等［４］研究发现，真菌数量随渥堆时间的
延长递增。董坤等［５］研究发现，以曲霉为主的霉菌和
以产酒精和酯等生香酵母为主的酵母菌是普洱茶渥堆
过程中的优势菌种。黑曲霉能降解单宁，产生没食子
酸［６－７］，使普洱茶形成深红色的汤色［８］。黑茶中的另一
种真菌冠突散囊菌能产生各种胞外酶，促进催化氧化、
聚合、降解、转化等反应，改善茶的品质［９］，并且该真菌
能在单宁为唯一碳源的培养基中生长，具有降解单宁
的能力，能降低茶叶苦涩味，使茶叶滋味醇和［１０］。
单宁酶，又叫单宁酯酰水解酶，可以水解没食子酸
丙酯而生成没食子酸，是目前唯一能将茶多酚中表没
食子儿茶素没食子酸酯转化为表没食子儿茶素的
酶［１１－１２］，在茶多酚单体的制备上具有重要作用。虽然
单宁酶在食品、饲料、医药等行业都有着广泛的应用，
但生产成本较高，极大地限制了单宁酶的应用。微生
物源单宁酶属于诱导酶，在制备过程中往往需要加入
单宁酸或富含单宁酸的物质（如五倍子渣）。若利用五
倍子渣作为基质直接进行固态发酵，不仅可以提高五
倍子中单宁酸的提取效率，还可以拓宽单宁酶的来源
渠道。
作者在此对湖南益阳安化黑茶产区黑毛茶渥堆过
程中产单宁酶真菌进行筛选和初步鉴定，并对其产单
宁酶条件进行优化。拟为开发利用黑毛茶渥堆过程中
的微生物资源、深入了解渥堆过程中微生物的作用机
制提供参考。
１　实验
１．１　材料与培养基
黑毛茶样品，取自湖南益阳安化县某黑茶厂渥堆
阶段，装入采集袋中，４℃保存，备用。
马铃薯培养基（ＰＤＡ）：将马铃薯去皮切块，称取
３００ｇ，加水１　０００ｍＬ，煮沸１０～２０ｍｉｎ，双层纱布过
滤，取滤液，用水补足至１　０００ｍＬ，加葡萄糖２０ｇ、琼
脂２０ｇ，自然ｐＨ值，于１２１℃下高压灭菌２０ｍｉｎ。
筛选培养基：蔗糖１．０％，ＮａＮＯ３０．３％，Ｋ２ＨＰＯ４
０．１％，ＫＣｌ　０．０５％，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ　０．０５％，ＦｅＳＯ４
０．００１％，单宁酸２％，自然ｐＨ值。
发酵培养基：称取提取单宁酸后的五倍子渣及麸
皮的混合物共５ｇ，装入２５０ｍＬ三角瓶中，加无机盐
溶液５ｍＬ。无机盐溶液组分为：ＮＨ４ＮＯ３０．５％、
ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ　０．１％、ＮａＣｌ　０．１％。
１．２　方法
１．２．１　产单宁酶真菌的筛选
称取２５ｇ黑毛茶样品，置于２２５ｍＬ无菌生理盐
水中，１０倍梯度稀释后，吸取１００μＬ稀释液，涂布在
添加了单宁酸及指示剂溴酚兰（０．００４％）的筛选培养
郑重谊等：黑毛茶中产单宁酶真菌的筛选及产酶条件研究／２０１４年第１２期 　２５　
基上，于２８℃培养５ｄ（产单宁酶真菌的生长会使培养
基由蓝色变为黄色，从而形成变色圈），挑取菌落较大
且变色圈直径较大的菌落至无菌的ＰＤＡ培养基中，
培养一定时间，取孢子进行梯度稀释，从平板上挑取单
菌落进行纯化，保存。对变色圈较大的真菌进行镜检，
初步鉴定其归属。将产酶活性最高的菌株编号为
ＷＣ－２。
１．２．２　孢子悬浮液的制备
首先将菌株 ＷＣ－２在ＰＤＡ斜面上进行活化培养，
接着取２８℃培养５ｄ的新鲜斜面若干支，每支加入５
ｍＬ无菌生理盐水，用无菌接种环将斜面上的孢子刮
下来，将孢子悬浮液移入灭菌的空三角瓶中，振荡摇
匀。以上操作均在无菌台中进行，孢子悬浮液中的孢
子数量可利用ＰＤＡ平板计数。
１．２．３　固态发酵制备单宁酶
在发酵培养基中加入１ｍＬ孢子悬浮液，充分振
荡使孢子与培养基混合均匀后，于２８℃恒温培养箱中
培养９６ｈ。
１．２．４　粗酶液的提取
从培养箱中取出发酵后的固态基质，加入５０ｍＬ
ｐＨ值为５．０的柠檬酸缓冲溶液，于１６０ｒ·ｍｉｎ－１摇
床振荡３０ｍｉｎ，过滤，即得粗酶液。
１．２．５　单宁酶活力的测定
根据单宁酶水解没食子酸丙酯可产生没食子酸，
没食子酸与甲醇绕单宁溶液在碱性条件下形成的色团
物质在５２０ｎｍ处具有最大吸收的原理进行测定［１３］。
酶活力单位定义为：在３０℃下，每分钟分解产生
１μｍｏｌ没食子酸所需要的酶量定义为一个酶活力单
位。
１．２．６　发酵温度对产单宁酶的影响
在发酵培养基中接种 ＷＣ－２孢子悬浮液后，放入
温度分别为２５℃、２８℃、３２℃、３７℃、４２℃的培养箱
中培养９６ｈ后提取单宁酶并测定酶活力，考察发酵温
度对菌株 ＷＣ－２产单宁酶的影响。
１．２．７　发酵时间对产单宁酶的影响
在发酵培养基中接种 ＷＣ－２孢子悬浮液后，于
２８℃培养箱中培养，每隔２４ｈ测定单宁酶活力。以
发酵时间为横坐标、单宁酶活力为纵坐标绘制菌株产
酶曲线，研究酶活力变化情况。
１．２．８　发酵培养基成分对产单宁酶的影响
分别考察发酵培养基中五倍子渣含量（固形物含
量，质量分数，２０％、４０％、６０％、８０％）、外加氮源
（０．５％的蛋白胨、柠檬酸铵、酵母浸膏、硫酸铵、氯化
铵、亚硝酸铵、硝酸铵）、外加碳源（１％的葡萄糖、甘露
糖、Ｄ－果糖、蔗糖、甘油、α－乳糖）对 ＷＣ－２菌株产单宁
酶的影响：在发酵培养基中接种 ＷＣ－２孢子悬浮液，于
２８℃培养９６ｈ，测定单宁酶活力。
２　结果与讨论
２．１　产单宁酶真菌的筛选
以单宁酸为唯一碳源，从渥堆的黑毛茶中筛选得
到５株具有分泌单宁酶活性的真菌（图１），分别编号
为 ＷＣ－１～ＷＣ－５，其中菌株 ＷＣ－２的产酶活性最高，经
菌丝体染色镜检，初步鉴定为黑曲霉。
图１　产单宁酶真菌的筛选
Ｆｉｇ．１　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔａｎｎａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｆｕｎｇｉ
目前报道较多的产单宁酶真菌主要来自于黑曲
霉，而黑毛茶在渥堆过程中的主要优势真菌就包括黑
曲霉。所以，从黑毛茶中分离出产单宁酶的黑曲霉进
一步验证了黑曲霉不仅参与黑毛茶的渥堆过程，还可
能参与化学物质的转化和形成。
２．２　发酵条件及发酵培养基组成优化
２．２．１　发酵温度对产单宁酶的影响（图２）
图２　发酵温度对产单宁酶的影响
Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｎ　ｔａｎｎａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
　　由图２可看出，菌株 ＷＣ－２在３７℃固态发酵下产
生的单宁酶活力最强。这与已报道过的黑曲霉产单宁
酶最佳温度不一致，可能与该菌株的生长环境有关。
因为，在黑毛茶渥堆过程中的温度往往会超过５０℃，
使得耐高温真菌得以存活和生长。因此，选择最佳发
酵温度为３７℃。
　 郑重谊等：黑毛茶中产单宁酶真菌的筛选及产酶条件研究／２０１４年第１２期２６　
２．２．２　发酵时间对产单宁酶的影响（图３）
图３　发酵时间对产单宁酶的影响
Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｏｎ　ｔａｎｎａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
由图３可看出，单宁酶的活力随发酵时间的延长
先上升后下降，在７２ｈ时单宁酶的活力达到最高，为
１１．６４Ｕ·ｇ－１。这是因为，单宁酶的合成和分泌一般
在黑曲霉生长最旺盛的阶段（即发酵７２～１２０ｈ），随
后单宁酶合成会减弱，并被蛋白酶所降解。因此，选择
最佳发酵时间为７２ｈ。
２．２．３　五倍子渣含量对产单宁酶的影响（图４）
图４　五倍子渣含量对产单宁酶的影响
Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄａｌｎｕｔ　ｄｒｅｇｓ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｎ　ｔａｎｎａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
由图４可看出，随着发酵培养基中五倍子渣含量
的增加，单宁酶活力逐渐升高，在含量为８０％时，酶活
力最高达到１３．９２Ｕ·ｇ－１。实验发现，在五倍子渣含
量超过８０％后，发酵培养基在高温灭菌后容易发生结
块，不适于固态发酵。因此，选择发酵培养基中的五倍
子渣最佳含量为８０％。
２．２．４　外加氮源对产单宁酶的影响（图５）
由图５可看出，发酵培养基中添加无机氮源有利
于单宁酶的产生，其中以硝酸铵为外加氮源时所产单
宁酶活力达到１９．６５Ｕ·ｇ－１。因此，选择最佳外加氮
源为硝酸铵，添加量为０．５％。
２．２．５　外加碳源对产单宁酶的影响（图６）
由图６可看出，添加不同碳源时，单宁酶的活力大
小依次为α－乳糖＞甘露糖＞蔗糖＞Ｄ－果糖＞甘油＞
葡萄糖，其中α－乳糖的效果最好，酶活力可达１４．６０Ｕ
图５　不同外加氮源对产单宁酶的影响
Ｆｉｇ．５　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｓｏｕｒｃｅｓ
ｏｎ　ｔａｎｎａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
图６　不同外加碳源对产单宁酶的影响
Ｆｉｇ．６　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ　ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅｓ
ｏｎ　ｔａｎｎａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
·ｇ－１。因此，选择最佳外加碳源为α－乳糖，添加量为
１％。
在上述优化的发酵条件和发酵培养基组成下，即
五倍子渣含量为８０％，外加碳源为α－乳糖、添加量
１％，外加氮源为硝酸铵、添加量０．５％，发酵温度
３７℃，发酵时间７２ｈ，单宁酶活力达到２７．０６Ｕ·
ｇ－１。
３　结论
采用富含单宁酸的平板培养基对黑毛茶中产单宁
酶的真菌进行筛选，经纯化后初步鉴定该菌为黑曲霉，
并对其中一株黑曲霉 ＷＣ－２产单宁酶的发酵条件以及
发酵培养基的组成进行了优化。优化后的条件为：五
倍子渣含量８０％，外加碳源为α－乳糖、添加量１％，外
加氮源为硝酸铵、添加量０．５％，发酵温度３７℃，发酵
时间７２ｈ。在此条件下，单宁酶活力最高达到２７．０６
Ｕ·ｇ－１。
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ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ａｓｓａｙ　ｏｆ　ｔａｎｎａｓｅ　ｕｓｉｎｇ　ｒｈｏｄａｎｉｎｅ［Ｊ］．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏ－
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，２７９（１）：８５－８９．
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔａｎｎａｓｅ－Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｆｕｎｇｉ　ｆｒｏｍ　Ｒａｗ　Ｄａｒｋ　Ｔｅａ　ａｎｄ
Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ＺＨＥＮＧ　Ｚｈｏｎｇ－ｙｉ　１，ＷＡＮＧ　Ｊｉａｏ－ｊｉａｏ２，ＺＩ　Ｙｕｎ２，ＺＨＡＮＧ　Ｄｏｎｇ－ｘｕｅ２，ＺＨＯＵ　Ｈｕｉ　２
（１．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｇｒａｄｕａｔｅ，Ｈｕｎａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０１２８，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｕｎａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０１２８，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔａｎｎａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｆｕｎｇｉ　ｆｒｏｍ　ｒａｗ　ｄａｒｋ　ｔｅａ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｐｌａｔｅ
ｒｉｃｈｅｄ　ｉｎ　ｔａｎｎｉｎｓ　ａｃｉｄ　ｗａｓ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ａｓ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ．Ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　ＷＣ－２ｗｅｒｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ａｓ　ｆｏｌ－
ｌｏｗｓ：ｄｕｌｎｕｔ　ｄｒｅｇｓ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　８０％，１％α－ｌａｃｔｏｓｅ　ａｓ　ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ　ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅ，０．５％ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｎｉｔｒａｔｅ　ａｓ　ａｄｄｉ－
ｔｉｏｎａｌ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｓｏｕｒｃｅ，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　３７℃，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　７２ｈ．Ｕｎｄｅｒ　ａｂｏｖｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，
ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔａｎｎａｓｅ　ｒｅａｃｈｅｄ　２７．０６Ｕ·ｇ－１．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔａｎｎａｓｅ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ；ｓｏｌｉｄ　ｓｔａｔｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｇ

ａｌｉｃａｃｉｄ
（上接第２０页）
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｎ－（２－（７－Ｃｈｌｏｒｏ－４－ｏｘｏ－２－（ｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）
ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎ－３（４　Ｈ）－ｙｌ）ｅｔｈｙｌ）Ａｍｉｄｅｓ
ＣＨＥＮ　Ｗｅｉ－ｊｉｅ，ＬＩＵ　Ｙｉｎ，ＹＵ　Ｙｕｎ，ＷＵ　Ｊｉｎ－ｈｏｎｇ，ＹＡＮＧ　Ｘｕ－ｈｏｎｇ
（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　＆Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｂｅｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉａｎｎｉｎｇ４３７１００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｎ－（２－（７－ｃｈｌｏｒｏ－４－ｏｘｏ－２－（ｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎ－３（４　Ｈ）－ｙｌ）ｅｔｈｙｌ）ａｍｉｄｅｓ　ｗａｓ
ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｕｓｉｎｇ　４－ｃｈｌｏｒｏ－２－ａｍｉｎｏ　ｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ　ａｓ　ｓｔａｒｔｉｎｇ　ｍａｔｅｒｉａｌ，ｔｈｅ　ｋｅｙ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　ｏｆ　７－ｃｈｌｏｒｏ－３－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ－
２－ｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ　ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｏｎｅ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｓｍｏｏｔｈｌｙ　ｖｉａａｚａ－Ｗｉｔｔｉｇ　ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｎ，ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｄｒｕｇ　ｍｏｌｅｃ－
ｕｌａｒ　ｄｅｓｉｇｎ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　ｏｆ　ｂｉｏａｃｔｉｖｅ　ｓｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ａ　ｓｅｒｉｅｓ　ｏｆ　ｎｏｖｅｌ　ａｍｉｄｅ　ａｎａｌｏｇｕｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ
ｂｙ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｅ　ｇｒｏｕｐ　ｏｆ　ｅｔｈｙｌ　ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｏｎｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｌｅａｄ　ｃｏｍｐｌｕｎｄｓ　ｏｆ　ａｍｉｄｅｓ．Ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ａｌ　ｔｈｅ
ａｍｉｄｅ　ａｎａｌｏｇｕｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　ＩＲ，１　ＨＮＭＲ，ＭＳ　ａｎｄ　ｅｌｅｍｅｎｔａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｏｎｅ；ａｍｉｄｅ；ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ