全 文 ：基因组学与应用生物学，2013年，第 32卷，第 6期，第 767-770页
Genomics and Applied Biology, 2013, Vol.32, No.6, 767-770
研究报告
Research Report
亮菌多糖的分离纯化及体内抗肿瘤活性研究
蔡凤 1, 2 解彦刚 1 * 黄纯 2 樊一桥 2
1南通职业大学化学与生物工程学院,南通, 226007; 2中国药科大学高职学院,南京, 211100
*通讯作者, x_yangang@126.com
摘 要 本文建立高效的亮菌多糖分离纯化工艺，并研究其体内抗肿瘤活性。以市售亮菌粗粉为原料，采用
水提醇沉、Sevag法脱蛋白、DEAE纤维素离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析等方法得到亮菌多
糖 ATPSⅡ和 ATPSⅡ-2；建立小鼠 S180实体瘤模型，以生理盐水和环磷酰胺为阴性和阳性对照，观察ATPSⅡ
和ATPSⅡ-2在不同剂量(10mg/kg, 40mg/kg, 80mg/kg)给药 10 d后，对小鼠肿瘤抑制的作用。结果表明：亮菌粗
粉中多糖含量为 22.7 g/100 g；紫外光谱分析显示纯化得到的ATPSⅡ纯度接近 100%；ATPSⅡ和 ATPSⅡ-2对肿
瘤的抑瘤率随着多糖浓度的增大而增大，其高剂量组对 S180的抑瘤率分别为 46.7%和 51.7%，与阳性对照
组相比，亮菌精制多糖 ATPSⅡ和 ATPSⅡ-2高剂量组抗 S180效果接近于临床化疗药环磷酰胺，具有显著
的抗肿瘤活性。
关键词 亮菌多糖,纯化,体内抗肿瘤
Study on the Isolation, Purification and Anti-tumor Activity in vivo of
Polysaccharide Extracted from Armillariella tabescens
Cai Feng1, 2 Xie Yangang1* Huang Chun 2 Fan Yiqiao 2
1 School of Chemical and Biological Engineering, Nantong Vocational College, Nantong, 226007; 2 School of Altitude Vocational, China Pharma-
ceutical University, Nanjing, 211100
* Corresponding author, x_yangang@126.com
DOI: 10.3969/gab.032.000767
Abstract A high-efficiency process for isolation and purification of polysaccharide from Armillariella tabescens as
well as the anti-tumor activity in vivo of this polysaccharide were studied in this paper. ATPSⅡ, ATPSⅡ-2, two kinds
ofArmillariella tabescens polysaccharide were isolated by ethanol subsidingmethod, sevagmethod, DEAE-cellulose
ion-exchange chromatograp, and sephdex G-100h gel filtration from commercially available powder ofArmillariella
tabescens. A mouse model of S180 solid tumor was established to observe the inhibitory effect on tumor growth in
mice. Using the normal saline and the cyclophosphamideas as negative and positive controls, the mice were treated
with different dose of Armillariella polysaccharide (10 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) for 10 days. The results showed
that the contents of polysaccharide in crude powder of Armillariella tabescens was 16.7 g/100 g, and the purity of
ATPSⅡ isolated from Armillariella tabescens in this study was nearly 100% by UV spectraum anaylisis. It was
discovered that the tumor inhibitory rate increased with the increases of concentrations of ATPSⅡand ATPSⅡ-2,
which the tumor inhibitory rate were 46.7% and 51.7% at the highest dose, respectively. The results indicated the
highest dose group of the refined ATPSⅡand ATPSⅡ-2 showed an obvious effect on inhibiting the growth of mice
sarcoma S180, which the anti-tumor activity of themwas close to the cyclophosphamideas.
Keywords Armillariella tabescens polysaccharide, Purification, Anti-tumor activity in vivo
假蜜环菌(Armillariella tabescens,又称亮菌)生长
于较湿润的阔叶树基或树桩，在我国江苏、浙江、安
徽、河北等地分布广泛，是一种价值很高的食用兼药
用大型真菌，含有多种氨基酸、多糖、多肽、亮菌甲素
等生物活性成分，我国民间流传作为治疗急慢性肝
炎及胆道疾患的中草药(高婷等, 2005)。亮菌多糖
(ATPS)是亮菌生理生化活性的主要成分之一，有研
究者提出亮菌多糖具有提高免疫力的作用和良好的
抗肿瘤活性(赵弋清等, 2006)。本实验以市售亮菌发
酵粗粉为原料，探索亮菌多糖的分离纯化工艺；通过
建立小鼠 S180肉瘤模型，对得到的精制多糖进行了
体内抗肿瘤研究，以期为亮菌多糖的临床应用提供
科学依据。
1结果与分析
1.1亮菌多糖的含量
苯酚-硫酸法测得标准曲线，拟合回归方程A=
0.0179X-0.0341，R2=0.9950。其中A为吸光度值，X为
多糖含量(μg)。测得亮菌粗粉中多糖含量为 16.7g/100g。
1.2多糖的 DEAE纤维素离子交换层析
亮菌多糖(ATPS)粉末经 DEAE纤维素离子交换
层析后，分离效果良好，得到水洗组分 ATPSⅠ和盐
洗酸性多糖组分 ATPSⅡ，如图 1所示。冷冻干燥后，
ATPSⅠ为白色精品多糖，主要成分 ATPSⅡ为淡黄
色精品多糖。两者均易溶于水，不溶于乙醚、丙酮等
有机溶剂。
1.3 ATPSⅡ紫外光谱分析
ATPSⅡ经紫外光谱分析，在波长 260 nm、280 nm
处无明显吸收峰(图 2)，说明无核酸及蛋白质，得到
的 ATPSⅡ纯度接近 100%。
1.4 ATPSⅡ的 Sephadex G-100凝胶过滤层析
ATPSⅡ浓缩液经 Sephadex G-100凝胶过滤后，
获得较好的分离(图 3)。在洗脱曲线上有两个洗脱峰，
由此可判断所得亮菌多糖中含有两种多糖。将第一
个主峰对应的 19~29管合并，进行浓缩、透析、冷冻
干燥后得一多糖组分命名为 ATPSⅡ-1；第二个主峰
对应的 31~38管合并，进行浓缩、透析、冷冻干燥后
得一多糖组分为 ATPSⅡ-2。
1.5多糖对小鼠体内 S180实体瘤的抑制作用
实验结果见表 1，亮菌多糖 ATPSⅡ低、中、高剂
量组的肿瘤抑制率分别为 10.5%、21.7%、46.7%；ATPS
Ⅱ-1的低、中、高剂量组肿瘤抑制率分别为 11.8%、
36.2%、51.7%。说明中、高剂量亮菌多糖在小鼠体内具
有显著的抗肿瘤效果，且存在剂量依赖关系，与阴性
对照组比较差异有统计学意义(p<0.01或 p<0.05)。
2讨论
亮菌是药食兼用的名贵食用菌，其中的亮菌多
糖作为有效低毒的抗肿瘤治疗药物已越来越引起人
们的关注。目前，国内外对亮菌的研究主要集中在亮
菌固态和液体深层发酵、功效成分分析等方面，而对
亮菌多糖的抗肿瘤、提高机体免疫力和防辐射等功
能虽有研究，但还不够透彻和全面，至今亮菌多糖在
临床上用于癌症治疗尚未见有文献报道(沈业寿和马
金宝, 2007)。本文为进一步深入研究亮菌多糖的分离
纯化及抗肿瘤活性奠定了良好的实验基础。
市售亮菌粗粉经水提醇沉后得到淡棕色粉末
图 2 ATPSⅡ的紫外吸收光谱
Figure 2 The UV absorption spectra of ATPSⅡ
图 3 ATPSⅡ的 sephadex G-100凝胶过滤层析洗脱曲线
Figure 3 Sephadex G-100 gel filtration chromatography elution
curve of ATPSⅡ
图 1 ATPS的离子交换层析洗脱曲线
Figure 1 Ion-exchange chromatography elution curve of ATPS
亮菌多糖的分离纯化及体内抗肿瘤活性研究
Studyon the Isolation, Purification andAnti-tumorActivity in vivoofPolysaccharideExtracted fromArmillariella tabescens 768
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
ATPS，在多糖的 DEAE纤维素离子交换层析过程
中，先用超纯水将中性多糖洗脱出柱，再用 NaCl溶
液洗脱，可避免在低浓度的 NaCl溶液作用下，少量
吸附不太紧密的酸性多糖随着中性多糖一起先被洗脱
出柱(赵伟春等, 2011)。经实验显示，NaCl浓度过低时
会导致多糖洗脱不完全而造成损失；NaCl浓度过高会
使洗脱液中混有过多的NaCl等小分子物质，给透析带
来不便。最终确定最适宜的洗脱浓度为 0.2mol/ L。
本实验对分离提纯后的 ATPSⅡ和 ATPSⅡ-1
亮菌多糖进行了体内抗肿瘤研究，以环磷酰胺作为
阳性对照，分别考察了 ATPSⅡ和 ATPSⅡ-1高、中、
低剂量对小鼠移植性实体型肉瘤 S180的抑制作用，
实验结果表明提纯后的亮菌多糖具有较好的抗肿瘤
活性，其易溶于水的特点方便于临床注射，具有良好
的开发前景。
3材料与方法
3.1材料
亮菌发酵菌粉(南京林通生物技术公司)，DEAE
纤维素(上海恒信化学试剂有限公司)，注射用环磷酰
胺(江苏恒瑞医药股份有限公司)，Sephdex G-100 (上
海生工生物工程技术服务有限公司)，其它试剂为国
产分析纯。
3.2仪器
Primo R高速冷冻离心机(Heraeus Biofuge, Ger-
man)，722分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，
BS-100A自动部分收集器(上海沪粤明科学仪器有
限公司)，FD-1B-50冷冻干燥机(常州锐品精密仪器
表 1 ATPSⅡ和 ATPSⅡ-1对小鼠移植性肿瘤S180生长的抑制作用
Table 1 Inhibitory effect of ATPSⅡ and ATPSⅡ-1 on mice transplanted tumorgrowth of S180
组别
Group
ATPSⅡ
ATPSⅡ-1
阳性对照组
The positive control group
阴性对照
The negative control group
剂量(mg/kg)
Dose (mg/kg)
80
40
10
80
40
10
20
0
数量
Number
10
10
10
10
10
10
10
10
瘤重(g)
Tumor weight (g)
0.81±0.06 **
1.19±0.08 *
1.36±0.12
0.75±0.08 **
0.97±0.09 **
1.31±0.03 *
0.45±0.12 **
1.52±0.19
抑瘤率(%)
The inhibition rate of tumor (%)
46.7
21.7
10.5
51.7
36.2
11.8
70.4
注:与阴性对照组比较; *: p<0.05 , **: p<0.01
Note: Compared with the negative control group; *: p<0.05 , **: p<0.01
有限公司)。
3.3细胞株和实验动物
小鼠肉瘤 S180，由江苏省肿瘤医院提供；ICR
小鼠，雌雄不分，18~22 g，由南通大学医学院动物实
验中心提供。
3.4试验方法
3.4.1亮菌多糖的分离提取
取亮菌粗粉 10 g，按固液比 1:10加 100℃热水，
浸提 6 h后离心分离，取上清液，沉渣再重复提取 1次，
合并上清液并浓缩至原体积的 30%。向浓缩液中加
入 Sevag试剂(氯仿:正丁醇,体积比为 5:1) 4:1混合，
振摇 30 min，离心取上清液，重复 8次。收集上层水
层(多糖层)，经蒸馏水充分透析以除去里面的小分子
杂质，经离心分离后收集上清液。
加入透析液 4倍量的 95%乙醇，醇沉 15 h后离
心分离，收集沉淀，沉淀用无水乙醇、丙酮淋洗，真空
干燥后得淡棕色 ATPS粉末。
3.4.2苯酚-硫酸法测定亮菌多糖含量(Dubois et al.,
1956)
精密称取 105℃下干燥至恒重的葡萄糖标准品
10 mg，加去离子水溶解，配制成浓度为 0.1 mg/mL的
标准溶液。精密量取标准液 0 mL、0.2 mL、0.4 mL、
0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL 加入 10 mL 具塞刻
度试管中，分别加去离子水至 2mL。各试管中分别加
入 5%苯酚溶液 1 mL、浓硫酸 5 mL，40℃水浴中恒温
30min后，取出室温放置 15min。以1mL蒸馏水、1 mL
苯酚液、5 mL浓硫酸混合液按上述操作做空白，紫
769
外分光光度计在 490 nm处测定吸光度值，绘制葡萄
糖标准曲线。
取亮菌多糖 10 mg置于 100 mL容量瓶中，加去
离子水至刻度，摇匀。按葡萄糖标准曲线项下操作，
测定吸光度值。
3.4.3 DEAE纤维素离子交换层析
将真空干燥的 ATPS粉末溶于蒸馏水中，配成
15 mg/mL的溶液。选取 1.6 cm×40 cm层析柱，柱床体
积为 80 mL，准确吸取配制好的亮菌多糖溶液 2 mL，
先用蒸馏水洗脱中性多糖，再使用浓度为 0.2 mol/ L的
NaCl，流速 1mL/min，进行直线梯度洗脱。自动部分收
集器以 5 mL/管收集，以苯酚-硫酸法检测每管洗
脱液的糖，根据吸光度绘制洗脱曲线，合并各主峰所对
应的洗脱液，蒸馏水透析后浓缩，冷冻干燥。
3.4.4紫外光谱分析
取 DEAE纤维素离子交换层析干燥后的多糖适
量，配成浓度为 1.0 mg/mL的溶液，以蒸馏水为对
照，在波长 200~400 nm区间内扫描。
3.4.5 Sephadex G-100凝胶过滤层析
选用 Φ2.2 cm×70 cm凝胶柱，用浓度 0.2 mol/L
的 NaCl充分平衡。取 DEAE纤维素离子交换层析后
冷冻干燥的亮菌多糖溶于蒸馏水中，配制 20 mg/mL
的多糖溶液，取 3 mL用滴管小心缓慢加入凝胶柱。
压力为 34 cm H2O，洗脱速度为 1.0 mL/min，自动部
分收集器以 5 mL/管收集，以苯酚-硫酸法检测每
管洗脱液的糖，根据吸光度绘制洗脱曲线，合并各主
峰所对应的洗脱液，蒸馏水透析后浓缩，冷冻干燥。
3.4.6多糖的抗肿瘤活性研究
按移植性肿瘤研究法(徐叔云等, 2002)，小鼠腹
腔注射 S180细胞后 8 d，腹部皮肤消毒，注射器抽取
S180传代细胞，离心后弃上清，无菌生理盐水调整细胞
密度为 1×108/mL，每只小鼠左侧腋部皮下接种 0.2mL
以形成实体瘤。接种 24 h称鼠重并随机分为 8组，每
组 10只。分为阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组
(环磷酰胺 20 mg/kg)、ATPSⅡ高、中、低剂量组(分别
为 80 mg/kg, 40 mgkg, 10mg/kg)、ATPSⅡ-1高、中、
低剂量组(分别为 80 mg/kg, 40 mg/kg, 10mg/kg)。除环
磷酰胺为腹腔注射给药，其余均为灌胃给药，每天给
药 1次，连续 10 d。末次给药 24 h后颈椎处死小鼠并
称重，剥取瘤块称重并记录，抑瘤率的计算方式：抑瘤
率=(1- 给药组平均瘤重/ 阴性对照组平均瘤重)×
100%。并对数据进行统计学处理(t检验)。
作者贡献
蔡凤是本研究的实验设计和实验研究的执行
人；黄纯和樊一桥参与具体实验和结果分析；解彦刚
完成论文的写作与修改。全体作者都阅读并同意最
终的论文文本。
致谢
感谢中国药科大学高职学院季常新副教授在本
实验过程中的技术支持和有益的建议。
参考文献
Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., and Smith
F., 1956, Colorimetric method for determination of sugars
and related substances, Anal. Chem., 28: 350-356
Gao T., Bai J.F., Luo X., Chen D.H., Xu F.Y., Chen Z. ,Chen Y.
Z., and Sun Q.L., 2005, The effects of armillariella polysac-
charide on the immune function of mice, Sichuan Daxue
Xuebao (Ziran Kexueban) (Journal of Sichuan University
(Natural Science Edition)), 42(2): 355-399 (高婷 , 白家峰 ,
罗霞,陈东辉,徐非一,陈智,陈咏竹,孙启玲, 2005,亮菌
粗多糖对小鼠免疫功能的影响,四川大学学报(自然科学
版), 42(2):355-399)
Shen Y.S., and Ma J.B., 2007, Present situation and pospects of
the research of Armillariella tabescens, Anhui Daxue Xue-
bao (Ziran Kexue Ban) (Journal of Anhui University Natural
Science Edition), 31(1): 82-86 (沈业寿,马金宝, 2007,亮菌
研究的现状与展望, 安徽大学学报(自然科学版), 31(1):
82-86)
Xu S.Y., Bian R.L., and Chen X., eds., 2002, Methodology of
pharmacological experiment, The Third Edition, Peoples
Medical Publishing House, Beijing, China, pp.1757-1759
(徐叔云,卞如濂,陈修,主编, 2002,药理实验方法学,第
三版,人民卫生出版社,中国,北京, pp.1757-1759)
Zhao W.C., Li L., Shen G.F., and Guo W., 2011, Study on the
isolation, purification and anti-tumor activity in vitro of the
polysaccharides extracted fromClematis huchouensisTamura,
Zhejiang Zhongyiyao Daxue Xuebao (Journal of Zhejiang
Chinese Medical University), 35(2): 240-243 (赵伟春,李莉,
沈贵芳,郭伟, 2011,湖州铁线莲多糖的分离纯化及体外抗
肿瘤活性研究,浙江中医药大学学报, 35(2): 240-243)
Zhao Y.Q., Luo X., Liu G.Y., and Yang Z.R., 2006, Effects of
armillariella tabescens polysaccharide on immunologic
function in S180 tumor bearing mice, Mianyixue Zazhi
(Immunological Journal), 22(3): 146-148 (赵弋清,罗霞,刘
高阳,杨志荣, 2006,亮菌多糖对 S180荷瘤小鼠免疫功能
的研究,免疫学杂志, 22(3): 146-148)
亮菌多糖的分离纯化及体内抗肿瘤活性研究
Studyon the Isolation, Purification andAnti-tumorActivity in vivoofPolysaccharideExtracted fromArmillariella tabescens 770