全 文 ：《食品工业》2012 年第33卷第 6 期 72
响应面法优化超临界CO2萃取苹果皮多酚的工艺及抗氧
化性研究
孙华迪，赵瑞香*，冉军舰
河南科技学院食品学院（新乡 453003）
摘 要 对红富士苹果皮中的多酚进行超临界CO2提取，采用响应曲面法，对提取工艺进行了优化设计，建立
了提取苹果多酚的二阶响应回归模型，得到了优化工艺条件为：压力35.06 MPa，温度53.04 ℃，时间2.62 h，提
取率达到最大。苹果多酚有较好的抗氧化活性，对DPPH·和NO2-·的清除能力优于BHT。
关键词 超临界CO2；苹果多酚；响应面法；抗氧化活性
Opitimization of Supercritical CO2 Extraction Conditions of Apple Peel
Polyphenols and Its Antioxidant Activities
Sun Hua-di, Zhao Rui-xiang*, Ran Jun-jian
School of food science, Henan institue of science and technology (Xinxiang 453003)
Abstract Polyphenols from Red Fuji apple peel were extracted by supercritical CO2. The extraction processing was
optimized using response surface methodology (RSM) and a second order quadratic equation for polyphenols extraction
was built. The results showed that the optimal conditions were as follows: the extraction pressure 35.06 MPa, the
extraction temperature 53.04 ℃, the extraction time 2.6 h. The content of quantity of apple polyphenols could obtain
maximum yield. Apple polyphenols had better antioxidant activities than BHT, it held stronger scavenging activities on
DPPH· and NO2-·.
Keywords supercritical CO2; apple polyphenols; response surface methodology; antioxidant activities
*赵瑞香（1966-）女，教授，博士，主要从事食品发酵微
生物的教学与科学研究。Email：zhaoruixiang@hist.edu.cn
苹果是多酚类物质的主要来源，而多酚类是与
果实品质有关的次生代谢产物。在这类水果以及它
的衍生产品中有着重要的营养，感官及商业价值。
苹果多酚具有抗氧化、抗过敏、抗龋齿、降低胆固
醇、防治心脑血管疾病、抗突变、抗癌、抑制血压
上升和提高人体应变能力等作用[1-5]，苹果中多酚
浓度的大范围变动由植物品种、果品成熟度、季节
性、曝光、地理位置、基因以及储藏条件的综合效
果决定[6-8]。
超临界流体萃取具有无毒、不燃烧、对环境友
好、产品质量高等优点，在分离、化工材料、色谱
等方面显示出广阔的应用前景[9-10]。众多学者[11-16]
利用超临界对玉米、苹果等植物中提取天然产物
进行了大量研究，为这种技术的发展奠定了重要的
基础。
响应曲面法是以回归方法作为函数估计的工具，
将多因子试验中因素与试验结果的关系用多项式近
似，把因子与试验结果的关系函数化，依次可对函数
进行全面分析，定量分析各因素及其交互作用对响应
值的影响[17]。
采用BOX-Behnken试验设计，对苹果皮中多酚的
提取工艺进行优化研究并进行抗氧化性研究，为生产
苹果多酚提供一定参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
红富士苹果（当地超市购买）；没食子酸、FC
试剂、二苯代苦味酰基自由基（DPPH·），Sigma公
司；甲醇、冰乙酸，色谱纯；乙醇、无水碳酸钠、
BHT、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺，均
为分析纯。
1.2 仪器与设备
cp2245型分析天平：Sartorius公司；超临界CO2萃
取仪：美国ISCO公司；UV-2000型紫外-可见分光光
度计：龙尼柯（上海）仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 标准曲线的制作
称取5 mg没食子酸，用体积分数为70%乙醇室温
下定容至50 mL，即得质量浓度是0.1 mg/mL的没食子
酸标准液。分别取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，
1.4，1.6 mL添加蒸馏水到100 mL容量瓶中，加入50
mL蒸馏水，加入5 mL的Folin-酚试剂，然后加入1.0
mol/L碳酸钠试剂15 mL，定容至100 mL。常温下反应
2 h后用紫外分光光度计测765 nm处的吸光度值[18]。
以没食子酸浓度为横坐标，765 nm处得吸光度值
为纵坐标，绘制标准曲线，进行回归分析。得回归方
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程为A=0.975 8C+0.0033，R2=0.999 2，其中，A为765
nm处吸光度，C为没食子酸质量。
1.3.2 苹果皮中多酚的粗提
样品清洗后，去皮，干燥后粉碎，称取100 g，加
入适量夹带剂（95%乙醇），放入萃取罐中，调节温
度、压力，时间，收集萃出物，用甲醇溶解取代没食
子酸对照品，按标准曲线法测定样品中总酚含量。
1.3.3 响应面试验设计[19]
根据文献资料[21-23]在单因素试验基础上，综合
考虑提取过程中，各个因素对苹果皮中多酚物质得率
的影响，采用统计分析软件Design-Expert8.0建立3因
素3水平的Box-Behnken模型，通过试验确定优化提取
工艺。以苹果多酚得率Y（总酚含量mg/g果皮）为响
应值，压力A，温度B，时间C为自变量，因素编码水
平见表1。
表1 自变量因素各编码水平对应的编码值
因素 名称 编码水平-1 0 1
A 压力/MPa 30 35 40
B 温度/℃ 50 55 60
C 时间/h 2 2.5 3
1.3.4 苹果多酚抗氧化性试验[18]
将160 mg/g的多酚溶液稀释成质量浓度分别为
62.5，125，250，500，1 000，2 000，4 000 μg/mL的
多酚样品液进行抗氧化性试验，与同浓度的BHT梯度
稀释液作为对照。
1.3.4.1 苹果多酚对DPPH自由基的清除效果
分别取不同质量浓度的样品溶液4 mL，加入
1mL，1 mmol/L无水乙醇配置的DPPH·溶液，用力
振摇混匀后置暗室置30 min，于517 nm出测定吸光度
值。按式(1)计算DPPH·清除率。
（1）
式中：A x为加入样品溶液和DPPH·后的吸光
度；Axo为样品溶液本底的吸光度；Ao为DPPH自由基
和蒸馏水的吸光度。
1.3.4.2 苹果多酚对NO2-·的清除效果
分别吸取5 mg/mL的亚硝酸钠标准液2 mL至于
25mL比色管中，分别加入3 mL不同质量浓度的样品
溶液，常温下反应30 min，然后分别加入0.4%对氨基
苯磺酸溶液1 mL，摇匀静置5 min，再分别加入0.2%盐
酸萘乙二胺溶液0.5 mL，用水稀释至刻度，摇匀静置
15min后于538 nm处测定吸光度。按式(2)计算NO2-·
清除率。
（2）
式中：Ao为不加样品溶液时亚硝酸钠的吸光度；
A1为加入样品溶液后亚硝酸钠的吸光度；A2为不加亚
硝酸钠时样品溶液的吸光度。
2 结果与分析
2.1 响应面优化试验结果
回归模型的建立及检验
选取压力、温度、时间三个因素，采用Box-
Behnken试验设计，对苹果皮中多酚的提取工艺进行
的优化研究，结果见表2。
表2 试验设计与结果
序列 A压力 B温度 C时间 多酚含量/(mg·g-1)
1 0 0 0 7.82
2 0 -1 -1 7.31
3 1 0 -1 7.14
4 -1 1 0 7.05
5 0 0 0 7.82
6 0 1 -1 6.81
7 -1 0 -1 6.94
8 0 -1 1 7.43
9 0 1 1 7.36
10 0 0 0 7.81
11 0 0 0 7.83
12 1 1 0 7.22
13 0 0 0 7.82
14 -1 -1 0 7.77
15 1 -1 0 7.65
16 -1 0 1 7.54
17 1 0 1 7.61
表2显示了整个响应面试验的各个参数水平试验
及其结果，用较少的试验次数和时间对试验进行全面
的考察，后续对整个结果进行分析。
2.1.2 方差分析及显著性检验
方差分析及显著性检验结果见表3和表4。
表3 回归方程系数显著性检验表
方差来源 平方和 自由度 均方 F p值
模型 1.79 9 0.20 20.44 0.000 3
残差 0.068 7 9.757×103
失拟向 0.068 3 0.023 454.00 ＜0.000 1
纯误差 2×104 4 5×105
总变异 1.86 16
C.V. %（变异系数）=1.32%， R2=0.96
由表3可知R2（决定系数）为0.96表示该模型能
够解释96%的响应值变化，拟合程度良好，试验误差
小。模型F值20.44表明本模型显著，由于干扰，只有
0.03%的可能模型中的F值（20.44）会出现，该响应
曲面设计模型为显著模型。
表4 数学模型的回归系数与显著性检验
因素 系数回归 自由度 标准误差 F值 p值
截距 7.82 1.00 0.044
A 0.040 1.00 0.035 1.31 0.289 7
B -0.21 1.00 0.035 37.90 0.000 5
C 0.22 1.00 0.035 38.79 0.000 4
AB 0.072 1.00 0.049 2.15 0.185 6
AC -0.032 1.00 0.049 0.43 0.531 5
BC 0.11 1.00 0.049 4.74 0.066 0
A2 -0.16 1.00 0.048 10.88 0.013 2
B2 -0.24 1.00 0.048 24.60 0.001 6
C2 -0.35 1.00 0.048 54.00 0.000 2
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从表4回归方程系数显著性检验可知，模型一次
项B，C显著，A不显著；二次项B2，C2显著，A2不显
著；交互项AB，AC，BC不显著。各因素对多酚得率
的影响不是简单的线性关系，利用软件对表5中的数
据进行二元回归分析，得到各因子对多酚得率（Y）
影响的二次多项回归模型：
Y=7.82+ 0.04A- 0.21B+ 0.22C+ 0.072AB-
0.032AC+ 0.11BC- 0.16A2- 0.24B2- 0.35C2
2.1.3 响应面因子交互与分析
二阶回归模型的响应面和等高线图分别见图
1~3。通过图中各因素对响应值的直观分析，可以对
两因素间的交互作用进行评价，并根据回归方程求出
优化工艺条件。
图1 压力和温度对苹果皮中多酚提取率的二阶响应
面和等高线
由图1可知，随着压力的增加，提取率逐渐升
高，随着温度升高，提取率先增后降，但是在55 ℃，
多酚提取率达到最大值。从等高线可以看出，两因素
的交互作用不显著。
图2 时间和压力对苹果皮中多酚提取率的二阶响应
面和等高线
由图2可知，随着提取时间的增大，提取率也随
之增大；随着压力的增大，多酚提取率增大。当时间
超过2.5 h，随着压力的增大，提取率变化很小，由等
高线可以看出两因素的交互作用不显著。
图3 时间和温度对苹果皮中多酚提取率的二阶响应
面和等高线
由图3可知，随着温度的递增，多酚提取率先降
后增；随着时间的延长，多酚提取率先升高后不变，
由等高线可知两因素交互作用不显著。
2.1.4 最佳工艺参数及验证试验
通过design expert8.0优化的工艺条件为提取总
酚的优化工艺条件为：压力35.06 MPa，温度53.04
℃，时间2.62 h，提取率为7.89 mg/g。在优化条件下
做5次重复试验得到相对标准偏差进行验证，结果见
表5。
表5 验证试验
测定值 平均值 RSD/%
7.93
7.87 0.78
7.85
7.74
7.93
7.91
由表5可知，通过用优化方案验证得到的试验
获得的数据与理论值7.89接近，相对标准偏差为
0.78%，故Box-Behnken设计试验所见优模型能够预测
超声波辅助提取苹果皮中多酚的得率。
2.2 苹果皮中多酚的抗氧化性试验
2.2.1 苹果多酚对DPPH·的清除效果
图4 苹果皮中多酚与BHT对DPPH·清除率比较
由图4可知，在试验质量浓度范围内，苹果皮中
多酚和BHT对DPPH·的清除效率随浓度的增大而增
大。在质量浓度小于2 000 μg/mL时，苹果多酚的清除
率高于BHT的，在质量浓度大于2 000 μg/mL时，二者
相当。
2.2.2 苹果多酚对NO2-·的清除效果
图5 苹果多酚和BHT对NO2-·的清除效果
由图5可知，在试验质量浓度范围内，苹果多酚
和BHT对NO2-·的清除效果与质量浓度也成正相关，
苹果多酚的清除效率较BHT的好，当质量浓度大于
1 000 μg/mL时，清除效率趋于平衡，不随质量浓度的
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增大的明显增大。
3 结论
通过采用响应面法，对苹果皮中多酚的超声提
取工艺进行了优化设计，建立了提取苹果多酚的二
阶响应回归模型，结果表明，提取总酚的优化工艺
条件为：压力35.06 MPa，温度53.04 ℃，时间2.62
h，提取率为7.89 mg/g；苹果多酚具有较好的清除
自由基的作用,结果表明：苹果多酚和BHT对DPPH
自由基的清除效率随浓度的增大而增大，苹果多酚
的清除率高于BHT；苹果多酚和BHT对NO2-·的清
除效果与质量浓度也成正相关，苹果多酚的清除效
率高于BHT。苹果多酚是好的氢供体，能使具有高
度氧化性的自由基还原，由于电子离域作用而形成
相对来说较稳定的自由基，因此能够终止自由基链
式反应，阻止新的自由基产生。苹果多酚作为抗氧
化剂时可能以相互协同的机制起作用，易于被氧化
的酚能被活性较低的酚再生。从而其抗氧化活性好
于单一抗氧化剂BHT。但是，苹果皮中多酚的协同
与拮抗作用还需对其中的单一酚做进一步的研究
探讨。
参考文献：
[1]Lu Y,Foo L Y. Antioxidant and radical scavenging activities
of polyphenols from apple pomace[J]. Food Chem, 2000, 68:
81-85.
[2]金莹. 苹果多酚的超声波提取及其抗氧化性研究[D]. 泰安:
山东农业大学, 2006.
[3]梁峙. 苹果多酚的功效研究与应用[J]. 农牧产品开发, 1998,
6: 18.
[4]Tanabe,Masayuki,Kanda,et al. Process for the production of
fruit polyphenols from unripe rosaceae fruit[J]. United States
Patent, 1999, 413.
[5]姬德衡,孔繁东,候春青. 苹果多酚的开发与应用[J]. 中国果
菜, 2001(2): 26.
[6]曲恩超,魏福祥. 苹果多酚的研究进展[M]. 河北化工, 2006,
1: 5-8.
[7]陈莹,徐抗震,聂威,等. 苹果生果中苹果多酚提取工艺的优
化研究[M]. 应用化工, 2009, 38(11).
[8]缪晓平,邓开野,谭梅唇. 苹果渣中多酚物质的提取工艺研
究[J]. 安徽农业科学, 2010, 38(20): 11004-11005.
[9]Casal E,RamÄÄrezP,IbaÄÄez E,et al. Effect of supercrit
icalcarbon dioxide treatment on the Maillard reaction
in model foodsystems[J]. Food Chem istry, 2006, 97(2):
272-276.
[10]Liu J C,Raveendran P,Shervani Z,et al. Synthesis of Ag
and AgIquantum do ts in AOT2stabilized water2in2 CO2
microemulsions[J]. Chemistry-A European Journal, 2005,
11(6): 1854-1860.
[11]陈芹芹,李景明,胡雪芳,等. 响应面法优化超临界CO2流
体萃取苹果籽油的工艺研究[J]. 食品科学, 2009, 30(14):
47-51.
[12]宋师花,贾晓斌,陈彦. 超临界CO2萃取灵芝子实体中
的三萜类成分[J]. 中国中药杂志, 2008, 33(17): 2104-
2107.
[13]曾汉庭,王俊,陈金国. 蛋黄油的超临界CO2萃取及色
谱分析[J]. 湖北农业科学, 2008, 47(11): 1323-1324,
1345.
[14]杨庆利,禹山林,秦松. 超临界CO2流体萃取海滨锦葵
籽油的工艺条件优化[J]. 农药工程学报, 2009, 25(5):
253-257.
[15]陈丽娜,石矛,吴琼. 采用超临界流体萃取技术对玉
米胚脱脂的工艺研究[J]. 食品工业科技, 2010, 31(6):
273-275.
[16]盛桂华,周泉城. 超临界CO2萃取山豆根氧化苦参
碱最佳条件的研究[J]. 湖北农业科学, 2007, 46(6):
1009-1012.
[17]李涛,岳田利,袁亚宏. 苹果多酚提取的响应曲面法优化研
究[J]. 食品科技, 2007, 32(8): 118-121.
[18]郝少莉,仇农学,王宏. 苹果渣中多酚物质的提取技术研究
[J]. 西北农学报,2010, 19(8): 126-131.
[19]王临宾,马倩倩,徐怀德,等. 超声波辅助提取苹果叶多
酚及其抗氧化性研究[J]. 西北农业学报, 2010, 19(8):
126-131.
[20]Hilde HennyWijngaard,Nigel Brunton. The optimisation
of solid-liquid extraction of antioxidants from apple pomace
by response surface methodology[J]. Journal of Food
Engineering, 2010, 96: 134-140.
[21]白雪莲,岳田利,章华伟,等. 响应曲面法优化微波辅
助提取苹果渣多酚工艺研究[J]. 中国食品学报, 2010,
10(4).
[22]Emilie DevicSulvain,Guyot Jean-Dominique,Daudin
Catherine Bonazzi. Kinetics of Polyphenol Losses During
Soaking and Drying of Cider Apples[M]. Food Bioprocess
Technol, 2010, (3):867-877.
[23]P. Senthil Kumar N,Arun Kumar. Experimentation on
solvent extraction of polyphenols from natural waste[J]. Mater
Sci, 2009, (44):5894-5899.
工艺技术