全 文 ：［收稿日期］ 20120818(004)
［基金项目］ 贵州省固体废弃物综合利用科技创新人才团队项
目(黔科合人才团队［2010］4011 号)
［通讯作者］ * 叶敏，硕士，讲师，从事中草药活性成分的分离
与纯化方面的研究，Tel:15721748638，E-mail:
yemin0213@ 163． com
追风伞总黄酮提取工艺优选及其体外抗氧化作用考察
叶敏* ，孔维兵，王小英
( 毕节学院化学与化学工程学院，贵州 毕节 551700)
［摘要］ 目的:优选追风伞中总黄酮的提取工艺，并考察其体外抗氧化作用。方法:以总黄酮得率为指标，选取料液比、
乙醇体积分数、回流时间与温度为考察因素，采用单因素试验和正交试验优选追风伞总黄酮的提取工艺;采用紫外分光光度
法测定追风伞总黄酮对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用和还原能力。结果:追风伞总黄酮的最佳提取工艺为乙醇
体积分数 65%，料液比 1∶ 25，回流温度 65 ℃，回流时间 4 h，黄酮得率 1. 69%;追风伞总黄酮具有较好的还原能力和抑制自由
基的能力，且随黄酮质量浓度的增加，还原能力和抑制能力提高。结论:追风伞总黄酮具有明显的抗氧化作用。
［关键词］ 追风伞;黄酮;提取工艺;抗氧化作用
［中图分类号］ R283. 6 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)01-0044-03
Optimization of Extraction Technology and Investigation of in vitro
Antopxidation for Total Flavonoids from Lysimachia paridiformis
YE Min* ，KONG Wei-bing，WANG Xiao-ying
(School of Chemistry and Chemical Engineering，Bijie University，Bijie 551700，China)
［Abstract］ Objective:To optimize extraction technology of total flavonoids from Lysimachia paridiformis，
and investigate its in vitro antopxidation． Method:With yield of total flavonoids as index，single factor and
orthogonal test were used to optimized extraction technology of total flavonoids from L． paridiformis with solid-liquid
ratio，the concentration of ethanol，reflux time and temperature as factors;Scavenging action and reducing power
of total flavonoids on hydroxyl radical and superoxide anion free radical were determined by UV spectrophotometry．
Result:Optimum extraction technology of total flavonoids from L． paridiformis was:ethanol concentration 65%，
ratio of solid-liquid 1∶ 25，reflux temperature 65 ℃，extraction time 4 h，yield of total flavonoids of 1. 69%;
Total flavonoids from L． paridiformis had good reducing power and ability to inhibit free radical，and reducing
power and scavenging hydroxyl radical activity increased with increasing the concentration of total flavonoids．
Conclusion:total flavonoids from L． paridiformis had significant antopxidation．
［Key words］ Lysimachia paridiformis;flavonoids;extraction technology;antopxidation
追风伞主要分布在我国西南地区，在贵州作为
苗药使用，具有祛风通络、活血止痛等功效，临床用
于治疗风湿痹痛、四肢拘挛、半身不遂、骨折等症，其
所含黄酮类成分含量丰富［1-2］。本试验拟采用单因
素试验与正交试验优选追风伞中总黄酮的提取工
艺，并考察总黄酮的抗氧化作用，为追风伞的资源综
合利用提供基础数据。
1 材料
FA2004N型电子分析天平(上海菁海仪器有限
公司) ，V-5800 型可见分光光度计(上海元析仪器有
限公司) ，芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，
批号 200707) ，其余试剂均为国产分析纯，追风伞药
材购于毕节市利民中西药店，经毕节学院蒋洁云副
教授鉴定为报春花科植物狭叶落地梅 Lysimachia
paridiformis Franch． var． stenophylla Franch． 的全草
或根，50 ℃烘干后粉碎成粉末，备用。
2 方法与结果
2. 1 追风伞总黄酮的提取 称取追风伞粉末 3 g
于 250 mL烧瓶中，加入一定体积分数的乙醇溶液加
·44·
第 19 卷第 1 期
2013 年 1 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 1
Jan．，2013
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2013.01.018
热回流提取，过滤后得滤液和滤渣，滤渣按上述方法
提取 2 次，合并滤液，减压浓缩，加入相应体积分数
的乙醇溶液定容至 50 mL量瓶，作为总黄酮试液。
2. 2 追风伞总黄酮的含量测定
2. 2. 1 标准曲线的绘制［3］ 精确称取芦丁对照品
0. 010 g，加 85%乙醇溶解并定容至 100 mL量瓶中，
制成 0. 1 g·L －1的芦丁对照品溶液。准确吸取 0，
1. 0，2. 0，3. 0，4. 0，5. 0 mL芦丁对照品溶液至 25 mL
比色管中，分别编号为 0 ～ 5，用 85%乙醇补至 10
mL，加入 5%亚硝酸钠溶液 0. 80 mL，混匀，放置 10
min;加入 10%硝酸铝溶液 0. 80 mL，混匀，放置 10
min;加入 4%氢氧化钠溶液 10mL，混匀后放置 10
min;加入 85%乙醇至刻度，摇匀，放置 10 min 后于
510 nm波长处测定各管的吸光度(A，以 0 号管为空
白) ，以芦丁质量浓度(C)为横坐标，A 为纵坐标，得
到回归方程 A = 17. 325C + 0. 071 3(R2 = 0. 994 6) ，
线性范围 0. 004 ～ 0. 029 g·L －1。
2. 2. 2 样品测定［4］ 准确移取黄酮试液 1 mL，置
于 10 mL量瓶中，按 2. 2. 1 项下方法在 510 nm波长
处测定 A，根据回归方程计算出黄酮质量浓度(以
85%乙醇为空白) ，按下式计算总黄酮得率。
总黄酮得率 = CV1V2 /1 000mV0 × 100%。
式中 C为黄酮质量浓度;V0 为测定 A时所用样
液的体积;V1 为测定时样液稀释的体积;V2. 样液定
容的体积;m为样品质量。
2. 3 提取工艺优选
2. 3. 1 单因素试验
2. 3. 1. 1 乙醇体积分数考察 称取追风伞粉末 3
g，共 4 份，分别加入 25 倍量体积分数为 55%，65%，
75%，85%的乙醇溶液，于 75 ℃恒温水浴中回流提
取 2 h，按 2. 2. 1 方法测定 A，结果总黄酮得率分别
为 1. 1%，1. 65%，1. 03%，0. 41%。说明 65%乙醇
提取时总黄酮得率最大，继续增加乙醇体积分数，黄
酮得率呈现下降趋势。可能随乙醇体积分数的提
高，使得蛋白质等生物大分子在其发生凝聚并滞留
在颗粒内部的通道内，从而加大了黄酮类物质扩散
的阻力，水的减少同时削弱了对颗粒细胞的溶胀，所
以乙醇体积分数提高到一定程度后黄酮类物质的浸
出率反而降低［8］。
2. 3. 1. 2 料液比考察 称取追风伞粉末 3 g，共 4
份，按料液比 1∶ 15，1∶ 25，1∶ 35，1∶ 45 加入 65%乙醇
溶液，于 75 ℃恒温水浴中回流提取 2 h，按 2. 2. 1 项
下方法测定 A，结果总黄酮得率分别为 0. 35%，
1. 03%，0. 91%，0. 9%。说明料液比 1∶ 25 时黄酮得
率最高，之后随料液比的增大，总黄酮提取效果反而
降低，可能是因为较大料液比对多糖类物质的溶解
度增大［9］。
2. 3. 1. 3 回流时间考察 称取追风伞粉末 4 份，每
份 3 g，加 25 倍量 65%乙醇于 75 ℃恒温水浴中分别
回流提取 2，3，4，5 h，按 2. 2. 1 项下方法测定 A，结
果总黄酮得率分别为 0. 69%，1. 43%，1. 64%，
1. 16%。说明回流 4 h时，总黄酮得率最大，之后随
时间的延长，黄酮得率反而下降，可能是因为回流时
间太长，已经溶出的化合物成分相互发生作用，从而
破坏某些黄酮类化合物的结构［9］。
2. 3. 1. 4 回流温度考察 称取追风伞粉末 4 份，每
份 3 g，加 25 倍量 65%乙醇分别于 60，65，70，75 ℃
恒温水浴回流提取 4 h，按 2. 2. 1 项下方法测定 A，
结果总黄酮得率分别为 0. 62%，1. 17%，0. 76%，
0. 69%。说明 65 ℃时总黄酮得率最大，继续升高温
度，黄酮得率呈现下降趋势。可能是因为一些对温
度比较敏感的黄酮类物质会被破坏［9］。
2. 3. 2 正交试验 在单因素试验基础上，以总黄酮
得率为指标，选取乙醇体积分数、料液比、回流温度、
回流时间为考察因素进行正交试验。因素水平表见
表 1，试验安排及结果见表 2。
表 1 追风伞中总黄酮的提取工艺正交试验因素水平
水平
A
乙醇体积分数
/%
B
料液比
/ g·mL －1
C
回流温度 /℃
D
回流时间 /h
1 55 1∶ 25 60 3
2 65 1∶ 35 65 4
3 75 1∶ 45 70 5
表 2 追风伞中总黄酮的提取工艺正交试验安排
No． A B C D 总黄酮得率 /%
1 1 1 1 1 1. 15
2 1 2 2 2 1. 49
3 1 3 3 3 1. 16
4 2 1 2 3 1. 67
5 2 2 3 1 1. 58
6 2 3 1 2 1. 42
7 3 1 3 2 1. 53
8 3 2 1 3 1. 13
9 3 3 2 1 1. 33
K1 1. 267 1. 450 1. 233 1. 353
K2 1. 557 1. 400 1. 497 1. 480
K3 1. 330 1. 303 1. 423 1. 320
R 0. 290 0. 147 0. 264 0. 160
由表 2 结果可知，4 个因素对总黄酮得率的主
次影响顺序为乙醇体积分数 ＞回流温度 ＞回流时
间 ＞料液比，确定最佳工艺条件为 A2B1C2D2，即乙
·54·
叶敏，等:追风伞总黄酮提取工艺优选及其体外抗氧化作用考察
醇体积分数 65%，料液比 1∶ 25，回流温度 65 ℃，回
流时间 4 h。在最佳工艺条件下，通过验证试验得到
追风伞总黄酮得率为 1. 69%。
2. 4 体外抗氧化试验
2. 4. 1 还原能力的测定［5］ 还原能力是考察活性
物质提供电子或氢原子的能力，是物质抗氧化能力
的一种表现形式［9］。本试验采用铁氰化钾法。取
不同质量浓度(0. 05，0. 15，0. 25，0. 35，0. 45 mg·
L －1)总黄酮样品溶液 2 mL，加入 pH 6. 6 磷酸盐缓
冲溶液 2. 5 mL和 1%铁氰化钾溶液 2. 5 mL，摇匀，
于 50 ℃水浴中保温 20 min;加入 10%三氯乙酸溶
液 2. 5 mL，混合后离心，取上清液 2. 5 mL并加入蒸
馏水 2. 5 mL和 0. 1%三氯化铁溶液 0. 5 mL，迅速混
匀，测定溶液在 700 nm 波长处的吸光度(A) ，结果
分别为 0. 189，0. 265，0. 425，0. 565，0. 698。
2. 4. 2 羟自由基的生成及清除率的测定［6］ 羟自
由基是目前已知的氧化性最强的自由基，反应性极
强，几乎可以和所有细胞成分发生反应，对机体危害
极大［10］。本试验采用 Fenton 反应进行测定。在
1. 5 mL 5 mmol·L －1邻二氮菲无水乙醇溶液中加入
0. 75 mol·L －1磷酸盐缓冲溶液(pH 7. 4)4. 0 mL，充
分混匀后加入 7. 5 mmol·L －1硫酸亚铁溶液 1. 0 mL，
每加 1 种试剂立即摇匀，加入不同质量浓度(0. 025，
0. 05，0. 075，0. 10，0. 125 mg·L －1)总黄酮样品溶液
2. 5 mL，最后加入 1%H2O2 1. 0 mL。将反应液于 37
℃水浴中保温 1 h，在 536 nm 处测定 A。空白组以
等体积蒸馏水代替样品溶液测定 A;对照组以蒸馏
水代替 1% H2O2 和样品溶液测定 A，按下式计算清
除率 分 别 为 24. 1%，73. 5%，77. 3%，81. 5%，
88. 6%。说明追风伞总黄酮对羟基自由基的清除作
用随质量浓度的增加而增强，不同质量浓度总黄酮
对羟自由基均具有一定的抑制能力。
清除率 =(A样品 － A空白)/(A对照 － A空白)× 100%。
2. 4. 3 超氧阴离子自由基的生成及清除率的测
定［7］ 采用邻苯三酚法进行测定。取 Tris-HCl缓冲
液(50 mmol·L －1，pH 8. 2)4. 5 mL和蒸馏水 2 mL置
于试管中，混合均匀，室温下平衡 4 min，加入 7
mmol·L －1邻苯三酚溶液 0. 4 mL，迅速混匀后转入比
色皿中，在 325 nm处每隔 30 s测定 A0，计算每分钟
A的增加量△A0;依上法，取 Tris-HCl 缓冲液 4. 5 mL
和不同质量浓度(0. 025，0. 05，0. 075，0. 10，0. 125
mg·L －1)总黄酮提取液 2 mL，混匀后在室温下放置
4 min，立即加入邻苯三酚溶液 0. 4 mL，测定加入总
黄酮提取液后每分钟 A 的增加△A，重复 3 次试验，
求平均值，按下式计算清除率分别为 11. 1%，
18. 8%，24. 0%，30. 2%，32. 5%。说明追风伞总黄
酮对超氧阴离子自由基的清除作用随总黄酮质量浓
度的增加而增强。
清除率 =(△A0 －△A)/△A0 × 100%。
3 讨论
自由基是细胞的正常代谢产物，当机体内自由
基产生过多或机体清除自由基能力下降时，会对
DNA，蛋白质和脂质等生物大分子产生氧化损伤作
用、引起机体组织器官发生各种病变［6］，因此，对清
除自由基的抗氧化剂的研究受到人们的普遍关注，
寻找安全、有效的天然抗氧化剂已成为当前研究的
热点。本试验采用乙醇回流提取法提取追风伞总黄
酮，通过单因素实验和正交实验确定了追风伞中总
黄酮的最佳提取工艺条件，同时初步探讨了追风伞
中的黄酮提取物的抗氧化效果，结果表明追风伞总
黄酮具有较好的还原能力和抑制自由基生成的能
力，且随总黄酮质量浓度的增加，其还原能力和抑制
自由基能力有一定程度的提高。说明追风伞总黄酮
具有一定的体外抗氧化能力。
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［责任编辑 仝燕］
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第 19 卷第 1 期
2013 年 1 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 1
Jan．，2013