全 文 ：收稿日期: 2007-12-14　修回日期: 2008-01-25
基金项目: 浙江省科技厅重大科技攻关项目 ( No2005C13026) ;浙江省中医药管理局重点科研基金项目 ( 2006Z016)
作者简介: 应景艳 ( 1983- ) ,女 ,药物分析硕士研究生 .
通讯作者: 姚彤炜 ( 1953- ) ,女 ,硕士 ,教授 ,硕导 ; Email: y ao tw@ zju. edu. cn
http:∥ w w w. journals. zju. edu. cn /med
鸡肝散药效成分木犀草素在大鼠体内的排泄研究
应景艳 ,李　翔 ,王锦磊 ,姚彤炜
(浙江大学药学院药物分析与药物代谢研究室 ,浙江 杭州 310058)
[摘　要 ]　目的:建立 RP-HPLC法测定大鼠尿、粪便、胆汁中鸡肝散药效成分—— 木犀草素的含
量 ,研究木犀草素在 SD大鼠中的排泄情况。方法:给 SD大鼠灌胃鸡肝散提取物后 ,于不同时间段采
集尿样、粪便、胆汁 ,经处理后 ,以苷元木犀草素为目标物 ,分别测定其在不同时间段尿样、粪便、胆
汁中的浓度。结果:尿样、粪便、胆汁中木犀草素的方法回收率为 98. 00% ～ 106. 00% ,提取回收率为
85. 00% ～ 108. 00% ,日内及日间精密度均小于 10. 00% 。木犀草素的总累积排泄率约为 37% (测得
尿中约 11% ;粪便和胆汁中各约 26% )。结论:建立的大鼠尿、粪便、胆汁中木犀草素的含量测定方法
具有灵敏、准确 ,专属性强等特点。
[关键词 ]　木犀草素 /分析 ; 胆汁 ; 尿 ; 粪便 ; 色谱法 ,高压液相 ; 反相高效液相色谱 ; 鸡肝散提取
物 ; 排泄
[中图分类号 ]　 R 284. 1　　 [文献标识码 ]　 A　　 [文章编号 ]　 1008-9292( 2008) 02-0139-07
Luteolin excretion after oral administration of Elsholtz ia blanda benth
extracts in rats
YIN G Jing-yan, LIXiang , WANG Jin-lei , YAO Tong-w ei (Department of Pharmaceutical Analysis
and Drug Metabolism , College of Pharmaceutical Sciences , Zhejiang University , Hangzhou
310058,China)
[ Abstract ]　 Objective: To observ e the excretion o f luteolin af ter o ral administ ration of
Elsholtz ia blanda benth ex t racts in ra ts. Methods: Samples of urine, feces and bile were collected
af ter oral administ ration o f Elshol tzia blanda benth ex t racts in ra te. Af ter deconjugation wi th β
-g lucuronidase /sulfatase, the levels of luteo lin in urine, feces and bi le w ere mea sured by RP
-HPLC. Results: The recovery rate of luteolin w as 98. 0% -106. 0% and the ex tract recoveries
w ere 85. 0% -108. 0% . Rela tiv e standard devia tion ( RSD) of int ra- and inter-day assay was less
than 10. 0% . The to tal accumula tiv e excretion was 37% ( 11% in urine, 26% in feces and bile) .
Conclusion: The established RP-HPLC method is sensitiv e, speci fic, accurate, and is applicable fo r
determination of luteolin in ra t urine, feces and bile.
[Key words ]　 Luteolin /anal; Bi le; Urine; Feces; Ch romatog raphy, high pressure liquid; RP
-HPLC; Elsholtzia blanda benth ex t racts; Excretion
[ J Zhejiang Univ ( Medical Sci) , 2008, 37( 2): 139-145. ]
第 37卷　第 2期
2008年
浙 江 大 学 学 报 ( 医 学 版 )
JOU RNAL OF ZHEJIANG UN IV ERS ITY ( M EDICAL SC IEN CES)
Vo l 37　 No 2
2008
　　鸡肝散为双子叶植物药 ,唇形科香薷属植
物四方蒿Elsholtz ia blanda ( Benth. ) Benth.的
全草 ,又名四方蒿、滇香薷、四棱蒿等。其叶、花
或全草均可入药 ,用于治疗感冒、痢疾、肝炎、急
慢性肾盂肾炎等病症。
鸡肝散化学成分复杂多样 ,提取分离后 ,根
据理化性质和光谱分析 ,确定这些化合物为木
犀草素 ,木犀草素 -7-O-β -D-葡萄糖苷 ,木犀草
素 -5-O-β-D-葡萄糖苷 , 5-羟基-7, 8-二甲氧基黄
酮和 5-羟基 -6, 7-二甲氧基黄酮等 [1-3 ]。
经研究表明鸡肝散总黄酮对实验性心肌缺
血具有良好的保护作用 [ 4-5 ] ,除了对胸痹症有明
显的改善 [6 ]之外 ,还显示良好的抗缺血性心律
失常的功能 [7 ]。
我们在对鸡肝散在大鼠体内血药浓度变化
研究基础上 ,为了进一步认识其在大鼠体内的
动态变化规律和特点 ,建立了大鼠尿、粪便、胆
汁中鸡肝散活性成分—— 木犀草素含量的
HPLC法测定方法 ,并研究了鸡肝散药效成分
木犀草素在大鼠体内的排泄情况。
1　仪器和动物及试剂
Agi lent 1100高 效液相 色谱仪 (包括
G1311A脱气器、 G1311A四元泵、 G1329A自
动进样器、 G1330B恒温进样器、 G1316A柱温
箱、 G1314A VWD检测器、 HP ChemStations
数据处理软件 ,安捷伦科技有限公司 ) ; TGL
-16C台式离心机 (上海安亭科学仪器厂 ) ;
AL104电子天平 (梅特勒 -托利多仪器上海有
限公司 ) ; KQ-250DB型数控超声清洗器 (昆山
市超声仪器有限公司 )。
健康雄性 SD大鼠 ,体重 180 g左右 (浙江医
科院提供 , SCXK(浙 ) 2003-0001)。鸡肝散提取
物 (浙江大学药学院中药与天然药物化学研究
室提供 ) ;木犀草素对照品 (中国药品生物制品
检定所 , 111520-200201) ; 葡萄糖醛酸酶 (β
-Glucuronidase f rom Bovine Liv er, Sigma,
G0501) ;硫酸酯酶 ( Sulfatase Solution, Sigma,
S9751) ;甲醇、乙腈为色谱纯 ;色谱用水为超纯
水 ;磷酸二氢钾、羧甲基纤维素钠等均为分析纯
试剂。
2　方　法
2. 1　色谱条件　色谱柱: Diamonsil C18色谱
柱 ( 200× 4. 6 mm , 5μm);流动相: 乙腈 -pH
2. 0, 0. 01 mo l· l- 1磷酸二氢钾溶液梯度洗脱
(见表 1) ;流速: 1. 0 ml· min- 1 ;检测波长: 350
nm;柱温: 25℃ ;进样量 20μl。
表 1　流动相中乙腈所占比例
Table 1　 The percentag e of acetonit ri le in the
mobile phase
t /min 0 10 15 25 30
Acetonitrile /% 20 25 30 40 40
2. 2　溶液配制　木犀草素对照品溶液:取木犀
草素 10 mg ,精密称定 ,置于 10 ml量瓶中 ,加甲
醇溶解 ,稀释到刻度 ,摇匀 ,即得浓度为 1 000
μg· ml- 1的储备液。
鸡肝散提取物混悬液: 称取 CMC-Na 0. 5
g ,溶于 100 m l的沸水中 ,配成 0. 5%的溶液 ,放
冷 ,备用。 称取鸡肝散提取物适量 ,加入上述所
配的 0. 5% CMC-Na溶液适量 ,涡旋混匀 ,制成
浓度为 20 mg· ml- 1的鸡肝散提取物混悬液 ,
备用。
2. 3　给药方案与生物样品采集
2. 3. 1　尿样粪样的收集:大鼠 5只 ,在禁食过
夜后 ,先收集空白尿与粪便 ,再灌胃给予 180
mg· kg- 1鸡肝散提取物 CMC-Na混悬液 ,并于
给药后放入代谢笼中 ,收集 0～ 2、 2～ 4、 4～ 6、 6
～ 8、 8～ 10、 10～ 12、 12～ 24、 24～ 48 h的尿液
与 0～ 6、 6～ 8、 8～ 10、 10～ 12、 12～ 24、 24～ 48 h
的粪便。 置- 24℃条件下冰冻保存 ,待测。
2. 3. 2　胆汁的收集:大鼠 5只 ,在禁食过夜后 ,
做胆管插管手术 ,先收集空白胆汁 ,再灌胃给予
180 mg· kg- 1鸡肝散提取物 CMC-Na混悬液 ,
并于给药后收集 0～ 2、 2～ 4、 4～ 6、 6～ 8、 8～ 10、
10～ 12、 12～ 24、 24～ 48 h的胆汁。置 - 24℃条
件下冰冻保存 ,待测。
2. 4　生物样品的处理与测定
2. 4. 1　尿样的处理与测定: 取尿液 200μl ,加
入 20μl 0. 58 mol· l- 1醋酸 ,涡旋。加入 10μl
·140·　　　 浙江大学学报 (医学版 ) 第 37卷
500 U· ml- 1硫酸酯酶溶液及 10μl 2 000 U·
ml
- 1葡醛酸酶 ,涡旋 ,于 37℃孵育 2 h后 ,再加
入 50μl的 10%三氯乙酸 ,涡旋混匀 ,用甲醇稀
释至 1. 00 m l,涡旋混匀 , 13 000 r /min, 10 min
离心 ,取上清液 20μl进样。
2. 4. 2　粪样的处理与测定:将收集到的粪样烘
干 ,称重 ,研碎 , 100 mg粪便加入 5 ml水 ,涡旋
混匀 ,超声 15 min后 ,制成 20 mg· ml- 1的匀
浆。取该匀浆 200μl,用甲醇稀释至 1. 00 ml,涡
旋混匀 ,超声 15 min后 , 13 000 r /min, 10 min
离心 ,取上清液 20μl进样。
2. 4. 3　胆汁的处理与测定: 取尿液 100μl ,加
入 10μl 0. 58 mol· l- 1醋酸 ,涡旋。以下按 2. 4.
1项下方法测定。
3　结　果
3. 1　方法的专属性　在该色谱条件下 ,木犀草
素与尿样和粪样及胆汁中的内源性杂质有较好
的分离度 ,杂质及代谢产物不干扰样品峰 ,木犀
草素的保留时间约为 22 min,见图 1～ 3。
　　 A: 空白尿样 ; B: 浓度为 10μg /ml的质控样品 ; C:灌胃后 ,未经处理的 0～ 2 h尿样 ; D:处
理后的 0～ 2 h尿样 ; 1:木犀草素 ; 2～ 10: 代谢产物
图 1　尿样的 HPLC色谱图
Fig. 1　 HPLC chroma tog ram of the urine
3. 2　木犀草素的线性范围　分别取各生物样
品 ,配置成系列浓度的质控样品 ,按“ 2. 4”项下
方法处理、测定。以木犀草素对照品浓度 (C )对
相应的峰面积 ( A )进行线性回归 ,求得 r值及直
线回归方程 A= aC+ b(见表 2)。
3. 3　血浆中木犀草素回收率及精密度试验结
果　配制低、中、高 3个浓度的质控样品各 5份 ,
按“ 2. 4”项下方法处理、测定。 测定所得木犀草
素峰面积与同样量木犀草素对照品溶液直接进
样所得峰面积进行比较 ,计算提取回收率。
另取上述低、中、高三种浓度质控样品 ,平
行5份 ,按“ 2. 4”项下处理、测定 ,计录木犀草素
·141·第 2期 应景艳 ,等 .鸡肝散药效成分木犀草素在大鼠体内的排泄研究 　 　
　　 A: 空白粪样 ; B:浓度为 16μg /ml的质控样品 ; C:灌胃后 ,未经处理的 6～ 8 h粪样 ; 1: 木犀草素 ; 10:代
谢产物
图 2　粪 HPLC色谱图
Fig. 2　 HPLC ch romatog ram o f the feces
　　 A: 空白胆汁 ; B:浓度为 16. 67μg /m l的质控样品 ; C:灌胃 2 h后 ,未经处理的胆汁样品 ;
D: 处理后的 2 h胆汁样品 ; 1:木犀草素 ; 2～ 13: 代谢产物
图 3　胆汁 HPLC色谱图
Fig. 3　 HPLC chroma tog ram of the bile
的峰面积 ,所得信号值代入“ 3. 2”项下标准曲线
的回归方程 ,求得测定浓度。最后与理论配制浓
度比较 ,计算方法回收率。
另取上述低、中、高三种浓度质控样品 ,平行
·142·　　　 浙江大学学报 (医学版 ) 第 37卷
5份 ,按“ 2. 4”项下处理、测定 ,计算 RSD作为日
内精密度。以后连续测定 5d,每天测定上述 3种
浓度的样品各 5份 ,计算 RSD作为日间精密度。
上述测定结果见表 3。
表 2　木犀草素在生物样品中的标准曲线
Table 2　 Standard curves of luteo lin in biolo gical specimen
生物样品 标准曲线 线性范围
/μg· ml- 1 r
定量限
/μg· ml- 1
尿 A= 24. 66C+ 4. 86 1. 00～ 100. 00 0. 999 1. 00
粪 A= 21. 79C- 2. 60 1. 00～ 100. 00 0. 999 1. 00
胆汁 A= 12. 02C+ 3. 09 1. 67～ 333. 33 0. 992 1. 67
表 3　大鼠尿、粪及胆汁中木犀草素的回收率及精密度测定结果 (n= 5)
Table 3　 Recovery and precision of luteo lin in ra ts’ urine, feces and bi le(n= 5)
生物样品 木犀草素浓度
方法回收率 /%
x-　　±　　 s
提取回收率 /%
x-　　±　　 s
日内精密度
RSD /%
日间精密度
RSD /%
尿 4 105. 55 3. 99　 99. 18 2. 98 3. 01 7. 65
40 101. 96 6. 99 107. 63 1. 47 1. 37 5. 49
80 100. 80 7. 54 102. 25 3. 07 3. 00 8. 22
粪 2 98. 81 5. 26 85. 90 4. 87 5. 66 3. 47
16 100. 52 6. 07 102. 06 6. 21 6. 08 4. 71
80 98. 88 7. 85 101. 73 8. 09 7. 95 6. 78
胆汁 3. 33 109. 84 8. 43 106. 14 7. 61 7. 18 9. 56
41. 67 105. 89 2. 29 91. 31 1. 96 2. 15 7. 39
250 108. 29 4. 25 96. 18 3. 77 3. 92 4. 68
3. 4　稳定性试验
对木犀草素质控样品在室温 24 h的稳定
性、 - 20℃贮存 2周的稳定性、冻融 4次的稳定
性 ,以及质控样品处理后的测定溶液在 4℃下的
稳定性进行考察。 结果显示 ,在上述情况下 ,木
犀草素质控样品基本稳定。
3. 5　尿、粪、胆汁中的测定结果　大鼠灌胃给
予 180 mg· kg- 1的鸡肝散提取物后 48 h (n=
5) ,木犀草素在尿、粪、胆汁中的累积排泄率分
别为 11. 06% , 26. 52% , 26. 40% 。累积排泄率曲
线如图 4～ 图 6所示。
　　 A.积排泄率 -时间曲线 ; B.泄量与总排泄量比值-时间曲线
图 4　大鼠口服鸡肝散提取物后木犀草素的尿中排泄 -时间曲线 (x-±s ,n= 5)
Fig. 4　 Urinary excretion-time profi le o f luteolin af ter oral administration o f Elsho l-
tzia blanda benth ex tracts to rats. Data w ere expressed as mean±s (n= 5)
·143·第 2期 应景艳 ,等 .鸡肝散药效成分木犀草素在大鼠体内的排泄研究 　 　
　　 A.累积排泄率 -时间曲线 ; B.排泄量与总排泄量比值 -时间曲线
图 5　大鼠口服鸡肝散提取物后木犀草素在粪便中排泄 -时间曲线 ( x-± s ,n= 5)
Fig. 5　 Fecal excretion-time pro file o f luteo lin af ter oral administ ra tion of Elsho ltzia
blanda benth ex t racts to rats. Da ta were expressed as mean± s (n= 5)
　　 A.泄率 -时间曲线 ; B.泄量与总排泄量比值-时间曲线
图 6　大鼠口服鸡肝散提取物后木犀草素在胆汁中排泄 -时间曲线 ( x-± s ,n= 5)
Fig. 6　 Biliary excretion-time pro file of luteolin af ter o ral administ ration o f Elsho ltzia
blanda benth ex t racts to rats. Da ta were expressed as mean± s (n= 5)
4　讨　论
作者建立了大鼠尿、粪便和胆汁等生物样
品中木犀草素的含量测定方法 ,通过方法学考
察 ,表明该法具有样品处理过程简便 ,方法专
属、准确、重复性良好、灵敏、耐用等优点 ,并成
功应用于鸡肝散提取物在大鼠体内的排泄研
究 ,进一步认识了其在大鼠体内的动态变化规
律和特点。
4. 1　木犀草素在大鼠体内的排泄情况　大鼠
服用鸡肝散提取物后分别收集尿液 ,给药 48 h
后木犀草素在尿中的累积排泄率约为 11% ,其
中前 2 h木犀草素排泄量最大 ,约占总尿中排
泄量的 36%。 12 h后从尿中排泄的药物很少 ,
已基本检测不到木犀草素。 说明木犀草素在体
内自尿排泄迅速 ,提示该药在肾脏不易蓄积。由
图 1-C可知 ,尿中的木犀草素基本以结合物形
式存在。
药物的粪便排泄也称肠道排泄。木犀草素
在 0～ 6 h内收集的粪便中几乎检测不出 ,而在
6～ 12 h内所收集的粪便中所监测到的木犀草
素量占了累积排泄量的主要部分 ,约为 79%。给
药 48 h后木犀草素在粪便中的累积排泄率约
为 26% 。
而胆汁在给药后 2～ 4 h及 12～ 24 h时间段
木犀草素的排泄量达到最高 , 10～ 12 h时出现
一个低谷 ,这有可能与肝肠循环有关。 48 h胆汁
的累积排泄率约为 26% ,通过观察色谱图 3-C可
知 ,胆汁中代谢物主要以结合物形式存在。
木犀草素在大鼠体内 48 h排泄大约为 37%
(大部分从粪便排泄 ,小部分从尿液排泄 ) ,胆汁
分泌的药物的非重吸收部分最后从粪便排出。比
·144·　　　 浙江大学学报 (医学版 ) 第 37卷
较图 4-B, 5-B, 6-B,可以发现尿中 12 h后基本检
测不到木犀草素 ,粪便在 24 h后基本检测不到 ,
而胆汁在 48时仍能被检出。约有 63%的药物有
待探明去向。 据研究分析有两种可能: ①木犀草
素在大鼠体内的分布广泛 ;②木犀草素在肝脏中
发生生物转化 ,而产生一些相关的代谢产物 ,如
木犀草素甲基化的产物香叶木素等。
4. 2　鸡肝散提取物在大鼠体内的代谢产物　我
们比较了盐酸水解 ,β -葡萄糖醛酸酶、硫酸酯酶
混合酶水解 ,不水解这三种方法 ,测得结果表明
尿和胆汁中代谢物主要以葡醛酸及硫酸结合物
形式存在。 Gradola tto等人 [8 ]用鼠肝微粒体对木
犀草素进行了葡醛酸化 ,硫酸酯化以及甲基化这
三种类型的二相代谢研究 ,发现木犀草素分别产
生 4个单葡醛酸结合物 , 2种硫酸结合物 , 1种甲
基化结合物即香叶木素。 Spencer等 [9 ]用离体鼠
小肠灌注模型 ,检测到了木犀草素的 6种代谢
物 ,与 Boersma[10 ]研究的木犀草素肠微粒体的二
相葡醛酸化代谢物相比 ,代谢物多了 3种 ,本试
验也检测到了 13种代谢物 ,这很可能就是由于
肝 ,小肠中的 UGTs、 SULTs及 COMTs共同作
用产生的结果。而粪便中则基本是以游离的木犀
草素形式存在。 李丽萍等 [ 11]研究了人、大鼠、
Beag le犬及家兔的肠道菌群对菊花提取物 (主
要成分是木犀草素 -7-O-β -D-葡萄糖苷和芹菜素
-7-O-β -D-葡萄糖苷 )的代谢作用 ,发现 0. 5 h后
样本中能检测出较高浓度代谢物。经 LC-M S检
测 ,主要的代谢物为木犀草素和芹菜素。 说明了
肠道菌群很容易将木犀草素苷水解成苷元 ,由此
也就更加确证了在结肠中基本是以游离的木犀
草素形式存在的。
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[责任编辑　张荣连 ]
·145·第 2期 应景艳 ,等 .鸡肝散药效成分木犀草素在大鼠体内的排泄研究