全 文 ：研究报告
Research Report
象耳豆根结线虫Hsp70基因相关功能分析
陈慧 1,2 王会芳 2 赵志祥 2 陈绵才 2*
1海南大学环境与植物保护学院,海口, 571101; 2海南省农业科学院植物保护研究所,海南省植物病虫害防控重点实验室,海口, 571100
*通讯作者, miancaichen@163.com
摘 要 Hsp70基因的表达量在研究中常作为一个重要的生理指标来反映机体的状况。为了研究象耳豆根
结线虫 Hsp70基因相关功能，本研究前期成功构建了 pEASY-E1-MeHsp70和 pET30a-MeHsp70两个原核表
达载体，通过热激转化将其分别转入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21进行表达。对转入 MeHsp70基因的大
场杆菌 BL21、转入空载的大肠杆菌 BL21和大肠杆菌 BL21原始菌种在 55℃、65℃进行热稳定性测定，在
37℃、200 r/min条件下进行生长曲线测定。热稳定性试验结果表明，转入 pET30a-MeHsp70基因的大场杆菌
生存时间较长，而转入 pEASY-E1-MeHsp70的菌株、转入空载的菌株和原始菌株热稳定性都相对较差。通过
荧光定量 PCR测定发现 MeHsp70基因均有上调表达，转入 pET30a-MeHsp70基因的大场杆菌 Hsp70基因
水平高于其他菌株。生长曲线测定试验结果表明，重组菌株与原始菌株生长曲线基本一致，转入
pET30a-MeHsp70载体的菌株调整期滞留时间长于其他菌株。该项研究表明 MeHsp70基因能够提升大肠杆
菌 BL21的抗应激能力和影响大肠杆菌 BL21的生长，为进一步开展 MeHsp70基因在象耳豆根结线虫生长
过程的功能研究提供了一定的理论基础。
关键词 象耳豆根结线虫,热休克蛋白 70基因,大肠杆菌,抗逆性,生长曲线
Analysis of MeHsp70 Gene Function from Meloidogyne enterolobii
Chen Hui 1,2 Wang Huifang 2 Zhao Zhixiang 2 Chen Miancai 2*
1 Environment and Plant Protection College, Hainan University, Haikou, 571101; 2 Institute of Plant Protection, Hainan Academy of Agricultural Sci-
ences, Hainan Key Laboratory for Control of Plant Diseases and Insect Pests, Haikou, 571100
* Corresponding author, miancaichen@163.com
DOI: 10.13417/j.gab.035.002653
Abstract During the research, the expression level of Hsp70 gene, as an important physiological signs, often
reflects the condition of the body. The Hsp70 gene will up-regulate to maintain the conformation of the key cellul-
ar proteins while the body encountering high temperature, hypoxia, cold or other harsh environment, in order to
keep the cellular activities and reduce the damage to the body. In the early, two prokaryotic expression vectors
(pEASY-E1-MeHsp70 and pET30a-MeHsp70) that were transformed into Escherichia coli BL21, respectively, by
the heat shock transformation way have been constructed successfully for the research. Keeping the original
Escherichia coli BL21 and the transferred Escherichia coli BL21 into which the pEASY-E1-MeHsp70 recombina-
nt plasmid, the pET30a-MeHsp70 recombinant plasmid and the no-load pEASY-E1 were transferred respectively
in 55℃ or 65℃ for thermal stability of determination. Growth curves were determined at 37℃ , 200 r/min and
30℃ and 200 r/min. The results showed that the transferred Escherichia coli BL21 of pET30a-MeHsp70 gene
survive longer and have a better thermal stability than others. By real-time fluorescence quantitative PCR test,
MeHsp70 gene had a certain amount of up-regulated expression, which indicated that the increasing heat stability
of Escherichia coli BL21 directly related to the up-regulation of MeHsp70 gene.The growth curve test showed that
the recombinant strain almost corrsponded with the original strains, and the strain in the pET30a-MeHsp70 vector
was longer than the others. The research showed that the MeHsp70 gene could increase the thermal stability of
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(31360432, 31360424, 31160024)和公益性行业(农业)科研专项(201103018)共同资助
基因组学与应用生物学，2016年，第 35卷，第 10期，第 2653-2661页
Genomics and Applied Biology, 2016, Vol.35, No.10, 2653-2661
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
图 1大肠杆菌 BL21活化
注: A:转 pET30a-MeHsp70大肠杆菌 BL21; B:转 pEASY-E1-
MeHsp70大肠杆菌 BL21; C:转 pET30a大肠杆菌 BL21; D:转
pEASY-E1大肠杆菌 BL21; E:大肠杆菌 BL21原始菌株
Figure 1 Activated Escherichia coli BL21
Note: A: Transformed pET30a-MeHsp70 Escherichia coli BL21;
B: Transformed pEASY-E1-MeHsp70 Escherichia coli BL21; C:
Transformed pET30a Escherichia coli BL21; D: Transformed
pEASY-E1 Escherichia coli BL21; E: Original Escherichia coli
BL21
Escherichia coli BL21 and affect the growth of Escherichia coli BL21. It suggested that Hsp70 gene play an
important role for growth of Meloidogyne enterolobii.
Keywords Meloidogyne enterolobii, Heat shock protein 70 gene (Hsp70), Thermal stability, Escherichia coli BL-
21, Growth curve
象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)，是在
中国海南省儋州市的象耳豆树上发现并鉴定和命名
(Yang and Eisenback, 1983)，普遍认为与玛雅根结线
虫是同种异名的根结线虫，其原始寄主是象耳豆树。
M. enterolobii是一类重要的植物病原线虫，农作物
感染根结线虫病后常造成农作物的重大损失。该线
虫在非洲(Fargette et al., 1996)、南美洲(Carneiro et al.,
2001)、中北美及加勒比海地区(Rammah and Hirsch-
mann, 1988)、欧洲(Kiewnick et al., 2009)均有分布，
2013年前中国仅在海南省和广东省(卓侃等, 2008)
发现该线虫，而目前在云南省(Wang and Hu, 2015)、
福建省(杨意伯, 2013)和湖南省(王剑等, 2015)均报
道有象耳豆根结线虫分布。M. enterolobii的寄主比
较广泛，近年来研究发现该线虫可以寄生豆科、茄
科、葫芦科、桃金娘科、番荔枝科、竹芋科等多种经济
作物，造成严重的损失。在中国南方热带亚热带地区
最主要根结线虫种类，象耳豆根结线虫病害已愈发
严重，研究取代南方根结线虫已成为必然趋势(黄伟
明等, 2011)。欧洲和地中海植物保护组织将其列入了
A2警报名录(Kiewnick et al., 2009)，荷兰、德国、英国
等一些国家从进口的植物中拦截到象耳豆根结线
虫，从而避免了象耳豆根结线虫对这些国家的危害。
热应激蛋白(heat shock proteins, Hsps)是一类进
化保守的蛋白，是一组分子伴侣(邱烈等, 2009)。Hsp70
是热应激蛋白几个家族中最主要的一个家族，Hsp70
对于物种抗逆性、物种寿命以及物种繁殖再生能力
有着重要的影响。Hsp70基因的表达量在研究中常
作为一个重要的生理指标来反映机体的状况。当机
体遭遇高温、缺氧、低温等恶劣环境时，Hsp70 基因
通常会上调表达，以维持细胞中关键蛋白质的空间
构象，维持细胞生命活动，使机体损伤程度降低。
1结果与分析
1.1大肠杆菌 BL21菌株活化
挑取转 pEASY-E1-MeHsp70 大肠杆菌 BL21、
转 pET30a-MeHsp70大肠杆菌 BL21菌株划线培养，
两种重组菌株依然具有较强活性，划线培养，成功获
得 pEASY-E1-MeHsp70大肠杆菌 BL21、转 pET30a-
MeHsp70大肠杆菌 BL21单克隆。转 pEASY-E1大
肠杆菌 BL21、转 pET30a大肠杆菌 BL21以及大场
杆菌 BL21原始菌株也活化成功，都成功获得长势
较好的单菌落。从菌种管挑取各菌株划线培养所得
的菌落长势图，然后挑取长势较好的菌落进一步培
养(图 1)。
1.2 重组大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 质粒基因
提取
将已活化的菌株接种到液体 LB培养基培养，培
养至对数期进行质粒 DNA提取。根据练冬梅试验
结果可知，象耳豆根结线虫 Hsp70基因片段长度为
1 959 bp。pET-30a 载体片段大小为 5 422 bp，在
MeHsp70基因与 pET-30a载体连接过程中，连接端
口之间做了一定的修饰，加入了特异性限制性内切
酶，使 pET-30a-MeHsp70基因片段长度加长，琼脂糖
凝胶电泳检测结果与预期大致相符(图 2)，然后进一
步进行验证。正常方法提取 pEASY-E1-MeHsp70重
组质粒，经琼脂糖凝胶电泳检测时发现，采用凝胶成
2654
图 2重组大肠杆菌 BL21质粒提取
注: M: DNAMarker 15 000; A: 1~3: pET30a-MeHsp70质粒; B: 1
pEASY-E1-MeHsp70质粒; C: 1 pET30a空载质粒; 2: pEASY-
E1空载质粒
Figure 2 The results of extracting plasmid DNA from recombi-
nant Escherichia coli BL21
Note: M: DNA Marker 15 000; A: 1~3: Plasmid pET30a-MeHsp-
70; B1: Plasmid pEASY-E1-MeHsp70; C: 1 Plasmid pET30a; 2:
Plasmid pEASY-E1
图 3 PCR扩增
注 : M: DNA Marker 2 000; 1~4: pET30a-MeHsp70 质粒 PCR
扩增; 5~8: pEASY-E1-MeHsp70质粒 PCR扩增
Figure 3 The results of PCR amplification
Note: M: DNA Marker 2 000; 1~4: PCR products of pET30a-Me-
Hsp70; 5~8: PCR products of pEASY-E1-MeHsp70
图 4 MeHsp70基因回收片段
注: M: DNA Marker 2 000; 1:回收的 MeHsp70基因片段
Figure 4 Recovered MeHsp70 gene fragment
Note:M:DNAMarker2000;1:RecoveredMeHsp70gene fragment
像仪观察时基本观察不到凝胶中含有 pEASY-E1-
MeHsp70 质粒 DNA。通过相关方法计算可知，
pEASY-E1-MeHsp70在大肠杆菌 BL21中拷贝数极
低，对所提取的质粒进行 20倍浓缩才得到下 pEAS-
Y-E1-MeHsp70质粒 DNA凝胶电泳图。pEASY-E1
载体片段大小为 5 715 bp，与 MeHsp70基因直接相
连接，连接后所得 pEASY-E1-MeHsp70基因片段大
小与琼脂糖凝胶电泳检测结果基本相符，可初步判
断是目标菌株，之后再进行进一步判断。转 pET30a
大肠杆菌 BL21、转 pEASY-E1大肠杆菌质粒提取结
果与预期也相符合，片段大小与实际大小接近。
1.3 PCR扩增
采用一对特异性引物 ME70EF和 ME70ER，以
1.2 所提取得到的质粒 DNA pET30a-MeHsp70 和
pEASY-E1-MeHsp70为模板进行 PCR扩增，PCR扩
增所得结果(图 3)。1~4是以 pET30a-MeHsp70质粒
DNA为模板进行 PCR扩增后所得的结果，5~8是以
pEASY-E1-MeHsp70质粒 DNA为模板进行 PCR扩
增后所得的结果，PCR扩增后所得的基因片段大小
约 1 950 bp。象耳豆根结线虫 Hsp70基因片段长度
为 1 959 bp，PCR 扩增出的片段与象耳豆根结线虫
Hsp70基因片段长度基本一致，可初步判定 PCR反
应扩增出的 DNA片段即为目的基因片段。
1.4回收目的基因片段
将 PCR扩增所得产物进行琼脂糖凝胶电泳，从
而回收目的基因。利用 TaKaRa Mini BEST Agarose
Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0 试剂盒回收 PCR 扩
增出的目的基因(图 4)。
1.5测序
将所提取的质粒以及 PCR 扩增出的片段送样
测序，然后用 DNAMAN软件进行分析发现，与练冬
梅等(2015)所克隆象耳豆根结线虫序列几乎完全一
致，相似度为 100%，中间区域序列完全一致，所获得
的目的基因既为象耳豆根结线虫 Hsp70基因，可以
进行下一步试验。
1.6大肠杆菌 BL21热稳定性测定
1.6.1 55℃处理大肠杆菌 BL21菌株
转 pEASY-E1-MeHsp70重组质粒大肠杆菌 BL-
21、转 pET30a-MeHsp70重组质粒大肠杆菌 BL21、
转 pEASY-E1空载大肠杆菌 BL21、转 pET30a空载
大肠杆菌 BL21和大肠杆菌 BL21原始菌株在 55℃
条件下进行热稳定性测定所得的结果(图 5)。由图 5
可知，转入 pET30a-MeHsp70重组质粒的大肠杆菌
象耳豆根结线虫 Hsp70基因相关功能分析
Analysis of MeHsp70 Gene Function from Meloidogyne enterolobii 2655
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
图 5 55℃大肠杆菌 BL21菌株耐热性测定
Figure 5 The thermostability of Escherichia coli BL21 at 55℃
图 6 65℃大肠杆菌 BL21菌株耐热性测定
Figure 6 The thermostability of Escherichia coli BL21 at 65℃
图 7重组大肠杆菌 BL21 RNA提取
注: 1~5:转 pET30a-MeHsp70大肠杆菌 BL21 RNA提取; 6~10:
转 pEASY-E1-MeHsp70大肠杆菌 BL21 RNA提取
Figure 7 The results of extracting RNA from Recombinant Esch-
erichia coli BL21
Note: 1~5 : Extracting RNA from Escherichia coli BL21 were-
transformed pET30a-MeHsp70; 6~10: Extracting RNA from Esc-
herichia coli BL21 were transformed pEASY-E1-MeHsp70
BL21耐热性相对提升较大，同样转入了 MeHsp70基
因的转 pEASY-E1-MeHsp70的大肠杆菌 BL21耐热
性却基本没有提升，需要下一步试验进行验证。只转
入空载 pEASY-E1、pET30a 的大肠杆菌 BL21 与大
肠杆菌 BL21原始菌株的耐热性测试结果比较接近，
说明 pEASY-E1、pET30a 两种载体转入大肠杆菌
BL21 后并不能提升其耐热性，从侧面也说明了
MeHsp70基因能够提升大肠杆菌 BL21的耐热性。根
据转入 pET30a-MeHsp70 的大肠杆菌 BL21 耐热性
和转入 pEASY-E1-MeHsp70的大肠杆菌 BL21耐热
性对比，需进一步探究耐热性与重组质粒表达
HSP70蛋白量的关系。
1.6.2 65℃处理大肠杆菌 BL21菌株
转入 pEASY-E1-MeHsp70 和 pET30a-MeHsp70
两个原核表达载体的大肠杆菌 BL21、只转入空载
pEASY-E1和 pET30a的大肠杆菌 BL21、大肠杆菌
BL21原始菌株 65℃进行热稳定性试验的结果(图 6)。
从图 6 可知，转入 pET30a-MeHsp70 的大肠杆菌
BL21耐热性有所提升，而转入 pEASY-E1-MeHsp70
的大肠杆菌 BL21耐热性却基本没有提升。转入空载
pEASY-E1、pET30a 的大肠杆菌 BL21 与大肠杆菌
BL21 原始菌株的耐热性性质比较接近，说明
pEASY-E1、pET30a两种载体转入大肠杆菌 BL21后
并未提升其耐热性，作为对比也侧面证明 MeHsp70
基因能够提升大肠杆菌 BL21的耐热性。根据转入
pET30a-MeHsp70 的大肠杆菌 BL21 耐热性和转入
pEASY-E1-MeHsp70的大肠杆菌 BL21耐热性对比，
需进一步探究耐热性与重组质粒性质的关系。
1.7 RNA提取与质量分析
根据热稳定性大肠杆菌 BL21生存能力测定，选
取 55℃处理菌株研究 Hsp70基因表达水平与热稳定
性的关系。分别提取 55℃热稳定性试验后转
pET30a-MeHsp70重组质粒大肠杆菌 BL21和转 pE-
ASY-E1-MeHsp70重组质粒大肠杆菌 BL21 RNA所
得结果(图 7)。
1.8 象耳豆根结线虫 Hsp70 基因实时荧光定量 PCR
检测
根据实时荧光定量 PCR 结果，得到内参基因
16SRNA、MeHsp70基因的与 C(t)值有关的标准曲线，
MeHsp70 基因和管家基因 16S RNA 的 R2 分别为
0.980和 0.986，该标准曲线可用于象耳豆根结线虫
Hsp70基因的相对定量检测。
由图 8 可以看出，采用 55℃热激处理转入
pET30a-MeHsp70重组质粒的大肠杆菌 BL21 15 min、
30 min、45 min、60 min 后，MeHsp70 基因的 mRNA
表达量上调都比较低，并且采用 2-ΔΔCT方法计算各个
时间点 mRNA的表达水平，根据计算可得，分别上
2656
图 8重组大肠杆菌BL21热激后Hsp70基因mRNA相对表达量
Figure 8 Relative expression of Hsp70 mRNA of recombinant
Escherichia coli BL21 after heat shock treatment
图 9 37℃重组大肠杆菌 BL21生长曲线
Figure 9 The growth curve of Escherichia coli BL21 at 37℃
图 10 30℃重组大肠杆菌 BL21生长曲线
Figure 10 The growth curve of Escherichia coli BL21 at 30℃
调表达 0.021倍、0.156倍、0.311倍和 1.223倍。
由图 8 可以看出，采用 55℃热激处理转入
pEASY-E1-MeHsp70 重组质粒的大肠杆菌 BL21
15 min、30 min、45 min 和 60 min 后，MeHsp70 基因
的 mRNA表达量很低，并且采用 2-ΔΔCT方法计算各
个时间点 mRNA的表达水平。根据计算可得，分别
上调表达 0.003倍、0.011倍、0.063倍和 0.421倍。
由此可见，象耳豆根结线虫 Hsp70基因对于大
肠杆菌耐热性的提升有一定的帮助。
1.9大肠杆菌 BL21各菌株生长曲线测定
1.9.1 37℃下进行大肠杆菌 BL21生长曲线测定
在严格控制外界条件一致情况下，通过测定得到
不同重组菌株及原始菌株的生长曲线。由图 9看出，转
入 pEASY-E1-MeHsp70和 pET30a-MeHsp70两个原
核表达载体的大肠杆菌 BL21、只转入空载 pEASY-E1
和 pET30a的大肠杆菌 BL21、大肠杆菌 BL21原始菌
株之间生长速率在各个阶段基本保持一致。将转入
pET30a-MeHsp70 和转入 pET30a 的大肠杆菌 BL21
生长曲线单独列出，分析发现，转入 pET30a-MeHsp70
比转入空载 pET30a的菌株进入对数期相对晚 30min。
1.9.2 30℃下进行大肠杆菌 BL21生长曲线测定
在严格控制外界条件一致情况下，测定得到不
同重组菌株及原始菌株的生长曲线。由图 10看出，
转入 pEASY-E1-MeHsp70和 pET30a-MeHsp70两个
原核表达载体的大肠杆菌 BL21、只转入空载 pEASY-
E1和 pET30a的大肠杆菌 BL21、大肠杆菌 BL21原
始菌株之间生长速率在各个阶段基本保持一致。将
转入 pET30a-MeHsp70 和转入 pET30a 的大肠杆菌
BL21 生长曲线单独列出并分析发现，转入
pET30a-MeHsp70比转入空载 pET30a的菌株进入对
数期相对较晚 30 min。30℃大肠杆菌的最大菌数也
要略高于 37℃大肠杆菌的最大菌数。
2讨论
象耳豆根结线虫是一种具有强致病力的植物病
原线虫，近几年来的发生和传播呈快速上升态势，其
诱发的根结线虫病正在不断向中国内陆地区蔓延。
研究已表明，在植物寄生线虫侵染寄主的过程中，寄
主植物和象耳豆根结线虫的 Hsp70基因表达水平均
会发生一定的变化。罗杰等(2015)发现，当采用低剂
量杀线剂处理马铃薯腐烂茎线虫时，马铃薯腐烂茎
线虫中的 Hsp70基因随即会上调表达。植物寄生线
虫侵染寄主或植物面对恶劣环境时，Hsp70都扮演者
一个重要角色对植物寄生线虫加以保护。本研究将
象耳豆根结线虫 Hsp70基因转入大肠杆菌 BL21进
行异源表达来探究其 Hsp70功能特性，发现 Hsp70
基因的表达水平能够略微提升从而增强大肠杆菌
BL21的耐热性。
2.1 象耳豆根结线虫 Hsp70 基因对大肠杆菌 BL21
热稳定性的影响
本研究将象耳豆根结线虫 Hsp70基因与 pET30a
象耳豆根结线虫 Hsp70基因相关功能分析
Analysis of MeHsp70 Gene Function from Meloidogyne enterolobii 2657
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
和 pEASY-E1 连接构建原核表达载体，然后将
pET30a-MeHsp70重组质粒、pEASY-E1-MeHsp70重
组质粒转入大肠杆菌 BL21进行原核表达。将重组菌
株分别置于 55℃和 65℃下处理，并分析热处理后重
组菌株的死亡率。结果指出，转 pET30a-MeHsp70基
因的大肠杆菌耐热性比其他几种菌株耐热性强。首
先提取各菌株的质粒，发现 pET30a-MeHsp70重组质
粒在大肠杆菌 BL21拷贝数远高于 pEASY-E1-MeH-
sp70 在大肠杆菌 BL21 的拷贝数。然后通过 SDS-
PAGE凝胶电泳技术分析热处理后重组表达菌株的
Hsp70表达量，研究发现转入 pET30a-MeHsp70重组
质粒的大肠杆菌 BL21 Hsp70表达量略高于其他菌
株。采用实时荧光定量 PCR分析 55℃热处理后Hsp70
基因表达量的变化，转 pET30a-MeHsp70重组质粒的
大肠杆菌Hsp70基因表达水平比其他菌株的高。
Dahlgaard 等(1998)对果蝇成虫进行热处理，并
测定了不同处理时间的 Hsp70表达水平，发现果蝇
耐热性与 Hsp70 基因的表达量存在正相关，进而
阐明了 Hsp70基因表达水平增高与大肠杆菌 BL21
热稳定性之间有一定的正相关关系。这与其它研究
结果一致：当处理温度从 25℃上升到 35℃时，C. ele－
gans 中的 Hsp70 基因表达量能够迅速提高两倍多
(Massie et al., 2003)；线虫 B. malayi的三龄幼虫中的
处理温度从 28℃升到 42℃后，在 45 min后的 Hsp70
基因也能够迅速上调表达，表达量迅速增加了两倍
多，与 37℃高温诱导上调程度一致，并且随着处理时
间的延长，表达量随之增加(Ravi et al., 2004)。
象耳豆根结线虫 Hsp70 基因转入大肠杆菌
BL21后能够提升其耐热性，并且与 Hsp70基因表达
量存在正相关的关系。
2.2 象耳豆根结线虫 Hsp70 基因对大肠杆菌 BL21
生长特性的影响
大肠杆菌 BL21生长特性受温度、溶氧量等因子
影响(McMeekin and Ross, 2002)。我们将象耳豆根结
线虫 Hsp70基因转入大肠杆菌 BL21后发现，与其
他几株大肠杆菌 BL21生长过程相比，转入 pET30a-
MeHsp70重组质粒的大肠杆菌 BL21其菌体进入对
数期的时间推迟了大约 30 min，而转入 pEASY-E1-
MeHsp70重组质粒的大肠杆菌 BL21其生长曲线与
原始菌株生长曲线之间基本无差别。分别提取转
pET30a-MeHsp70 重组质粒大肠杆菌 BL21 和转
pEASY-E1-MeHsp70重组质粒大肠杆菌 BL21的质
粒 DNA，发现 pEASY-E1-MeHsp70重组质粒在大肠
杆菌 BL21 里的拷贝数远低于 pET30a-MeHsp70 在
大肠杆菌 BL21里的拷贝数。在大肠杆菌进行生长复
制过程中需要经历准备期，准备期主要是大肠杆菌
合成复制过程中大肠杆菌所需要的物质。转入
pET30a-MeHsp70 后，由于 pET30a-MeHsp70 拷贝数
高，复制 pET30a-MeHsp70基因所需要准备的物质也
相对多，从而导致转 pET30a-MeHsp70重组质粒的大
肠杆菌 BL21的准备期会相对较长。但是，尚不清楚
生长曲线测定过程中相关复制如何合成而导致准备
期时间延长，需要后续研究进加以判定。
象耳豆根结线虫 Hsp70 基因转入大肠杆菌
BL21后能够延长大肠杆菌 BL21的准备期，使大肠
杆菌 BL21的生长曲线推迟进入对数期，延长到达稳
定期的时间。
2.3象耳豆根结线虫 Hsp70基因研究展望
本研究仅测定和分析了象耳豆根结线虫 Hsp70
基因对大肠杆菌 BL21热稳定性和大肠杆菌生长曲
线的影响，其功能解析不够深入，且欠系统性。Hsp70
在机体中扮演着许多重要的角色，下一步的研究应
着力于 Hsp70基因对大肠杆菌 BL21在遭遇其他应
激条件和逆境下的影响，例如：低温条件下转 MeHs-
p70基因大肠杆菌 BL21的 MeHsp70的表达状况和
大肠杆菌 BL21的生长状况；采用低剂量杀线虫剂处
理转 MeHsp70基因大肠杆菌，探讨 MeHsp70基因是
否可提升其抗杀线虫剂能力。可见，探究象耳豆根结
线虫 Hsp70基因异源表达对大肠杆菌 BL21的影响，
可为病害的大田防治提供基础理论。
采用 RNAi技术进行 Hsp70基因功能分析有助
于了解象耳豆根结线虫生长与侵染阶段的生理变
化。选取已沉默 Hsp70基因的象耳豆根结线虫二龄
幼虫侵染寄主植物，通过检测寄主植物侵染率，探究
象耳豆根结线虫 Hsp70基因是否影响象耳豆根结线
虫的致病性。同时，根据检测接种后各时间段象耳豆
根结线虫和寄主植物的 Hsp70基因表达水平变化，
对相应时间的 Hsp70基因进行调控表达，从而研究
Hsp70基因不同表达水平对其致病力的影响，阐释
Hsp70基因在象耳豆根结线虫侵染寄主植物时的作
用机理。研究结果可为寻找合适的分子生物学技术
手段实施象耳豆根结线虫防控奠定基础。
Hsp70家族蛋白在机体内能够充当很多角色，然
而目前对象耳豆根结线虫 Hsp70相关作用机理研究
还比较少。后续的研究重点应从单一基因向多基因
过度，只有这样才能够更加清晰地揭示象耳豆根结
线虫生长的相关调控机理，获取能抑制象耳豆根结
2658
线虫生长的关键技术，以期进一步探究象耳豆根结
线虫与寄主的互作机理，为寻求高效的象耳豆根结
线虫病防控技术路径提供理论依据。
3材料与方法
3.1 材料
3.1.1菌株
转入 pEASY-E1-MeHsp70 重组质粒的大肠杆
菌 BL21、转入 pET30a-MeHsp70重组质粒的大肠杆
菌 BL21、转入 pEASY-E1空载的大肠杆菌 BL21、转
入 pET30a空载的大肠杆菌 BL21和大肠杆菌 BL21
原始菌，所有菌株均来自海南省农业科学院植物保
护研究所植物病理实验室。
3.1.2主要仪器
D-78532 Tuttlingenmikro 22R离心机，Roche Li-
ghtCycler誖 Nano荧光定量 PCR仪；GXZ-280B智能
型光照培养箱，美国精骐涡旋混匀器 HYQ-3110；
Tanon 4200全自动数码凝胶图像分析系统，上海京
工实业有限公司专业生产(供应)销售电泳仪 JY600C
系列产品，UV-2000紫外分析仪，Bioer mixing Block
MB-102金属浴锅，C1000TM Thermal Cycler。
3.1.3主要试剂和培养基
50×TAE电泳缓冲液(pH 8.0)：242 g Tris，57.1 mL
冰醋酸，100 mL 0.5 mol/L EDTA，定容至 1 L；LB液
体培养基：NaCl l0 g/L，Peptone l0 g/L, Yeast 5 g/L
(固体培养基需要加 15~20 g琼脂粉)。
3.2重组大肠杆菌 BL21活化与鉴定
挑取转化含有 pEASY-E1-MeHsp70和 pET30a-
MeHsp70两个原核表达载体的重组大肠杆菌 BL21
划线接种于 LB平板培养基，37℃培养 16 h。挑取长
势较好的单菌落接种于 LB 液体培养基中 37℃、
200 r/min培养 6 h，采用 TaKaRa质粒小提试剂盒提
取质粒。以提取的质粒 DNA为模板，用一对引物扩
增 MeHsp70基因，正向引物Me70EF：5-GGGGTAC
CATGTCTAAAGCTAACGCTGTCG-3，反向引物
Me70ER：5-CGGATATCTTAATCAACTTCTTCAA
TG-3。采用 20 μL体系，PCR扩增反应条件：94℃预
变性 3 min；94℃变性 30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸
2 min，30个循环；72℃终延伸 10 min。PCR产物利用
琼脂糖凝胶检测，并切胶回收目的基因。将能够扩增
处目的基因的质粒以及扩增出的目的基因片段送至
公司测序，并将菌种保存。
3.3序列比对
根据测序公司要求，取相应目的基因质粒 DNA、
PCR 产物以及扩增引物 ME70EF和 ME70ER 于离
心管中，做好标记，送至北京华诺时代科技有限公司
进行测序。测序结果送回后对测序结果采用 DNA-
MAN软件进行整理，分析菌株提取出的质粒和 PCR
产物是否为目的基因。
3.4大肠杆菌 BL21各菌株生长曲线测定
将转入 pEASY-E1-MeHsp70、只转入空载 pEAS-
Y-E1的大肠杆菌 BL21分别划线接种到 LB固体培
养基(含 100μg/mLAmp)平板中，37℃培养 16 h。将转
入 pET-30a-MeHsp70、只转入空载 pET30a的大肠杆
菌 BL21分别划线接种到 LB固体培养基(含 30μg/mL
Kan)平板中，37℃培养 16 h。挑取长势较好的菌落，
分别接种到装有 LB 液体培养基的试管中，37℃、
200 r/min培养 6 h左右至 OD为 0.8。然后取该液体
培养基以 1%的接种量接种至装有 100 mL LB液体
培养基的锥形瓶中。
分别在 25℃、37℃、50℃，200 r/min 进行培养，
每隔 1 h取一次样，一次 3份，每份 1 mL，2.5 h和
3.5 h分别再取一次。利用分光光度计测量并获得各
菌株在 25℃、37℃和 50℃的生长曲线，以此分析各
菌株生长曲线特性。
3.5 大肠杆菌 BL21各菌株耐热性测定
将转入 pEASY-E1-MeHsp70原核表达载体的大
肠杆菌 BL21、只转入空载 pEASY-E1 的大肠杆菌
BL21单克隆接种于 LB 液体培养基(含 100 μg/mL
Amp)；将转入 pET-30a-MeHsp70原核表达载体的大
肠杆菌 BL21、只转入空载 pET-30a的大肠杆菌 BL21
单克隆接种于 LB液体培养基(含 50 μg/mL Kan)；将
大肠杆菌 BL21 原始菌株接种于 LB 液体培养基；
37℃、200 r/min振荡培养 8 h。将菌液按 1: 100的接种
量接种到装有 100 mL LB液体培养基的锥形瓶中，
37℃、200 r/min 培养大约 3 h (OD600=0.6~0.8）；加入
10 μmol/L的 IPTG 500 μL至终浓度为 0.5 mmol/L，
其中一瓶不加入 IPTG做空白对照，诱导 5 h。
取 2 mL诱导培养物用 LB培养基按 1: 10的比
例进行稀释，置于 55℃、65℃高温水浴处理；每隔
15 min 取一次样，取两份，一份取 1 mL，另一份取
0.5 mL；并用提前在 4℃冰箱放置的 LB液体培养基
按一定比例稀释 0.5mL诱导培养物；取稀释液 100μL
在 LB (含 100 μg/mL Amp)平板上均匀涂板，37℃培
象耳豆根结线虫 Hsp70基因相关功能分析
Analysis of MeHsp70 Gene Function from Meloidogyne enterolobii 2659
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
养 12~16 h，计数。
3.6 象耳豆根结线虫 Hsp70 基因表达量与大肠杆菌
耐热性相关性测定
3.6.1象耳豆根结线虫 Hsp70基因表达特性分析
生长曲线测定以及耐热性试验中，取另一份 1 mL
诱导培养物提取 RNA，加入溶菌酶(10mg/mL) 100μL
使诱导培养物中溶菌酶终浓度为 500 μg /mL，室温条
件下温浴 5 min，并进行适当的涡旋震荡。将使用溶菌
酶处理好的菌液转移到无 RNase的离心管中，用天根
RNAprep Pure培养细菌总 RNA提取试剂盒提取各
个处理水平样品的总 RNA，采用凝胶电泳法检测
RNA纯度，检测之后-70℃保存。采用 TaKaRa Prime
ScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit，利用特异性引
物 Me70EF和 M70ER进行 PCR扩增合成目的基因
MeHsp70 cDNA，同时设计引物 Me16sF和 Me16sR
扩增 16S RNA基因序列，将其作为 RT-PCR内参。
3.6.2实时荧光定量 PCR分析
将工程菌株在 LB培养基上培养至对数生长期，
取 1 mL菌液用适量溶菌酶处理后提取总 RNA进行
反转录，以 cDNA为模板进行实时定量 PCR反应。
预变性，然后 93℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共
做 40个循环，最后 72℃延伸 5 min。反应结束后，与
内参基因作为对比，来确定 hsp70基因表达量的变化。
实时荧光定量 PCR反应结束后，以细菌 16S rRNA为
参比，根据 2-ΔΔCT法计算相关基因的转录水平。
作者贡献
陈慧是本研究的实验设计和实验研究的执行
人，完成数据分析，论文初稿的写作；王会芳和赵志
祥参与实验设计，试验结果分析；陈绵才是项目的构
思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作
与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金项目 (31360432,
31260424, 31160024)和公益性行业(农业)科研专项
(201103018)共同资助。
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象耳豆根结线虫 Hsp70基因相关功能分析
Analysis of MeHsp70 Gene Function from Meloidogyne enterolobii
iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii
International Journal of Horticulture (IJH)
International Journal of Horticulture (ISSN 1927-5803) is an open access, peer reviewed
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relative science, containing horticultural products, protection; agronomic, entomology,
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also welcomed; as well as including the tropical fruits, vegetables, ornamentals and
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