全 文 ：doi:10． 3969 / j． issn． 1000-484X． 2015． 05． 010
·中医中药与免疫·
连翘根提取物(FSEEＲ)对化疗后小鼠骨髓和免疫抑制的影响①
孙佳玮 戴素丽② 李 磊② 颜 晰③ 张 超② 赵连梅② 单保恩②
(河北医科大学第一医院呼吸科，石家庄 050011)
中图分类号 Ｒ730. 3 文献标志码 A 文章编号 1000-484X(2015)05-0625-04
①本文为国家自然科学基金(No. 81173611)和河北省中医药管理局
课题(No. 2011011)
②河北医科大学第四医院 科研中心，石家庄 050011。
③河北医科大学第四医院检验科，石家庄 050011。
作者简介:孙佳玮(1981 年 －)，女，主治医师，主要从事恶性肿瘤的
基础与临床研究，E-mail:sjw0409@ 163． com。
通讯作者及指导教师:单保恩(1962 年 －)，男，博士生导师，主要从
事肿瘤基因诊断与免疫基因治疗和抗肿瘤中
药方面的研究，E-mail:shanbaoen@ 163． com。
［摘 要］ 目的:观察连翘根提取物(FSEEＲ)对环磷酰胺(Cy)所致小鼠骨髓和免疫抑制作用的影响，探讨 FSEEＲ促进
化疗后小鼠造血功能和免疫功能的作用及机制。方法:将小鼠随机分为 4 组:正常对照组，模型组，FSEEＲ 高、低剂量组。除
正常对照组外，其余各组小鼠均一次性腹腔注射 Cy(200 mg /kg)。第 2 天开始，对 FSEEＲ 高、低剂量组小鼠灌胃不同剂量的
FSEEＲ［120、60 mg /(kg·d)］，模型对照组小鼠给予等量的生理盐水，连续给予 10 d。分离各组小鼠脾脏，分别计算脾脏指数
(SI)。流式细胞仪检测小鼠外周血淋巴细胞 CD3、CD4、CD8 的变化。用 ELISA试剂盒检测小鼠血清中 TNF-α、IL-2、IL-12 的
含量，股骨骨髓涂片经瑞式-吉姆萨染色后观察骨髓细胞形态变化。结果:不同剂量的 FSEEＲ组小鼠的脾脏指数增加，外周血
中 TNF-α和 IL-2 的含量增高。一定剂量的 FSEEＲ可以提高外周血 CD3 + CD4 + T淋巴细胞比例和 CD4 + /CD8 +的比值，改善
骨髓的抑制状态。结论:连翘根醇提物(FSEEＲ)可以显著提高小鼠机体的免疫功能，恢复由 Cy诱导的小鼠免疫抑制状态。
［关键词］ 连翘根提取物;环磷酰胺;免疫抑制模型;小鼠
Effects of FSEEＲ on immunosuppressive and bone-marrow-suppressive mice af-
ter chemotherapy
SUN Jia-Wei，DAI Su-Li，LI Lei，YAN Xi，ZHANG Chao，ZHAO Lian-Mei，SHAN Bao-En. Department of Ｒespiratory
Medicine，the First Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China
［Abstract］ Objective:To observe the effect of FSEEＲ on the immunosuppressive and bone-marrow-suppressive mice after
chemotherapy，and explore the mechanism of hematopoietic and immunologic function in mice accentuated by FSEEＲ. Methods:Mice
were injected cyclophosphamide(Cy)except control group，then randomly divided into mode group(saline)，FSEEＲ groups［120，60
mg /(kg·d) ］. The spleen index(SI)of all mice was calculated respectively. Flow cytometry instrument testing mice peripheral
blood lymphocytes CD3，CD4，CD8 change. The content of TNF-α，IL-2 and IL-12 in mice serum were measured by ELISA
kits. Morphological images of bone marrow of the mice were observed under the microscope after Wright-Giemsa s
staining. Ｒesults:The spleen index(SI)was increased in both of the two FSEEＲ groups. ELISA analyses showed that the con-
tent of TNF-α and IL-2 was increased in both of the two FSEEＲ groups. The population of CD3 + CD4 + T lymphocyte and the
ratio of CD4 + /CD8 + were all increased in the low dose experimental group. After treated with FSEEＲ，the hematopoietic de-
pression was improved significantly. Conclusion:FSEEＲ can improve the state of immunosuppressive and myelosuppressive
mice caused by Cy thus could alleviate the side effect of chemotherapy effectively.
［Key words］ FSEEＲ;Cyclophosphamide(Cy);Immunosuppression model;Mice
化疗是目前治疗肿瘤的主要手段之一，但现有
化疗药物中绝大多数在抑制或杀伤肿瘤细胞的同
时，也会产生轻重不等的毒副作用。尤其是对机体
的免疫抑制，表现为肿瘤患者的 T、B 细胞数量下
降，T细胞亚群比例失调，TNF-α 等细胞因子生成低
下等，大大削弱了机体的抗肿瘤能力，造成肿瘤不易
被控制而加速其转移和复发的进程［1］。同时，接受
放疗和化疗的肿瘤患者通常会出现骨髓造血抑制，
·526·孙佳玮等 连翘根提取物(FSEEＲ)对化疗后小鼠骨髓和免疫抑制的影响 第 5 期
造成全血细胞尤其是白细胞和血小板的减少，进一
步导致反复感染和其他严重并发症发生。因此，如
何减轻放、化疗的毒副作用，恢复骨髓造血，提升患
者免疫力，提高放、化疗的治疗效果已成为目前肿瘤
综合治疗亟待解决的问题。连翘是临床常用的传统
中药之一，现代药理学对连翘生物学活性的研究主
要集中于其抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌及舒张心血
管等方面［2-4］。临床上，连翘也可与其他中草药制
成配方，治疗头颈部肿瘤、乳腺癌、食道癌、胃癌、宫
颈癌、白血病等多种肿瘤。我们前期的研究结果显
示，连翘根醇提物 FSEEＲ可以抑制食管癌细胞的生
长，并诱导其发生细胞凋亡而发挥一定的抗肿瘤作
用，具有较大的开发潜力和实用价值［5］。但 FSEEＲ
能否改善化疗患者的毒副作用目前尚不清楚。为
此，我们构建了化疗后免疫抑制的小鼠模型，旨在研
究 FSEEＲ对化疗后骨髓抑制和免疫功能下降的调
节作用，为其开发利用提供进一步的实验依据。
1 材料与方法
1. 1 材料 BALB /c 近交系小鼠(雄性，8 ～ 10 周
龄，平均体质量为 18 ～ 20 g，SPF级)，购自河北省实
验动物中心。实验动物使用许可证号:SYXK(冀)
2013-0051。环磷酰胺(Cy)(生产批号:08021821)
购自江苏恒瑞医药股份有限公司。FSEEＲ 为实验
组前期制备。TNF-α、IL-2 和 IL-12 ELISA 检测试剂
盒均购自美国 ADL 公司。淋巴细胞分离液购自中
国医学科学院生物工程研究所。瑞-姬(Wright-Gi-
emsa)染液购自 Baso公司。FITC标记的 CD3 抗体、
PE标记的 CD4 和 CD8 抗体均购自美国 BioLegend
公司。流式细胞仪(EPICS-XL 型)为美国 Beckman
Coulter公司产品。
1. 2 方法
1. 2. 1 实验分组和给药方法 SPF 级近交系
BALB /c小鼠 16 只，雄性，8 ～ 10 周龄，平均体质量
为 18 ～ 20 g，动物房内适应环境 1 周后随机分为 4
组，每组 4 只。除正常对照组外，FSEEＲ 高、低剂量
组和模型对照组均一次性腹腔注射 Cy(200 mg /
kg)。模型建立后第 2 天开始，FSEEＲ 高、低剂量组
小鼠分别灌胃不同剂量［120、60 mg /(kg·d)］的
FSEEＲ，模型对照组小鼠给予等量生理盐水(NS)，
均连续给药 10 d。每天观察小鼠生存状态，于末次
给药后 12 h称量体重，眼球取血，处死小鼠。
1. 2. 2 脾脏指数的测定 无菌分离各组小鼠脾脏，
用滤纸吸干残血后称重，分别计算脾脏指数(SI)，
公式如下:SI =脾脏重(mg)/体重(g)。
1. 2. 3 流式细胞仪检测小鼠外周血淋巴细胞 CD3、
CD4、CD8 的变化 采用小鼠眼球静脉取血的方法
采集各组小鼠血液 1 ml，加入到含有肝素钠的离心
管中，1 000 r /min离心 10 min，收集各组血清备用，
将剩余血细胞按每管 100 μl分装到 A、B、C 一次性
试管中，各加入 1 ml 10%溶血素，轻轻摇匀，静置 10
min，PBS洗 2 次，分别加入相应的荧光素标记抗体，
即 FITC-抗 CD3，PE-抗 CD4 和 PE-抗 CD8，于 4℃避
光反应 30 min，流式细胞仪检测 T 淋巴细胞 CD3、
CD4、CD8 的表达。
1. 2. 4 小鼠血清中 TNF-α、IL-2、IL-12 的测定 取
方法 1. 2. 2 中所得各组小鼠外周血血清，用 ELISA
法测定 TNF-α、IL-2 和 IL-12 的含量，操作步骤按产
品说明书进行。在酶标仪上测定波长 450nm 处的
A值。根据标准曲线计算出小鼠血清中 TNF-α、IL-
2、IL-12 的含量。
1. 2. 5 小鼠骨髓中细胞形态的变化 抽取各组小
鼠股骨髓进行涂片，经瑞特-吉姆萨染色后，光镜下
观察细胞的形态。每张涂片随机选取 5 个视野，计
数 100 个细胞中幼稚细胞与成熟细胞的比例。
1. 3 统计学分析 所有计量资料采用 SPSS13. 0 统
计软件进行统计处理，实验结果用 x ± s表示。数组
间比较采用单因素方差分析(ANOVA)和 Dunnett s
t检验，以 P ＜ 0. 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 FSEEＲ 对小鼠脾脏指数的影响 实验结果表
明，模型对照组小鼠脾脏指数明显降低，与正常对照
组相比差异具有统计学意义(P ＜ 0. 05)，说明 Cy 抑
制了小鼠免疫器官。FSEEＲ 低剂量组和 FSEEＲ 高
剂量组均可使小鼠脾脏指数升高，与正常对照组和
模型对照组相比差别具有统计学意义(P ＜ 0. 05)，
(图 1)。
图 1 FSEEＲ对化疗后小鼠脾脏指数的影响
Fig． 1 Effect of FSEEＲ on SI of mice treated by Cy
Note:* . P ＜ 0. 05 vs Control;# P ＜ 0. 05 vs Model.
·626· 中国免疫学杂志 2015 年第 31 卷
2. 2 FSEEＲ对小鼠外周血 T 淋巴细胞亚群的影响
与正常对照组相比，模型对照组 CD3 + CD4 + T淋
巴细胞的比例和 CD4 + /CD8 +比值均显著降低(P ＜
0. 05)，说明环磷酰胺免疫抑制模型制作成功;与模
型对照组相比，FSEEＲ低剂量组 CD3 + CD4 + T淋巴
细胞的比例和 CD4 + /CD8 + 的比值有所提高(P ＜
0. 05)，而高剂量组与模型对照组没有明显变化，差
异不具有统计学意义(P ＞ 0. 05)(表 1)。
2. 3 FSEEＲ 对小鼠外周血 TNF-α、IL-2 的影响
ELISA结果显示，模型对照组小鼠外周血 TNF-α、
IL-2 的含量较正常对照组明显降低，差异有统计学
意义(P ＜ 0. 05);与模型对照组相比，FSEEＲ 高、低
剂量组小鼠外周血 TNF-α、IL-2 的含量均有明显升
高，且差异有统计学意义(P ＜ 0. 05);FSEEＲ高剂量
组小鼠外周血 TNF-α、IL-2 的含量高于低剂量组，差
异具有统计学意义(P ＜ 0. 05)(表 2)。
表 1 FSEEＲ对小鼠外周血 CD3 + CD4 + CD8 +表达的影响
Tab． 1 Effect of FSEEＲ on expression of CD3 + CD4 +
CD8 + of mice peripheral blood
Groups CD3 + CD4 +(%)CD3 + CD8 +(%)CD4 + /CD8 +(%)
Control 36. 59 ± 1. 082) 20. 31 ± 1. 37 1. 80 ± 0. 192)
Model 26. 96 ± 1. 261) 22. 38 ± 1. 631) 1. 20 ± 0. 321)
FSEEＲ 60 mg /(kg·day)32. 40 ± 2. 011)2) 20. 04 ± 1. 59 1. 61 ± 0. 281)2)
FSEEＲ 120 mg /(kg·day)27. 08 ± 0. 971) 21. 54 ± 2. 18 1. 26 ± 0. 351)
Note:1)P ＜0. 05 vs Control;2)P ＜0. 05 vs Model.
表 2 FSEEＲ对小鼠外周血 TNF-α、IL-2 的影响
Tab． 2 Effect of FSEEＲ on TNF-α and IL-2 production by
mice
Groups TNF-α(pg /ml) IL-2(pg /ml)
Control 18. 19 ± 3. 122) 15. 20 ± 0. 472)
Model 4. 88 ± 0. 891) 7. 84 ± 0. 111)
FSEEＲ 60 mg /(kg·day) 20. 36 ± 2. 681)2) 12. 70 ± 0. 161)2)
FSEEＲ 120 mg /(kg·day) 27. 19 ± 2. 941)2) 16. 18 ± 0. 751)2)
Note:1)P ＜ 0. 05 vs Control;2)P ＜ 0. 05 vs Model.
图 2 FSEEＲ对小鼠骨髓象的影响(×100)
Fig． 2 Effects of FSEEＲ on hemogram of bone marrow in
mice(×100)
2. 4 FSEEＲ 对小鼠骨髓象的影响 小鼠骨髓涂片
染色结果显示，正常组骨髓象有核细胞增生活跃，粒
红比值正常，粒系各阶段比值、形态大致正常，成熟
粒细胞中杆状核多于分叶核。红系约占有核细胞的
20%左右，以中晚幼红为主，成熟红细胞形态正常。
巨核细胞多见。模型对照组小鼠骨髓象有核细胞增
生降低，粒、红、巨三系细胞均明显受抑，成熟红细胞
大小不等，巨核细胞少见，淋巴细胞比例增高。
FSEEＲ 处理组小鼠骨髓象可见上述骨髓抑制状态
有所改善(图 2)。
3 讨论
已有大量研究证明，机体的免疫抑制与肿瘤的
发生、发展和预后有着密切的关系［6，7］。从某种意
义上讲，肿瘤的发生是机体免疫力低下的结果，而肿
瘤细胞自身也可以合成分泌许多免疫抑制物，在细
胞、分子和基因等不同水平上干扰有效抗肿瘤免疫
效应的发挥，对肿瘤局部及机体全身免疫功能产生
抑制作用，使机体抗肿瘤能力大大下降，主要表现在
T、B 淋巴细胞数量异常、T 细胞亚群比值及 NK 细
胞活性下降，TNF-α 等细胞因子生成低下［8］。在治
疗肿瘤的过程中也有可能使机体的免疫力进一步下
降，如化疗、放疗等方法在杀伤肿瘤细胞的同时也会
对机体的免疫功能和骨髓的造血功能造成很大伤
害，严重时使治疗无法进行下去。另外，免疫受抑也
是导致肿瘤复发和远处转移的重要因素［9］。因此，
寻找既具有抗肿瘤作用而又能增强机体免疫活性的
药物已成为科研工作者新的研究方向［10］。中医药
在治疗恶性肿瘤，提高免疫力方面的应用由来已久，
更以其低毒、廉价、高效等优势越来越受到肿瘤医生
和患者的青睐［19］。本研究前期工作发现，连翘根醇
提取物(FSEEＲ)在体外具有显著的抗肿瘤活性［11］，
为了进一步研究其免疫调节作用，我们进行了体内
动物实验。
脾脏作为主要的外周免疫器官，是 T、B 细胞接
受血源性刺激分化成熟并产生效应 T 细胞和浆细
胞的场所，其良好状态是机体能否行使正常免疫功
能的重要保证。脾脏指数在一定程度上反映了机体
的免疫功能状态。本研究结果显示，FSEEＲ 可以提
高免疫抑制小鼠的脾脏指数。
T细胞在免疫应答过程中发挥重要作用，成熟
T淋巴细胞表面均表达 CD3 +，根据功能和 MHC 分
子限制性的不同，可将成熟 T细胞分为 CD4 + T细胞
和 CD8 + T细胞两个亚群，CD4 + T 细胞主要是辅助
性 T细胞(Th)和诱导性 T细胞(Ti)，具有辅助细胞
·726·孙佳玮等 连翘根提取物(FSEEＲ)对化疗后小鼠骨髓和免疫抑制的影响 第 5 期
免疫和体液免疫应答的作用，CD8 + T 细胞是细胞毒
性 T细胞(Tc)和抑制性 T细胞(Ts)，是重要的效应
细胞。正常情况下机体内各 T 淋巴细胞亚群相互
协作或相互制约，形成适度的免疫应答，维持机体正
常的免疫功能，当 CD4 + T 细胞比例较高或 CD4 + /
CD8 +值较大时，说明机体免疫功能状态良好。当不
同 T细胞亚群的数量和功能异常时，就可能导致机
体免疫功能紊乱，表现为 CD3 + T 细胞、CD4 + T 细胞
数量减少和 CD8 + T 细胞数量增高，导致 CD4 + /
CD8 +比值减小甚至倒置，如 AIDS 患者免疫力低
下，出现 CD4 + T细胞减少导致 CD4 + /CD8 +比值下
降的变化［12，13］。我们用 FCM检测了 FSEEＲ对小鼠
外周血淋巴细胞亚群的影响，结果显示，小鼠在低剂
量 FSEEＲ的作用下，能显著提高 CD3 + CD4 + T淋巴
细胞比例和 CD4 + /CD8 +比值，对 Cy 免疫抑制模型
有明显的恢复作用，而高剂量组却没有表现出这种
作用。说明只有在适当剂量 FSEEＲ作用于机体后，
才可以诱导辅助性 T 细胞增多、提高 CD4 + /CD8 +
比值使机体免疫功能增强。
肿瘤患者免疫抑制还体现在细胞因子水平上的
变化，如 TNF-α、IL-2、IL-12、IFN-γ 等［14，15］。TNF-α
是由活化的巨噬细胞产生的一种能够直接杀伤肿瘤
细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，是迄今
为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因
子之一。文献报道 TNF-α 除了对肿瘤细胞具有直
接毒性和生长抑制作用外，还可以通过增强 CD8 + T
细胞的细胞毒作用抵抗肿瘤的生长［16］。IL-2 是辅
助性 T细胞分泌的主要细胞因子，可以诱导记忆性
CD8 + T细胞增殖和分化，并在 CD4 + T 细胞分化转
变为效应 T细胞过程中发挥关键作用［17］，IL-2 可以
解除肿瘤对 T 细胞的抑制作用，抗肿瘤作用明
显［18］。本实验分别研究了 FSEEＲ 对小鼠外周血淋
巴细胞 TNF-α 和 IL-2 产生的影响，结果显示，
FSEEＲ能够明显提高免疫抑制小鼠外周血 TNF-α、
IL-2 的水平，进而发挥其免疫调节功能。
骨髓作为中枢免疫器官，是免疫细胞产生、分化
发育和成熟的场所，其造血功能在一定程度上可以
反映出机体免疫功能的强弱。本实验结果表明，
FSEEＲ可改善骨髓造血，显著提升骨髓有核细胞的
数量。FSEEＲ处理组小鼠骨髓象得到了恢复，说明
FSEEＲ 通过对造血系统功能的保护从而改善了环
磷酰胺免疫抑制小鼠的免疫功能状态。本实验初步
探讨了 FSEEＲ在体内模型中发挥的免疫调节作用，
为其在临床上的应用提供初步理论依据。
参考文献:
［1］ Masuda Y，Inoue M，Miyata A，et al． Maitake β-glucan enhances
therapeutic effect and reduces myelosupression and nephrotoxicity
of cisplatin in mice［J］． International Immunopharmacology，2009，
5(9):620-626.
［2］ 张海燕 . 连翘化学成分及药理活性的研究进展［J］．中药材，
2000，10:657-660.
［3］ 杨雪艳，刘成伦 . 连翘的研究现状与展望［J］．贵州农业科学，
2012，9:233-237.
［4］ 渠晓霞，毕润成 . 连翘种群生物学特征与种质资源研究［J］．
山西师范大学学报:自然科学版，2004，3(18):76 － 79.
［5］ 颜 晰，赵连梅，单保恩 . 连翘根醇提物体外诱导 TE-13 细胞
凋亡机制的研究［J］．肿瘤，2013，3:239-244.
［6］ Hurwitz AA，Watkins SK. Immune suppression in the tumor micro-
environment:a role for dendritic cell-mediated tolerization of T
cells［J］． Cancer Immunol Immunother，2012，61(2):289-293.
［7］ Stewart TJ，Smyth MJ. Improving cancer immunotherapy by targe-
ting tumor-induced immune suppression［J］． Cancer Metastasis
Ｒev，2011，30(1) :125-140.
［8］ 崔 澂 . 参与肿瘤免疫逃逸的免疫抑制分子［J］．临床肿瘤学
杂志，2005，10(5):545-548.
［9］ Topalian SL，Weiner GJ，Pardoll DM. Cancer immunotherapy comes
of age［J］． J Clin Oncol，2011，29(36) :4828-4836.
［10］ 朱 燕，朱 平，卜定方 . 化疗药物的免疫调节作用［J］． 肿
瘤，2011，(11) :1050-1054.
［11］ 颜 晰，赵连梅，孙佳玮，等 . 连翘提取物体外抗肿瘤活性的
初步研究［J］．癌变 畸变 突变，2012，24(1):20-24.
［12］ Yvonne J. Ｒosenberg，Arthur O. Anderson，Ｒeinhard Pabst. HIV-
induced decline in blood CD4 /CD8 ratios:viral killing or altered
lymphocyte trafficking? ［J］． Immunology Today，1998，19(1) :
10-17.
［13］ Parikh S，Shah I. Short-term follow-up of HIV-1 infected children
without treatment:use of CD4 /CD8 ratio as a marker of disease
progression［J］． J Trop Pediatr，2011，57(3) :235-236.
［14］ Poschke I，Mougiakakos D，Kiessling Ｒ. Camouflage and sabo-
tage:tumor escape from the immune system［J］． Cancer Immunol
Immunother，2011，60(8) :1161-1171.
［15］ Sikora AG，Hailemichael Y，Overwijk WW. Conference Scene:Im-
mune effector mechanisms in tumor immunity［J］． Immunothera-
py，2012，4(2) :141-143.
［16］ Shi M，Ye Z，Umeshappa KS Keshav S. Alpha tumor necrosis fac-
tor contributes to CD8 + T cell survival in the transition phase
［J］． Biochem and Biophys Ｒes Commun，2007，360 (3):
702-707.
［17］ Boyman O，Sprent J. The role of interleukin-2 during homeostasis
and activation of the immune system［J］． Nat Ｒev Immunol，
2012，3:180-190.
［18］ Waldmann TA. The IL-2 / IL-2 receptor system:a target for ration-
al immune intervention［J］． Immunol Today，1993，14 (5) :
159-164.
［19］ Zhu DY，Qu LH，Zhang XN，et al． Icariin-mediated modulation of
cell cycle and P53 during cardiomyocyte differention in embry-on-
ic stem cells［J］． Eur J Pharmacol，2005，514(223) :92-110.
［收稿 2014-11-07 修回 2014-12-02］
(编辑 倪 鹏)
·826· 中国免疫学杂志 2015 年第 31 卷