全 文 ：望江南蒽醌苷对小鼠免疫功能的影响
李月玲 , 张太平 , 李　俊 , 张鹤云
(南京大学 生命科学学院 医药生物技术国家重点实验室 ,江苏 南京 210093)
　　摘　要:目的 探讨望江南蒽醌苷(AG)对环磷酰胺(CTX)造成的免疫低下小鼠的保护作用。方法 体外 ,将小
鼠胸腺和脾淋巴细胞与不同浓度的 AG共培养 , 用MTT法检测 AG对胸腺和脾淋巴细胞增殖的影响;体内 , 腹腔注
射CTX形成免疫抑制模型。结果 体内试验中 ,与模型对照组小鼠相比 ,能显著升高外周血的白细胞数 , 增强腹腔
巨噬细胞的吞噬功能 ,能促进胸腺/脾淋巴细胞增殖 ,增加胸腺指数和脾指数。结论 AG具有免疫增强作用。
　　关键词:蒽醌苷;淋巴细胞;环磷酰胺;吞噬百分率;脾指数
　　中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1005-1678(2009)02-0103-03
The effect of anthraquinone glycosides from coffee senna on immunological function in mice
LI Yue-ling , ZHANG Tai-ping , LI Jun , ZHANG He-yun
(State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology , School of Life Sciences , Nanjing University ,
Nanjing 210093 , China)
　　Abstract:Purpose To investigate the protective effect of anthraquinone glycosides(AG)from coffee senna
on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide (CTX).Methods In vitro , the mouse′thymus and
spleen lymphocytes were co-cultured with AG , and thymus and spleen lymphocyte proliferation was determined
by MTT method.In vivo ,was established immunosuppressive model with CTX by ip and were observed the ef-
fects of AG on immunological function in model mice.Results Anthraquinone glycosides could significantly ac-
celerate thymus and spleen lymphocyte proliferation in vitro.Compared with model control group ,AG groups
could significantly increase the peripheral leukocyte count and enhance phagocytic activity of peritoneal
macrophage.Conclusion AG could enhance the immunological function.
Key words:anthraquinone glycosides;cyclophosphamide;lymphocytes;phagocyte rate;spleen/thymus
index
收稿日期:2008-10-06
作者简介:李月玲(1981-),女 , 山东菏泽人 ,硕士研究生;张鹤
云 ,通信作者 , Tel:025-83592335 , E-mail:cflab@126.com。
　　蒽醌苷(anthraquinone glycosides ,AG)由苷元和
糖结合而成 ,苷元为蒽醌衍生物 ,有大黄素 ,大黄酚 、
大黄素甲醚和大黄酸等 ,糖类一般为葡萄糖。研究
发现 ,AG是望江南中的主要活性成分之一 ,具有抗
菌消炎 、泻下 、抑制肿瘤生长及抗风湿等作用[ 1] 。本
实验是从望江南的茎中提取AG ,并进行淋巴细胞增
殖试验和对免疫抑制模型小鼠的免疫调节作用的
研究 。
1　材　料
1.1　实验动物
昆明种小白鼠 ,雌雄各半 ,体重 18 ～ 22 g ,南京
医科大学动物饲养中心提供 ,清洁级 , SCXK(苏)
2008-0004。
1.2　药品及仪器
AG(自制)。制备方法:望江南茎(本实验室种
植)粉碎机粉碎 , 加 10 ～ 15 倍体积冷水 , 煮沸 15
min ,过滤取上清 ,滤渣加水再重复煮 2次 ,收集 3次
滤液 ,此即为提取母液[ 2] 。母液经大孔树脂色谱 ,酒
精洗脱 , 浓缩除去酒精 , 离心得清液即为 AG 样
品[ 3] 。经测定AG含量为 95.3%。
山楂寡聚原花色素(OPC ,本实验室从山楂中提
取 ,专利号为 ZL01138055.1 ,使用前用水配成所需浓
度);RPMI 1640细胞培养液(GIBCO公司);四甲基偶
氮唑盐(MTT ,南京大治生物科技有限公司);ConA
(FluKa公司);环磷酰胺(CTX ,江苏恒瑞制药 ,用生
理盐水配成 10 g/L , 备用),白细胞稀释液(冰醋酸
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2 mL ,水 98 mL ,1%亚甲基兰液 150 μL ,混匀);胎牛
血清(北京元亨圣马生物技术研究所);DG5033A 酶
联免疫检测仪(南京华东电子集团医疗装备有限公
司生产);CO2培养箱(Thermo Forma公司)。
2　方　法
2.1　胸腺和脾淋巴细胞增殖试验(MTT法)
2.1.1　小鼠胸腺细胞和脾细胞悬液制备　取雄性
小鼠 ,于无菌条件下取脾脏和胸腺 ,按常规制备胸腺
和脾淋巴细胞悬液 ,其活力>95%, 用含 10%胎牛
血清的 RPMI 1640培养液调细胞浓度至 2×107/mL。
2.1.2　AG对淋巴细胞增殖的直接作用[ 4] 　取细胞
悬液 80μL/孔加入 96孔板 。空白对照组加入无血
清培养基 120 μL/孔 ,加药组加入无血清培养基 40
μL/孔和 4个不同浓度的 AG各 80 μL/孔(终浓度为
9.375 ,7.5 ,5.625 ,3.75 μg/mL)。
2.1.3　药物对 ConA诱导淋巴细胞增殖的影响　取
细胞悬液 80μL/孔加入 96孔板 ,设空白对照组和模
型组 ,空白对照组加无血清培养液 120μL/孔 ,其余
各组加 ConA 40 μL/孔(终浓度 5 μg/mL), 分组同
2.1.2项 , 模型组加入无血清培养基 80 μL/孔。96
孔板置于 37 ℃, 5%CO2 培养箱内培养 24 h后 ,加
入5 mg/mLMTT 8.5 μL/孔 ,继续培养 4 ～ 6 h ,再加
入20%SDS溶液 40μL/孔 ,培养过夜[ 5] 。次日用酶
标仪于490 nm波长测定吸光度 A 值 ,统计结果 ,计
算平均数 。
2.2　CTX造成的免疫低下小鼠模型
昆明种小鼠 60只 ,雌雄各半 ,随机分成 6组:正
常对照组 、CTX对照组 、阳性药OPC 对照组(150 mg/
kg)、AG高剂量组(150 μg/kg)、AG中剂量组(75 μg/
kg)和 AG低剂量组(37.5 μg/kg),每组 10只。1 ～ 3
d正常组腹腔注射生理盐水 ,其他组腹腔注射 CTX
100 mg/kg 。1 ～ 10 d 正常组和 CTX对照组灌胃水 ,
其他组依次灌胃 OPC 和不同剂量的 AG ,每天灌胃
或腹腔注射前均需称重 ,灌胃剂量按 20 mL/kg 计
算 ,腹腔注射剂量按 10 mL/kg 计算 。第 10 天末次
给药后 , 进行免疫指标的检测。所得数据均用
(x±s)表示 ,用 Excel的分析函数进行两样本均数
比较的 t检验进行统计学处理。
2.2.1　计数白细胞　末次给药后 ,每只眼眶采血
20 μL ,全血加入白细胞稀释液 0.38 mL 中 ,混匀静
止2 ～ 3 min ,置于血球计数板内 ,显微镜下进行白细
胞计数。
2.2.2　巨噬细胞吞噬百分率的测定　末次给药 1 h
后 ,给小鼠腹腔注射 20%鸡血红细胞悬液 0.5 mL ,
1 h后腹腔注射生理盐水 2 mL ,轻揉 1 min ,处死 ,吸
取腹腔液滴于载玻片上 ,然后干燥 ,甲醇固定 ,依次
用生理盐水和水漂洗 ,Giemsa 染色后在油镜下计数
100个巨噬细胞 ,计算吞噬的百分率[ 6] 。
2.2.3　脾指数和胸腺指数　第 10天处死小鼠后 ,
将脾脏和胸腺取出 ,称重 ,计算脾指数和胸腺指数
(mg/g)。
2.2.4　脾淋巴细胞和胸腺淋巴细胞增殖反应测定
(MTT 法)　末次给药后 ,颈椎脱臼处死小鼠 , 75%乙
醇消毒后无菌取脾脏和胸腺 ,在 100目滤网上研磨
制成脾细胞和胸腺细胞悬液 ,用 Hanks洗涤 , 2 000
r/min离心 5 min ,重复 3次 。用含 10%胎牛血清的
完全培养液配成细胞浓度为 2×106/mL ,取 100 μL
加入96孔板内 ,每个样品做 16个重复 ,空白组加无
血清培养液 100μL/孔 ,轻轻摇晃混匀 ,置 37 ℃,5%
CO2 培养箱中培养 24 h后 ,加 5 mg/mLMTT 10 μL/
孔 。再继续培养 4 ～ 6 h ,加 20%SDS 40 μL/孔[ 7] 。
培养过夜 ,次日用酶联免疫检测仪于 490 nm 波长处
测吸光度 A 值 ,统计结果 ,计算平均值。
3　结　果
AG对正常小鼠胸腺和脾淋巴细胞增殖的影响
结果见表1和 2。与空白对照组相比 ,各浓度 AG能
直接促进胸腺和脾淋巴细胞增殖 ,且效果显著(P<
0.01);在有丝分裂原 ConA诱导下 ,AG 对胸腺和脾
淋巴细胞的增殖也有明显促进作用 ,与无 ConA 的
模型组相比 ,效果差异不显著。
表 1　AG 对小鼠胸腺和脾淋巴细胞增殖的影响(x±s , n =
12)
Tab.1　Effect of AG on thymus and spleen lymphocyte proliferdtion
of mouse(x±s , n =12)
组别 浓度/(μg/mL) 胸腺 A 值 脾 A 值
对照组 - 0.40±0.01 0.43±0.01
AG 组 3.750 0.55±0.032 0.59±0.022
5.625 0.45±0.021 0.62±0.032
7.500 0.60±0.022 0.59±0.032
9.375 0.52±0.032 0.59±0.012
　　与对照组相比:1 P<0.05 , 2P<0.01
　　1P <0.05 , 2P <0.01 vs control group
　　AG 对小鼠免疫活性影响的结果见表 3 和 4。
与 CTX造成的免疫抑制模型相比 , 3个剂量的 AG
组均能极显著增加腹腔巨噬细胞吞噬百分率(P <
0.01),显著提高免疫抑制小鼠的白细胞数 ,对小鼠
脾淋巴细胞的增殖和脾指数也均有显著的增加作用
(P<0.05),对胸腺指数和胸腺淋巴细胞的增殖也
有显著的增加效果(P <0 .0 1);在低剂量
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表2　AG对 ConA诱导的小鼠胸腺和脾淋巴细胞增殖的影
响(x±s , n=12)
Tab.2　Effect of AG on ConA-induced thymus and spleen lympho-
cyte proliferdtion of mouse(x±s , n=12)
组别 浓度/(μg/ mL) 胸腺细胞+ConA 脾细胞+ConA
对照组 - 0.40±0.01 0.43±0.01
模型组 - 0.44±0.03 0.53±0.02
AG组 3.750 0.47±0.032 0.47±0.041
AG组 5.625 0.42±0.05 0.45±0.02
AG组 7.500 0.39±0.021 0.45±0.00
AG组 9.375 0.50±0.012 0.49±0.011
　　与模型组相比:1P <0.05, 2P <0.01
1P<0.05 , 2P<0.0 vs modle group
表 3　AG 对小鼠免疫活性的影响(MTT法)(x±s , n=10)
Tab.3　Effect of AG on immunological function of mouse(x±s , n
=10)
组　别 脾细胞 A 值 胸腺细胞 A 值
正常对照组 0.34±0.04 0.63±0.06
CTX对照组 0.70±0.02 0.27±0.02
OPC 对照组 0.86±0.032 0.33±0.032
AG高剂量组 0.60±0.04 0.29±0.011
AG中剂量组 0.83±0.062 0.40±0.022
AG低剂量组 0.59±0.03 0.26±0.02
　　与 CTX模型组相比:1 P <0.05, 2P <0.01
1P <0.05, 2P <0.01vs CTX modle group
表 4　AG 对小鼠免疫活性的影响(x±s , n =10)
Tab.4　Effect of AG on immunological function of mouse(x±s , n=10)
组　别 白细胞数/(×105/ mL) 巨噬细胞吞噬百分率/ % 脾指数/(mg/g) 胸腺指数/(mg/ g)
正常对照组 115.6±35.0 38.0±3.602 3.82±0.01 3.81±0.01
CTX对照组 104.8±56.8 　23±2.64 9.56±0.03 2.22±0.01
OPC 对照组 148.2±28.41 36.3±4.161 11.84±0.021 2.61±0.011
AG 高剂量组 181.8±63.42 31.7±3.512 12.14±0.021 2.71±0.012
AG 中剂量组 149.0±23.81 61.2±3.792 11.53±0.041 2.79±0.022
AG 低剂量组 123.4±31.81 31.7±5.13 9.96±0.03 2.85±0.012
　　　　与 CTX 模型组相比:1P<<0.05 , 2P<0.01
　　1 P <0.05 , 2P <0.01 vs CTX modle group
(37.5 μg/kg)时 ,虽对胸腺淋巴细胞的增殖和脾指
数的增加有一定促进作用 ,但是从统计学意义上看 ,
作用无显著差异(P>0.05)。
4　讨　论
自古 ,我国民间就有利用望江南治疗风湿性关
节炎的偏方 ,按常规用来治疗风湿性关节炎的药物
必定具有增强机体免疫力的作用。据报道 ,多种中
药中的主要活性成分为AG ,孙桂波等[ 8]已经证实何
首乌 AG 具有增强免疫力的作用。鉴于AG的理化
性质 ,我们采用了水提的方法 ,得到 AG 的水溶液 。
从体内体外两个方面来研究 AG是否可以提高小鼠
免疫力。
体外试验中 ,4个浓度的 AG均对正常小鼠的胸
腺和脾脏淋巴细胞的增殖有显著的促进作用 ,且在
没有加入有丝分裂原(Con A)时效果更显著 , 说明
AG可以提高胸腺和脾淋巴细胞的增殖活性。
体内实验中 ,从 5个方面全面显示出 AG 对免
疫损伤有卓越的保护和调节能力。中剂量组的 AG
对免疫抑制小鼠的脾/胸腺淋巴细胞的增殖和脾/胸
腺指数的增加效果明显 ,相比而言高 、低剂量组的效
果略低一些 。这种现象在中药研究领域经常出
现[ 9] ,而对腹腔巨噬细胞吞噬功能和外周血白细胞
数 3个剂量均有显著调节作用 。
结果表明 ,AG可显著增强小鼠免疫功能 ,可能
是望江南的主要活性物质之一。
参考文献:
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