全 文 ：ISSN 1000-0054
CN 11-5154 /N
　 清华大学学报 (自然科学版 )
J Tsingh ua Univ ( Sci & Tech ) ,
1999年 第 39卷 第 12期
1999, Vo l. 39, No. 12
2 /28
4～ 7　
藏红花的叶鞘培养与藏红花素类物质的合成*
郭志刚 ,　刘瑞芝 ,　刘　雪 ,　张华丁
清华大学 化学工程系 , 北京 100084
　　收稿日期: 1998-03-06
　　第一作者: 男 , 1958年生 , 副教授
　* 基金项目: 清华大学、 香港浸汇大学和北京中医药大学
合作项目
文　摘　为克服人工栽培藏红花的困难 ,采取细胞培养生产
藏红花素类药物是重要的生产途径之一。通过藏红花的叶鞘
组织脱分化培养可以诱导出愈伤组织。这些愈伤组织呈浅黄
色、黄色或橘黄色 ,含有与藏红花柱头基本相同的藏红花素
类物质。 以 M S作为培养基、添加 0. 5 mg /L的细胞分裂素
( BA)和 2. 0 mg /L的生长素 ( IAA) ,黑暗条件和 20℃培养温
度有利于愈伤组织的形成 ,并增殖了 5倍以上。 实验证明
20℃有利于藏红花素的合成。
关键词　藏红花 ; 藏红花素 ; 愈伤组织 ; 脱分化
分类号　 Q 942
　　藏红花 (Crocus sat ivus L)是珍贵的中草药。藏
红花柱头中含有的藏红花酸 ( Croci tin)、藏红花醛
( safranal)、藏红花素 ( Crocin)和藏红花苦素 ( Pro-
tocrocin)等物质具有较强的抗癌作用 [1～ 6 ]。
但是 ,由于藏红花的药用成分主要存在柱头中 ,
而干燥柱头的产量极低 ( 15 kg /hm2 ) ,如果进行大量
生产 ,不但需要大面积耕地 ,也要花费大量劳力。因
此 ,利用植物细胞培养法生产藏红花素类抗癌药物
是解决藏红花供求的有效方法之一。
目前 ,只有少数论文报道过藏红花柱头的离体
培养 ,其目的是诱导愈伤组织、柱头状物或再生植
株 [7～ 11 ]。 本文通过藏红花的叶鞘培养 ,探讨了植物
细胞培养法生产藏红花素等有用物质的可行性。
1　材料与方法
1. 1　脱分化和继代培养基优化
将刚发芽的藏红花球根清洗后切开 ,取出中心
部肥大的幼嫩叶鞘组织 ,在 70%的乙醇溶液中杀菌
50 s,然后移到 3%的次氯酸钠溶液中消毒 5 min,
再用无菌水冲洗三次。移放在无菌滤纸上吸去多余
水分 ,作为外植体备用。
选择 Murashig e & Skoog ( M S ) , Gamborg
( B5)和 White (W )培养基作为脱分化培养基 ,分别
加入吲哚乙酸 ( IAA) 1. 0 mg /L ,细胞分裂素 ( BA)
4. 0 mg /L。并且添加蔗糖 20 g /L和琼脂 7 g /L, 调
整 pH= 5. 8, 经 125℃ , 0. 1 M Pa灭菌后作成固体
培养基。 然后将无菌外植体在超净工作台内切成
1 mm长小段 ,接种在固体培养基表面。培养温度为
( 25± 1)℃ ,光照强度为 1. 0 klx ,照光时间为 14 h /
d。选用 MS和 B5为继代培养基 ,其 BA的添加浓
度分别为 0. 5 mg /L , 1. 0 mg /L, 2. 0 mg /L; IAA
的添加浓度均为 2. 0 mg /L; 蔗糖和琼脂的添加浓
度与脱分化培养基相同。培养温度为 ( 25± 1) ℃ ,采
取暗培养。
1. 2　激素浓度的影响
以 MS 为 基 本 培 养 基 , 用 0. 5 mg /L、
1. 0 mg /L、 2. 0 mg /L 和 4. 0 mg /L 的 BA, 与
1. 0 mg /L、 2. 0 mg /L和 4. 0 mg /L的 IAA进行正交
实验 ,蔗糖和琼脂的添加浓度与培养基筛选实验相
同。 培养温度为 25℃ ,采用暗培养。
1. 3　培养温度的影响
采用 MS为基本培养基 ,添加 0. 5 mg /L的 BA
和 2. 0 mg /L的 NAA,培养温度分别设为 15℃ ,
20℃和 25℃ ,采取暗培养 ,根据愈伤组织的生长量
( A )和接种量 ( B ) ,计算生长率为Z= A /B .
1. 4　藏红花素类化合物的检测
藏红花素的分析采用岛津牌高效液相色谱仪 ,
岛津 ODS色谱柱 (粒度 5μm, 6 mm× 150 mm) ,
流动相为甲醇和水的体积比为 20 80, 检测波长为
240 nm , 流速为 1. 0 mL /min。
收集不同处理的愈伤组织 ,均按每 20 mg鲜细
胞加 100 mL 75%乙醇溶液在黑暗条件下旋转震动
浸取 24 h,然后过滤收取浸取液进行高效液相色谱
分析。
2　结果与讨论
2. 1　愈伤组织的形成
将杀菌处理后的叶鞘组织接种在不同培养基
上 , 2周后部分叶鞘组织开始肥大 ,逐渐形成一种
暗黄色且形态独特的疏松性膨大组织。 1个月以后
将这些膨大组织进行继代培养时 ,有少数膨大组织
开始出现脱分化状态 ,形成浅黄色的愈伤组织。接种
外植体为 20时 ,其结果如表 1所示: 只有 MS和 B5
培养基有较低比例的愈伤组织形成。而 W培养基几
乎没有形成愈伤组织 ,表明 W培养基不适合藏红花
愈伤组织的诱导与培养。
表 1　不同培养基对藏红花叶鞘愈伤组织形成的影响
培养基 愈伤组织形成数 愈伤组织形成率 /%
M S 3 15
B5 1 5
W 0 0
分析愈伤组织的形成比例较低的原因 ,可能与
外植体的切取部位有关。在分生组织细胞较多的叶
鞘基部 ,具有形成愈伤组织的能力 ,由于叶鞘上部组
织的分生能力逐渐减弱而很难形成愈伤组织。此外 ,
可能与植物外源激素的添加浓度或比例有关。
2. 2　激素浓度的影响
根据以上实验 ,表明 MS培养基比较适合藏红
花的脱分化培养 ,因此选用 MS为基本培养基 ,添加
不同植物外源激素浓度 ,探讨不同激素配比对藏红
花愈伤组织形成的影响。接种外植体为 20时 ,实验
结果如表 2所示。 吲哚乙酸 ( IA A)的添加浓度在
1. 0 mg /L和 4. 0 mg /L时 ,均不利于愈伤组织的形
成 ,只有 IAA的浓度在 2. 0 mg /L时获得了较高的
愈伤组织形成率。 同时 ,在细胞分裂素 ( BA)的浓度
较低情况下 ,获得了较高的愈伤组织形成率 ,高浓度
的 BA不利于愈伤组织的形成。
外植体的脱分化培养 ,受外植体材料的内源激
素含量和培养基外源激素浓度双重作用的影响 ,虽
然外源激素的浓度可以人为控制 ,但是其内源激素
浓度几乎无法预测 ,而且由于叶鞘组织的不同部位
的激素含量不同 ,采取外植体的时间和季节不同其
内源激素的含量也不相同 ,所以此实验只能表明本
研究的采样时间诱导愈伤组织的适宜激素水平。 虽
然愈伤组织形成的比例不高 ,但是 ,可以证明藏红花
的叶鞘组织可以诱导脱分化形成愈伤组织。
表 2　激素浓度对藏红花愈伤组织形成的影响
激素水平 /( mg L- 1 )
BA IAA
愈伤组织数 愈伤组织形成率 /%
0. 5 1. 0 2 10
0. 5 2. 0 10 50
0. 5 4. 0 0 -
1. 0 1. 0 2 10
1. 0 2. 0 5 25
1. 0 4. 0 1 5
2. 0 1. 0 1 5
2. 0 2. 0 4 20
2. 0 4. 0 0 -
4. 0 1. 0 1 5
4. 0 2. 0 3 15
4. 0 4. 0 0 -
2. 3　愈伤组织的继代培养
在愈伤组织形成以后 ,要进行继代培养。由于大
多数植物的愈伤组织诱导和增殖的培养条件并不相
同 ,为了优化出适合于愈伤组织生长的培养基 ,进行
了实验 (表 3)。从实验结果可以看到 ,在继代培养过
程中 ,虽然 MS培养基上的愈伤组织可以持续增殖 ,
但是 ,随着细胞分裂素添加浓度的升高 ,能够生长的
愈伤组织比率下降 ,相反 ,胚状体的形成比率升高。
B5培养基不利于愈伤组织的生长和胚状体的形成。
因此 ,证明在 MS培养基上愈伤组织的生长需要较
低水平的细胞分裂素 ,而较高浓度的细胞分裂素有
利于胚状体的形成。
2. 4　培养温度的影响
藏红花是高原植物 ,适合在冷凉的气候条件下
生长 ,为了探讨培养温度对其愈伤组织生长的影响 ,
我们选用了 3个温度条件 ,进行了培养温度优化实
验。 从图 1可以看到 ,在培养初期 , 25℃处理的愈
伤组织生长速度最快 ,其次是 20℃处理 , 15℃处
理的愈伤组织生长缓慢。 但是 ,培养到 15 d以后 ,
25℃处理的愈伤组织生长减缓 , 20℃处理的生长
速度加快 , 20 d后就超过了 25℃处理 ,其生长量超
过了接种量的 5倍以上。因此证明 ,进行短期培养的
适温为 25℃ , 20 d以上长期培养的适温为 20℃。
这与很多植物的生长发育习性完全相同。
5郭志刚 , 等: 　藏红花的叶鞘培养与藏红花素类物质的合成
表 3　不同培养基对藏红花愈伤组织继代培养的影响
培养基 激素水平 / (mg L
- 1 )
B A IAA
接种愈伤
组织数
生长愈伤
组织率 /%
胚状体形
成率 /%
0. 5 2. 0 44 100. 0 0. 0　
M S
1. 0 2. 0 72 25. 0 75. 0
2. 0 2. 0 75 9. 3 90. 7
4. 0 2. 0 39 10. 0 90. 0
0. 5 2. 0 80 17. 5 50. 0　
B5
1. 0 2. 0 70 0. 0 50. 1
2. 0 2. 0 60 1. 7 48. 3
4. 0 2. 0 98 4. 1 30. 6
图 1　温度对藏红花愈伤组织生长的影响
2. 5　藏红花素类化合物的生物合成
在愈伤组织培养过程中 ,培养条件不同愈伤组
织的颜色有所区别 ,可以分为浅黄色、黄色和橙红色
等。特别是温度处理的愈伤组织 ,其颜色随着处理温
度的降低而逐渐加深。 这表明愈伤组织中藏红花素
的含量存在差别。
图 2　不同温度处理对于愈伤组织 HPLC图谱的影响
将藏红花的愈伤组织提取物与藏红花柱头的提
取物进行比较分析 ,在 240 nm的紫外吸收区均有
较大的吸收峰 ,而且其出峰时间完全相同 (见图 2) ,
因此确认从藏红花叶鞘诱导出的愈伤组织也能够合
成与藏红花柱头完全相同的藏红花素类物质。 从不
同温度θ处理的愈伤组织提取物的出峰面积指数 ,
可以了解到 , 20℃有利于藏红花素的合成 , 25℃
次之 , 15℃有一定的抑制作用 (见表 4)。其中温度
处理为 20 mg鲜细胞加 100 mL 75%的乙醇提取
液 ,对照为藏红花柱头提取浓缩液稀释 50倍 ,进样
量均为 30μL。
表 4　不同处理温度对 HPLC峰面积的影响
提取物 θ/℃ 保留时间 t /min 峰面积指数
愈伤组织
20 2. 695 71 608
25 2. 700 64 596
15 2. 680 37 428
藏红花 2. 670 66 842
3　结　论
通过以上实验证明 ,藏红花的叶鞘通过脱分化
培养可以形成愈伤组织 ,而且这些愈伤组织可以合
成与藏红花柱头完全相同的藏红花素类化合物。 此
外 , M S培养基、较低浓度的细胞分裂素 ( BA)有利
于叶鞘愈伤组织的形成和生长 , 20℃培养温度有
利于藏红花愈伤组织的增殖和藏红花素的合成。 但
是 ,在培养过程中发现 ,当愈伤组织合成黄色素以
后 ,其增殖速度明显减缓 ,这表明藏红花素类化合物
确实具有抑制细胞分裂的作用。因此 ,在藏红花素类
化合物生产的研究过程中 ,必须采取两段培养法 ,既
细胞增殖阶段和藏红花素类物质合成阶段。
参　 考　文　献
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Leaf sheath culture of Crocus
sativus L and crocin family
biosynthesis
GUO Zhigang , LIU Ruizhi , LIUXue ,
ZHANG Huading†
Depa rtment o f Chemica l Engineering ,
Tsinghua Univ er sity , Beijing 100084, China
Abstract　Crocus sativus L, a Chinese precious h erbal
medicine, has impo rtant medical v alue. Because o f their
difficult cultiv ation, cell culture is one of th e most
impo rtant way s o f producing crocin family medicine. Th e
lea f sh ea th could fo rm callus by dediffe rentia ting culture.
The ca llus showed yellow o r o range , and included cro cin
family a s same as those in capitals o f Crocus sativus. Th e
fo rmation of Crocus sativus ca llus w as advanced in th e
condition of Murashig e and Skoog ( MS) medium,
0. 5 mg /L BA , 2. 0 mg / L IAA, dark, at 20℃ , and in this
condition the w eigh t of Crocus sa tivus callus incr ea sed over
fiv e times in 25 days. The condition o f 20℃ was a lso in
favour o f the cro cin family bio synthesis.
Key words　 Crocus sativus; c rocin; ca llus;
dediffer entiating
(上接第 3页 )
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Vapo r-liquid equilibria fo r methano l + ethanol +
calcium chlo ride , + ammonium iodide, and+ sodium
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Correlation and prediction of
vapor-liquid equilibria for
a system containing salt
YU Yangxin , ZHUWentao† ,
LIUJiangang , GAO Guanghua
Depar tment of Chemical Engineering ,
Tsinghua Univ er sity , Beijing 100084, China;
† Depar tment o f Chemistry , T singhua Univ e rsity ,
Beijing 100084, China
Abstract　 In o rder to study the effect o f salt on the
vapor-liquid equilibria, the Clegg-Pitzer equations w ere
simplified and used to co r relate and predict the vapor-liquid
equilibrium da ta for the systems containing salt. For most
bina ry systems, the ave rage absolute deviations o f the vapo r
pr essur es between th e cor related r esults and the
experimental data a re less than 1% . Th e interac tion
par ameter s determined f rom th e data fo r the binar y systems
can be used to predict the ternar y mixed so lv ent systems
with out any additional pa rame ters. Fo r fiv e ternar y
sy stems, the to tal av erage abso lute devia tion is 0. 025 in the
vapor-phase composition, and 2. 1% in the vapo r pr essur e.
Key words　 co rr elation; pr edic tion; v apor-liquid
equilibrium; sy stem containing salt;
Cleg g-Pitzer equa tion
7郭志刚 , 等: 　藏红花的叶鞘培养与藏红花素类物质的合成