全 文 ：收稿日期:2010-02-08;修回日期:2010-04-07
基金项目:浙江工业大学重中之重学科开放研究基金;浙江经贸
职业技术学院院级课题(08YB02);浙江经贸职业技
术学院大学生科技创新创业项目资助
作者简介:徐砺瑜(1983-), 女 ,微生物学硕士 ,讲师 ,研究方向
为微生物制药与天然产物分离 , E-mail:xuliyu8362@
126.com。
doi∶10.3969/j.issn.1008 -9632.2011.01.050
杨梅树皮黄酮的提取及体外抗氧化研究
徐砺瑜 ,秦　钢
(浙江经贸职业技术学院应用工程系 , 杭州 310018)
摘　要:采用乙醇热回流提取法对杨梅树皮中总黄酮进行提取 , 通过正交试验确定了杨梅树皮总黄酮乙醇热回流提
取法的最佳工艺条件:以 28目的杨梅树皮粉为原料 ,料液比为 1∶60,用 60%的乙醇溶液在 60℃的水浴中提取 2.5h,
提取率达 6.86%。利用清除DPPH自由基的能力和还原力作为指标测定了杨梅树皮总黄酮的抗氧化活性。结果表
明 , 杨梅树皮黄酮有较强的抗氧化能力。
关键词:杨梅树皮;黄酮;抗氧化
中图分类号:Q946.82 文献标识码:A 文章编号:1008-9632(2011)01-0050-03
Studyonextractionandantioxidantactivitiesofflavonoids
inthebarkofMyricarubra
XULi-yu, QINGang
(AppliedScienceDepartment, ZhejiangEconomic＆TradePolytechnic, Hangzhou310018, China)
Abstract:TheheatrefluxextractwasadoptedtoextractflavonoidsinthebarkofMyricarubra.Basedontheorthogonaltestresult, the
optimumextractionconditionswereobtained.Whenthesamplewith28 meshgranularitywastreatedwith60% ethanolatthesolid/
liquidratio1∶60(w/v)at60℃, 2.5h, flavonoidyieldwas6.86%.Theantioxidantactivitiesofflavonoidextractswereevaluatedby
twoantioxidantslike1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)radicalsscavengingandreducingpower.Theresultsshowedthatthean-
tioxidantactivitiesofextractsareobvious.
Keywords:Myricarubra;lavonoids;antioxidantactivity
杨梅(MyricarubraBieb.etZucc)是原产中国的亚热带
果树之一 ,杨梅科 、杨梅属果树。野生种生长史已有 7000
多年 ,人工栽培已有 2000多年 [ 1] 。杨梅是中国的特色果
树之一 ,主要分布于长江以南。它宜种性广 ,有很高的生
态经济效益 [ 2] 。近些年来 ,中国杨梅栽培迅速发展 ,现在
长江流域以南均有栽培 ,主产浙江 、江苏 、福建 、江西 、湖南
及广东等省。
杨梅果实 、树叶和树皮均可入药 ,其中杨梅树皮性温 、
味苦辛涩 、无毒 ,含有大量的黄酮类化合物 ,具有抑制血小
板聚集 、调血脂 、抗氧化 、抑菌 、抗肿瘤 、抗炎 、抗过敏等作
用 [ 3-4] 。
近年来 ,对于杨梅植株中的各种活性成分的提取研究
已成热点 。邹耀洪 [ 5]等通过从杨梅果核中提取分离到的
黄酮类化合物 ,采用 Rancimat法测定其抗氧化性能 ,结果
表明其对油脂是优良的抗氧化剂 ,可作为天然抗氧剂应用
于油脂较高的食品保藏上 。
浙江省是杨梅种植大省 ,为调节生长与结实的关系 ,
促进持续 、优质 、高产 ,每年都需对杨梅树进行整形修剪 ,
从而产生大量杨梅废枝和树皮。本研究的目的就是优化
杨梅树皮中总黄酮的热回流提取工艺 。同时 ,选择具备抑
制过氧化物的生成及破坏已经生成的过氧化物 ,将广泛应
用于食品抗氧化的常用抗氧化剂苯钾酸钠 、抗坏血酸
(Vc)作为对照 [ 6-8] ,对杨梅树皮黄酮提取物的体外抗氧
化活性进行研究 ,为杨梅树皮的有效利用提供了一些理论
依据。
1　材料与方法
1.1　材料 、试剂与仪器
杨梅树皮 ,产自浙江余姚 。
芦丁(Rutin)标准品 ,中国药品生物制品检定所;DP-
PH, Sigma公司;亚硝酸钠 、硝酸铝 、氢氧化钠 、无水乙醇 、
铁氰化钾 、三氯乙酸(TCA)、氯化铁 、苯钾酸钠 、抗坏血酸
50
第 28卷第 1期
2011年 2月
生 物 学 杂 志
JOURNALOFBIOLOGY
Vol.28　No.1
Feb, 2011
(Vc)均为分析纯 ,市售。
LH-08B连续流粉碎机;HJ-6A多头恒温磁力加温搅
拌器;T6新世纪紫外可见分光光度计;SHB-II循环水式
多用真空泵;AR-2140电子天平 、SPS-202F电子天平 、
DHP-9052恒温培养箱。
1.2　方法
1.2.1　标准曲线的绘制 [ 9]
精密称取芦丁标准品 0.0313g,用 30%乙醇溶解后 ,
完全移至 100mL容量瓶中用 30%乙醇定容至刻度 ,折算
后(因实验所用芦丁标准品为 91.7%且含 3个结晶水)得
0.267mg/mL的标准溶液备用 。
精确量取芦丁标准溶液 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、
3.0mL,分别加入 7支具塞试管中 ,然后分别加入 5%的
NaNO2溶液 0.3mL,摇匀放置 6min,再分别加入 10%的
Al(NO3)3溶液 0.3mL,摇匀放置 6min,再分别加入 7%的
NaOH溶液 4.0mL,用 30%乙醇定容至 10mL,摇匀放置
10min。在 510nm波长测定其吸光度 A,试剂为空白参比 。
根据测定结果 ,以吸光度 A为纵坐标 ,芦丁质量浓度为横
坐标绘制标准曲线 ,如图 1所示 。得到吸光度 A与芦丁质
量浓度 C(mg/mL)关系曲线的回归方程为 A=16.999C-
0.0633,相关系数 R2 =0.9990。
图 1　芦丁标准曲线
Fig1Thestandardcurveofrutin
1.2.2　杨梅树皮中总黄酮的提取及测定
1.2.2.1　原料处理 将杨梅树皮自然风干 ,经粉碎机粉
碎过筛 ,得 28目杨梅树皮粉 ,备用。
1.2.2.2　杨梅树皮总黄酮的提取及工艺优化 [ 10-12]
杨梅树皮※粉碎※过筛※热回流提取※抽滤※定容
※待测液 。准确称取一定量杨梅树皮粉末(28目)于平底
烧瓶中 ,根据实验设计分别在不同实验条件下用乙醇进行
杨梅树皮总黄酮热回流提取 ,提取液抽滤定容得待测提取
液 。选择乙醇为提取溶剂 ,在预实验中发现 ,物料浸泡时
间对提取率几乎无影响。因此 ,本实验主要讨论乙醇的浓
度 、料液比 、提取温度和提取时间对黄酮得率的影响 ,通过
正交试验 ,选取最佳的黄酮提取工艺。
1.2.2.3　杨梅树皮总黄酮的测定 准确移取 1mL待测
提取液 ,加 9mL30%乙醇稀释 10倍后移取 1mL于具塞试
管中 ,以 1.2.1中的测定方法测出吸光度 ,据标准曲线计
算出杨梅树皮中总黄酮的含量。总黄酮提取率按下式计
算:
提取率 =(C×V×100)/(W×1000)×100%。式中 ,
C为根据回归方程计算得到的提取液中总黄酮浓度(mg/
mL);V为提取液体积(mL);100为稀释倍数;W为杨梅树
皮粉的质量(g)。
1.2.3　黄酮提取物体外抗氧化作用的测定
本实验选用了清除 DPPH自由基的能力以及还原力
作为测定杨梅树皮黄酮提取物的抗氧化能力的指标。同
时以苯甲酸钠 、Vc作为对照 。
1.2.3.1　对 DPPH自由基的清除能力 [ 12] 将 1.5mL的
样品(0.2 ～ 2mg/mL)与等量的 DPPH(2×10-4mol/L,乙
醇溶解)溶液均匀的混合 , 25℃避光静置 30min,在 517nm
下测定其吸光值 Ai。同时用同法测定 1.5mLDPPH(2×
10
-4mol/L)溶液与等量的无水乙醇混合后的吸光值 Ae,
以及 1.5mL样品与等量无水乙醇混合后的吸光值 Aj。样
品对 DPPH的清除率 =[ 1-(Ai-Aj)/Ae] ×100% 。以
苯甲酸钠 、Vc作对照。
1.2.3.2　还原力 [ 13] 1mL的样品 (1 ～ 5mg/mL)与
2.5mL的磷酸缓冲液(0.2mol/L, pH值 6.6)及 2.5mL的
铁氰化钾 (1%)混合 ,于 50℃下保温 20min。之后 ,将
2.5mL10% 的 TCA加入到上述混合液中 ,离心。取
2.5mL上清液 ,加入 2.5mL的蒸馏水以及 0.5mL的 FeCl3
(0.1%)混匀后于 700nm下读取吸光度。吸光度越大 ,还
原力越强 。以苯甲酸钠 、Vc作对照 。
2　结果与分析
2.1　正交设计实验结果
选择提取工艺中的 4个关键因素:料液比(w/v)、乙
醇浓度(%)、提取温度(℃)、提取时间(h),各设置 3个水
平 ,进行了四因素三水平 L9(34)正交设计实验(见表 1),
得出如下(表 2)结果。对正交实验结果进行分析 ,得出最
佳提取工艺。
表 1　正交实验因素水平表
Table1 Factorsandlevelsoftheorthogonaltest
水平
因素
A料液比
(m∶v)
B乙醇浓度
(%)
C提取温度
(℃)
D提取时间
(h)
1 1∶40 40 60 1.5
2 1∶50 60 70 2.0
3 1∶60 80 80 2.5
通过对料液比 、乙醇浓度 、提取温度 、提取时间的综合
评价 ,采用极差分析实验结果(表 2)可知 ,四个因素对杨
梅树皮黄酮提取的影响程度不同 ,各因素的影响程度依次
为 A(料液比)>B(乙醇浓度)>C(提取温度)>D
(提取时间),即料液比对杨梅树皮总黄酮的提取结果影
响最大 ,其次是乙醇浓度和提取温度 ,提取时间的影响最
小 。从正交实验结果得到最佳的提取工艺为 A3B2C1D3 ,
即最佳料液比为 1∶60,最佳乙醇浓度为 60%,最佳提取温
度为 60℃,最佳提取时间为 2.5h,杨梅树皮总黄酮提取率
为 6.86%。
51
第 28卷第 1期
2011年 2月
生 物 学 杂 志
JOURNALOFBIOLOGY
Vol.28　No.1
Feb, 2011
表 2　L9(34)正交实验结果
Table2Theresultsoforthogonaltest
实验序号 因素A B C D
提取率
(%)
1 1 1 1 1 5.44
2 1 2 2 2 5.58
3 1 3 3 3 5.42
4 2 1 2 3 6.48
5 2 2 3 1 6.83
6 2 3 1 2 5.74
7 3 1 3 2 6.79
8 3 2 1 3 6.86
9 3 3 2 1 6.40
K1 16.44 18.71 19.04 18.67K2 19.05 19.09 18.46 18.11K3 20.05 17.56 18.04 18.76k1 5.48 6.24 6.35 6.22k2 6.35 6.36 6.15 6.04k3 6.68 5.85 6.01 6.25
R 1.20 0.51 0.34 0.21
Ki(i=1, 2, 3)表示因素各水平的指标总和 ,简称水平总和;ki(i=
1, 2, 3)表示因素各水平的指标均值 ,简称水平均值;R表示水平均
值的极差 ,简称极差 [ 14]
2.2　体外抗氧化作用结果
2.2.1　DPPH自由基的清除能力
不同浓度的样品及对照对 DPPH自由基的清除能力
见图 2,得到的杨梅树皮黄酮提取物在浓度为 1.2mg/mL
时 ,对 DPPH自由基的清除率已大于 90%。杨梅树皮黄酮
提取物对 DPPH自由基的清除效率远高于苯甲酸钠 。
2.2.2　还原力
从图 3可见 ,在低浓度时 ,黄酮提取物的还原能力要
比对照品 Vc和苯甲酸钠都要低 ,但当浓度大于 3mg/mL
时 ,苯甲酸钠的还原能力趋于平缓 ,而黄酮提取物的还原
力却在不断增加 ,并逐渐大于苯甲酸钠的还原力。
3　结论
确定乙醇热回流提取杨梅树皮总黄酮的工艺:以 28
目的杨梅树皮粉为原料 ,按料液比为 1∶60的比例 ,用 60%
的乙醇溶液在 60℃的水浴中提取 2.5h,提取率达 6.86%。
通过对杨梅树皮黄酮提取物体外抗氧化活性的研究
可知 ,杨梅树皮的黄酮提取物具有一定的抗氧化能力 ,虽
然与 Vc相比有一定差距 ,但比苯甲酸钠的抗氧化性要强 ,
且成本低廉 ,没有毒害 。
本研究对杨梅树皮总黄酮的提取及体外抗氧化活性
进行了研究 ,可为杨梅树皮总黄酮的进一步研究利用提供
理论基础 ,并为杨梅树皮的有效利用 、提高杨梅种植产业
附加值提供了理论依据。
参考文献:
[ 1]邹耀洪 , 李桂荣.反相高效液相色谱分析杨梅叶中抗氧化成分黄酮类
化合物[ J] .分析化学研究简报 , 1998, 26 (5):531-534.
[ 2]邓　睿 , 黄敬峰 , 王　琼 , 等.基于 GIS的浙江仙居杨梅种植潜力分
析 [ J] .科技通报 , 2009, 25 (1):7-11.
[ 3]魏朝良 , 于德红 , 安利佳.黄酮类化合物及清除自由基机制的探讨
[ J] .中成药 , 2005, 27 (2):239-241.
[ 4]唐　霖 , 张莉静 , 王明谦.杨梅中活性成分杨梅素的研究进展 [ J] .中
成药 , 2006, 28(1):121-122.
[ 5]邹耀洪.杨梅果核中油脂抗氧化成分的研究 [ J] .林产化学与工业 ,
1995, 15 (2):13-17.
[ 6]梅　约 , 何小莲 , 任世宣.Vc破坏 、抑制油脂中过氧化物及其生成的
研究 [ J] .食品科技 , 2000, (1):37-39.
[ 7]施菊萍.维生素 C在油脂中抗氧化性的研究[ J] .职业与健康 , 2006,
22(8):586-587.
[ 8]张健强 , 张建光 , 付艾莉 , 等.外源抗氧化剂对高温胁迫下苹果果皮
组织酶活性的影响[ J] .华北农学报 , 2005, 20(2):41-44.
[ 9]胡静丽.杨梅叶提取物抑菌作用的研究 [ D] .浙江大学 , 2003, 35 -
41.
[ 10]高中松 , 彭密军 , 高　亮 , 等.桑叶黄酮的提取分离纯化研究[ J] .
安徽农学通报 , 2005, 11(6):48-50.
[ 11]王延峰 , 李延清 , 郝永红 , 等.超声法提取银杏叶黄酮的研究[ J] .
食品科学 , 2002, 23(8):166-167.
[ 12] Brand-WiliamsW, CuvelierME.Useofafreeradicalmethodtoevalu-
ateantioxidantactivit[J] .LebensmWissTechnology, 1995, 28:25-30.
[ 13] OyaizuM.Studiesonproductofbrowningreactionpreparedfromglucose
amine[J] .JapaneseJournalofNutrition, 1986, 44:307-315.
[ 14]郝拉娣 , 于化东.正交试验设计表的使用分析[ J] .编辑学报 , 2005,
17(5):334-335.
52
第 28卷第 1期
2011年 2月
生 物 学 杂 志
JOURNALOFBIOLOGY
Vol.28　No.1
Feb, 2011