全 文 ：第 1 7卷
1 98 7年
第 3期
9J J
植 物 病 理 学 报
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1 9 8 7
侵染蚕豆的芜著花叶病毒的鉴定与提纯 `
许志纲 A l a : 1 J . C o e k b a i了z
(南 京农业大学植保 系 ) (R o t ll a m s t e d E x p . s t a t io n , E n g l a n ol )
提 要
在 江苏 浙江等地 的蚕豆 苗上出现 的红褐色环斑 或自色斑 驳症状 , 经 鉴定是 芜苦花叶病毒佼 害的结果 . 在病
组织中的病毒粒体为弯杆 状 , 长度 75 。一 8 。。 n m . 摩擦接种在 览色羹上 , 接种叶上 出现 大块黄 色枯斑 , 直 径约 3
毫米 , 顶叶系统感染 , 在克 氏烟 、 芜普 、 油菜上为系统花叶 . 在 蚕豆 苗上的症 状 , 视品种和环境条件而 异 , 在
有限生 长的品种 上多为红揭色环斑 , 在 启东蚕豆上 多为 白色斑驳 , 豆芙上也可 出现变色斑 . 对病毒的提 纯方法
作了改进 . 用 冻融的 20 肠蔗糖溶液可代替常规 的 10 一 40 肠蔗糖梯度液 , 精 提纯的效果相 同 .
芜苦花叶病毒 ( T o r 。幼 。 ; .os 面。 : i : 妙 ) 是十字花科和茄科等蔬菜作物的重要病原之一 。
如北方大白菜的孤丁病 , 南方油菜 、 青菜 、 甘兰等花叶病多由 T u M V所 引 起 , ! ” ` 1 T u M V
的寄主范 B1[ 较广 , 至少可以侵染20 余科 2 0 多种植物 圈 , 但在豆科植物土只有少 数 儿 个 报
道 , 如在豌豆和花生 l田 上曾分离到 , 至今未见 可以在蚕豆上侵染的报道 ! ` ’ 5 ’ 。 ” 。 l 。
从 1 9 8 3年起 , 在 长江下游的蚕豆产区进行病害调查时 , 经常见到叶部呈现红褐色斑块 、
环斑或自色斑驳等症状 , 采集的标样经实验室接种测定 , 生物学性状的研究 , i正明是由芜苦
花叶病毒侵染所造成 ! 2 ; 。
试验材料与方法
( 一 ) 样本来源 1 9 8 3 ~ 1 9 8 5年在南京 、 南通 、 成都 、 武昌和杭州等地采得红褐色环斑
的标本23 份 , 白色斑驳状的标本 1 1份 。
( 二 ) 寄主范围的测定 从 田间采得的病叶 , 首先用汁液摩擦接种的方法回接到一套鉴
别寄主上 , 它们是览色草 ( C人e n o 夕 o d i u o a o a r a n t i c o l o r ) . 昆诺 摹 ( C . g o i n o a ) , 克 氏 烟
( N i
e o t i a n a e l e o e l a n d i i )
, 心 [l }·烟 ( N . 夕 l u t i n o 、 a ) , 豌 豆 ( P i o u , ,: 、 a t i o u , ,: c o . o n二 a r -
d )
, 蚕豆 ( V i c i a f a b a c o . o i n d o n ) , 矮牵牛 ( P e t u n i a h y b r i d a ) , 大互 ( G l y e i o e , ,: 。 -
二 e 。 . 1 1 3 5 一 2 ) 和芜菩 ( B r a 、 、 i c a r a 尹 a ) 。 供接种的植物先经黑暗处理 , 接种后放在 公l汽城可
中培养观察 。
( 三 ) 病毒粒体的现察 病组织和提纯过程中病毒粒体的 电镜观察 , 都采用微从喷雾法
制备铜网样品 , 用 2% P T A 负染后镜检 。
免疫电镜 ( IS E M ) 观察的过程如下 , 先将涂有 F or m v ar 膜的铜 网放在稀 释 的 抗 血.清液
滴上 , 室温下致敏孵育 1小时 , 经缓冲液滴转移漂洗 2次后 , 移放在待检样品液滴土 , 在冰箱
中过夜 , 第2天用缓冲液淋洗后 , 用 2肠P T A 负染 , 滤纸条吸去多余的染液后镜检 。 为 J’ 验证
. 本试 验是在英 国协作期间完成 的 . M r . R . W。 。 ds 和M sr . S . R o ber t s协助 电镜检查 , 方 中达教授 审阅文
稿 , 特此致谢 ,
二 /户
1叙 植 物 病 理 学 报
样 品网 上的病 一毒粒体是否为特异性的抗体所吸附 , 以及测定其 血清型 , 在负染以前 , 还 可用
稀释 10 。倍的抗初 _清作第二次吸附处理 , 即双抗体 兔疫吸附法或装饰法 ( d e c or at i l l g m c t h o d ) 。
( 四 ) 血清学检验 除去土述免疫 电镜 ( IS E M ) 法之外 , 还采用奥 氏双扩散 ( O D D )
法来检测 , 琼脂糖的含 录为 0 . 8 肠 , 在 。 . ol M 磷酸 盐缓冲液 ( p H 7 . 2 ) 中还加有 0 . 1% 的 S D S
和叠氮化纳 。 试验 中供 测定的抗血清种类有大豆花叶病毒 ( S M V ) 、 菜豆黄化叶病 毒 ( B Y
M V )
、 西方甜菜黄化病毒 ( W BY V ) 和芜蓄花叶病毒 ( T u M V ) 等的抗血清 , 在上述供试
的抗 血清中 , 除 S M V 的抗血清由南农提供外 , 均山英国提供 。
( 五 ) 病毒的提纯 供提纯的病毒是接种在克氏烟和芜若苗上 , 接种 20 天后采收病叶 ,
按叶重 1 . 5倍的量加入 o . SM的磷酸盐缓冲液 ( p H 7 . 2 ) , 以及 琉 基 乙 酸 和 T r i ot n X一 1 0八
( 均为 0 . 1肠 , v / v ) , 匀浆后过滤 , 滤液中加 25 肠的氯仿 ( v/ v ) 并搅拌 l,J 、 时 , 经 两 次 差
速离心 ( 8 0 0转 /分 , 15分钟和 2 8 0 0 0转 /分 , 2小时 ) 后得半提纯品 , 进一步提纯是放在蔗糖
密度梯度溶液上离心后 , 用巧 C O 分部取样器取出 。 在工作 中 , 常规的蔗糖 密 度 梯 度 溶 液
( 10 一 0J 肠 ) 也可用较为简化的方法来制备 , 即先配制 2 0% 蔗糖液 , 分装在离心管中 , 在低
温冰箱 ( 一 2 0 O C ) 中冻结贮存 , 临使 用前 2小时取出放在室温下融化 , 然后在液而上层加样
后离心 , 此即 “ 冻融的 ” 蔗糖梯度液 。
结果与讨论
( 一 ) 接种植物上的症状 用摩擦接种的方法接种在芜普 、 油菜和克氏烟上 , 表现为系
统感染 , 上位叶出现典型的花叶症状 ; 在览色蘸和 昆诺黎上 , 接种叶上出现直径约 3 毫米的
大块枯斑 , 斑的数量较少 , 系统感染 , 顶叶出现少量变形或扭 曲症状 , 但在接种叶以上的数
叶在不久即可脱落 : 在蚕豆上的症状 , 可 因品种 、 生育期和环境条件的不同而有差异 , 一般
在有限花序的品种和成胡 一卜号等品种上 , 表现为紫红色环斑 , 有的在嫩英上也有 红 褐 色 斑
块 , 而在三种蚕豆上多为灰 自色的斑驳症状 , 或者在接种叶上表现为红褐色 环 斑 , 而 上 位
叶 、 尤其是顶叶表现为 自色斑驳症状 I ` ’ 2 ’ “ ] 。 病株开花减少 , 结荚小 , 产量低 , 对产量有较
大影响 。
( 二 ) 病毒粒休形态 以病叶汁液来制备的样品 , 在电镜下的形态为略弯曲的杆状 , 长
度约 75 0一 8 2 0 n m , 多数粒体长 s o o n m ; 作为对照 , 英国的 T u M V的粒体长度多为78 O n m 。 在
免疫 电镜的制备过程中所见病毒粒体的形态 , 似较常规的方法制备所见的要僵直些 , 很少弯
以臼.
( 三 ) 血清学反应 在凝胶双扩散法的检测过程中 , 南京 、 杭州等地的病叶汁液 , 能与
上海农科院提供的 T u M V的抗血清和英国蔬菜试验站提供的 T u M V的抗血清发生相同的沉淀
反应 。 在 IS E M检测过程中 , 样品以 T u M V 抗血清处理后可见到数量比其他抗血清处理要 多
15 一 20 倍的病毒粒体 , 证 明这些病害确为 T u M V 所引起 。 以修饰法处理后的病毒粒体表面 ,
也吸附有很 多 抗 体 颗粒 , 再次表明其病毒为 T u M V 。
( 四 ) 病毒的提纯 为提高病毒的产量 , 比较了以不 同植物作为繁殖寄主体内病毒含量
的差异 , 证明以芜菩为最高 , 其次为克氏烟 , 而 蚕豆叶含量较低 。 提取缓冲液的种类和酸度
值的不 同 , 对萃取病毒的影响不明显 , 但加有。 , 1肠 T r iot o x 一 1 0 0的提取浪中 , 病毒浓度可
, 一
许志纲等 : 侵染蚕互 的芜著花叶病毒的鉴定与提纯 1 7 弓一一 - — 一 ~ 一 一一一一- ~— 一一一一 -一一—— — 一一 一 一—
图1 T U MV 在蚕豆叶上的红褐色环斑
图 2 T uV M在蚕豆叶上的苍白色斑驳
图 3T uV M在蚕豆荚上的红褐色斑块 (左 面两荚为病英 , 右方为健芙)
田 4 经免疫吸附处理后的 T o MV 的电镜照片
l一
1 76 廷霞 物 病 理 学 报
明显增加 ; 在沉淀植物蛋白质的处理 中 , 氯仿的效果比正丁醇为好 。 病毒的精提纯是在蔗糖
密度梯度济液 中完成的 , 常规的梯度济液制备比 较麻烦 , 找们采少11冻融法制务蔗糖的梯度济
液 , 手续简便 , 离心后病毒存在的部位 与常规梯度液的部位相同 , 收率也相 同 。 从蔗糖密度
梯度离心液中取 出的病毒组分 ( 区带 ) , 经稀释后再次超速 离 心 ( 3 0 . 0 0 转 /分 , 于小日.],
1 5
’
C ) 得病毒纯 品沉淀 。 ( 19 8 6年 3月 3 1 1一 1 1仪稿 )
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ID E N T IF ! C A T 10 N A N D P U R IF ! C A T ! O N OF T U R N ! P M O SA IC V! R U S
N A T U R AL L Y IN F E C T E D O N B RO A D B E A N ( V i c 艺a j a b a L )
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( N a o j i。 g 月口: ` . U n 。` e r : i t夕 )
A l a n J
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C o e k b a i n
( R o才h a , , ; 、才e d E 戈几 S r a t f o n , E n g l a n d )
T h i r t y t w o s a m p l e s w e r o e o l l e e t e d f r o m S i e h u a n
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t e m i e m o s a i e s y m p t o m s o n B r a : 、 f c a r a 尸a , a n d N f e o t`a n a e l e ” e l a o d “ . S e v e r a l
a n t i s e r a o f P V Y g r o u p h a v e b e c n u s e d i n s e r o l o g i e a l t e s t
, s u e h a s t h e a n t i s e r u n :
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油桐黑果病初报
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哀嗣令 孙福 生 麻左力
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(林科院林 研所 ) (林科院 电镜室 )
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n s t it ut e of Fe so rt ry L
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.of E le e t r o i mc re e :op y A e a de oy of S e ie n e e )
桐油为我国传统 出口物资 , 二次大战前我国桐油占领国际市场 , 近年来出口锐减 , 除国
外竞争原因外 , 病害问题成为生产中突出因素 。 四川桐油主产区涪陵专区油桐黑果病近年 日
趋严重 , 许多乡区造成绝产 , 对农民经济收入引起重大损失 。 该地区因交通闭塞 , 迄未报导
病株都是 4年生 以上盛果期 3年桐 A l e ur it e : f。 dr i H e m sl 。 病树开花后 , 幼 果 发 育 弛
缓 , 大小仅为健果 1/ 3 . 病果表面 凹凸不平 , 呈炭黑色 。 子房分室不清 , 无成形种子 。 病 株
整株无一健果 , 病果悬在树上成僵果 , 越冬不落 。 病树花芽及病果柄皮层固定在2 . 5肠 戊 二
醛 , 经常规脱水 , 包埋 , 超薄切片 , 经菲立浦 4 0 一 T型电镜观察 , 得下列结果 ( 见图 )
. 卜 .
. 曰卜
闪 电勺甩 r 俐脚盆白U 一 `~ 1平矗 ` O U v 。 、邢 二节勺 , J义 J云 梦 Jn 沙
“ 9 8 6年8月 2 1日收祷)