全 文 ：中国油料 1 9 9 4年第 1 6卷 第 1 期
甘蓝型油菜芜著花叶病毒分离物 Tu M v H,
的生物学研究 ’
陈集双 张耀洲 徐平 李德葆
(浙江农业大学生物技术研究所 )
提要 采自杭州甘蓝型油菜上的芜蔷花叶病毒分离物 T u M v H , ,经寄主反应测定 ,不侵染茄
科普通烟和心叶烟 ,对多数供试甘蓝型油菜和十字花科蔬菜品种 (品系 )有强的致病力 。枯斑指示
植物检测和 E IL s A 检测 ,选择城青 2号大白菜作为毒原繁殖寄主 ,提纯病毒的得率为 6一 7m g 病毒
/ 1 0 0 9 鲜病叶 ,用提纯病毒制备的兔抗血清经环状沉淀反应测得其效价为 1 / 2 0 00 ,免疫电镜观
察 , T u M v H ,与同源抗血清有强的阳性反应 ,与另一个芜著花叶病毒抗血清亦有阳性反应。提纯病
毒经蛋白酶 K 处理 ,酚 :氯仿抽提后在琼脂糖凝胶电泳中测定其 R N A 分子量约为 9 . 4kb 。在接种
T u M V H
;
3 0天的城青 2号大白菜和甘蓝型油菜的植株细胞中观察到分散的线状病毒粒子和典型的
风轮状内含体 。 T u M v H I风轮状内含体的结构介于 E d w a r d s on 等所描述的亚型和 vI 型之间 。
关键词 芜蔷花叶病毒 ;血清学 ; R N A ;组织病变 ;提纯
芜首花叶病毒 (T u M v )是侵染十字花科蔬菜和油菜的一类重要病原 。该病毒在世界范 围
内有广泛 的自然分布 。 除侵染十字花科外 , T u M v 还在豆科 、 姜科 , 芸香科 、 毛蓑科及莺尾科上
引起典型病害 lj[ 。在我国 , 大 白菜孤丁病 、 萝 卜花叶病 、 芜著花叶病 、 榨菜缩叶病 、豌豆花叶病 、
芝麻矮化病等均是 以 T u M v 单独侵染或 T u M v 和其它病毒复合侵染所致〔 2一 s] 。
T u M V 属于马铃 薯 Y 病毒组 (洲匆 。 二 。 se 、 ) ,在 自然界中可通过数十种蚜虫以非持久性方
式传播 , 易经汁液接种传播 , 病毒粒子线形 , 长约 7 2阮韶 ’ 〕。在 T u M v 感染的植物细胞 中产生
典型的风轮状 内含体困 。最近发表的 T u M v 基因组全序列资料表明 : 该病毒正链 R N A 有 9 8 3 0
个核昔酸只翻译产生一个分子量为 3 58 K D 的多肤 。 该多肤经 自身剪切和加工最终形成 8个功
能蛋 白 。 T u M v 基因组结构与几个已经报道的 尸 ot y 。 : : 。 se 。 基本相似川 。 T u M v 本身具有 广泛
的变异类群 ,利用鉴别寄主来划分其株系的努力一直没有取得满意的结果 。 裘维蕃等〔’ 〕 、 范怀
忠 [3 〕 、 P r o v v i d e n t i二吕〕 、 刘栩平等 [ 9〕均探宗了各 自的株系划分标准 。 T u M v 的变异类型复杂可能
与其分布范围广有关 。
油菜花叶病是 长江流域冬油菜生产上 的一个突出问题 , 造成严重 的产量损失〔 ’ 。〕 , 李德
葆 〔“ 〕、 王拱辰仁” 〕李丽丽 〔`〕等分别报道认为 T u M v 是该地区 , 尤其是浙江省油菜花叶病的主要
病原 ,而油菜 T u M v 本身又存在明显的生物学变异类群 。
以构建甘蓝型油菜抗芜著花 叶病毒基因工程植株为最终 目标 ,我们 自 1 9 91 年起再次对浙
江省部分地区甘蓝型油菜上的病原病毒进行 了分离鉴定 ,并选用致病力较强 的一个病毒分离
物作为病源开展病毒与寄主相互关 系及该病毒分离物基本生物学特性研究 。
材料与方法
(一 )毒源
芜著花叶病毒分离物 T u M v H 、于 19 91 年 2月分离 自浙江农业大学实验农场甘蓝型油菜病
浙江省委八五攻关课题 。浙江农业大学生物所洪健 、 钟静萍 、 陈雄风 、 李世君 、 盛方镜 、 许建平等参加了部分工作 。
中国油料 1 9 9 4 年第 1 6卷 第 1期
株 ,毒原在昆诺黎上 2次单斑纯化后 ,保存于城青二号白菜上 。
(二 )寄主反应测定
按常规汁液磨擦接种方法进行 〔` 3〕。
(三 )接种植物中 T u M v 相对浓度的测定
1
. 枯斑指示植物检浏 取接种毒源相同时间 (常温下 20 一 25 天 ) 的接种 叶片和新生叶 ,经
汁液磨擦接种昆诺葵 g一 10 叶片 ,观察 、 计算平均枯斑数作为病毒的相对浓度 。
2
.
E LI s A 检浏 采用 间接 E LI s A 方法 〔` 3〕 , 等量待检病叶经磷酸缓冲液研磨后稀释 2倍直
接包被酶标板 ( 40 孔 ) , 以健康的叶片作为阴性对照 , T u M v 抗血清 (T u M v 一A s , 由浙江农科院
病毒中心林瑞芬研究员提供 )用生理盐水稀释 40 倍 ,然后用辣根过氧化物酶标记 A 蛋 白一邻
苯二胺方法检则 ,确定相对病毒浓度 。
(四 )病毒提纯和病毒粒子形态观察
根据接种植物中 T u M v 相对浓度测定的结果选择毒源繁殖寄主 , 病毒提纯参照 IH S a s hi
大豆花叶病毒提纯方法 1[ `〕进行修改 。 取新鲜病 叶 (未表现明显症状 ) 2 0 0克置一 20 C 冰冻 20 分
钟 , 加入 2 0 0m l p H 7 . 4的 0 . sm o l 磷 酸缓 冲液 (含 0 . 1%琉基 乙醇 、 2% T r i t o n x 一 2 0 0 , 0 . o l m o l
E D T A )
,匀浆 1一 2分钟 ,加入 10 %氯仿 : 正丁醇 ( l : 1 ) , 匀浆 2分钟 ,双层纱布过滤 ,置 4 C 下 20 分
钟 。 4 ,C 下 8 0 0 09 离心 2 0分钟取上清 ,加 4% P E o 6 0 0 o , 0 . l m o l N a e l , 于 4 C下沉淀 3小时 , 5 0 0 0 9
离心 2 0分钟 , 弃上清 ,沉淀再用 0 . 0 2m o l 磷酸缓冲液 ( p H 7 . 4 , 含 0 . o zm o l E D T A 、 l % T r i t o n x -
1 0 0 ) 充分 悬浮后 , 5 0 0 0 8 离心 1 0分钟取上清 。 4℃下 7 5 0 0 0 9 离 心 1 0 0分钟 , 沉淀用 0 . o Zm o l P B
( p H 7
.
0 )充分悬浮 , 8 0 0 09 离心 1 0分钟 ,取上清 , 再经 5%和 4 0%甘油梯度 7 8 0 0 09 离心 12 0分钟 ,
病毒最终悬浮于 5m l 左右双蒸水中 。 提纯病毒 (或病株汁液 )按常规方法经 1%磷钨酸或 1%醋
酸铀负染后置电镜下观察病毒粒子形态 。
(五 )抗血清制备和血清学反应测定
1
. 杭血清制备 纯化病毒与 rF e un d ` s 不完全佐剂充分乳化后于家兔背部 2 4一 26 点皮内
注射 ,每只公免注射 1 . om g 病毒 (约 1 . 5m l 乳化抗原 )作为初次免疫 , 4周后用同样方法引入约
0
.
s m g 病毒 , 3周后用 0 . Zm g 病毒 (悬浮于 0 . 4m l 生理盐水 中 , 作为可溶性抗原进行耳静脉注
射 , 10 天后采血 、 收集抗血清 。抗血清效价测定按常规小试管环状沉淀反应方法川 。
2
. 血清学反应浏定 采用改 良的 D e r r i ck ` s 方法进行免疫修饰〔’习 。 阴性对照用免疫前兔
血清 , 阳性对照用已知 T u M v (粗提纯 ) 。
(六 )病毒 R N A 的提取和分子量测定
提纯病毒在 37 ℃下经 50 o s/ m l 蛋白酶 K (美 国 sI G M A 公司 )水解 30 分钟 ,然后经酚 : 氯仿
抽提 ,酒精沉淀 , 在含有 E B 的 1%琼脂糖凝胶上 电泳 2 一 3小时〔“ 〕紫外灯下观察 。 R N A 标准分
子量为 0 . 2 4一 9 . 4 9 K b (美国 B R L 公司 ) 。
(七 )组织病变观察
甘蓝型油菜 79 一 6 01 和城青二号大 白菜接种芜著花叶病毒 7一 30 天后 ,分别采取祥品 , 然后
用戊二醛 (含多聚甲醛 )一俄酸双固定 , E P on 8 1 2 ( A : B ~ 1 : 6) 包埋 。超薄切片用醋酸铀和柠檬
酸铅双染色后 ,置电镜下检查组织病变情况 〔` ’ 〕 , 以同龄健康叶片作为对照 。
结果与分析
(一 )寄主反应与症状
田间自然感病的甘蓝型油菜 (浙油 6 0 1) 表现为系统花叶和 叶脉坏死 , 植株矮化 。 汁液磨擦
中国油料 19 9 4 年 第6 1卷 第 1期
接种分离到的毒原能侵染甘蓝型油菜等十字花科植物 ,表现系统症状 ,并在昆诺葵上为局部枯
斑 。 毒原经昆诺黎 2次单斑纯化获得的病毒分离物 T u M v H ,在 g科 28 种植物上 的反应和接种植
株中相对病毒浓度如表 1 。
表 1 T u M v H ,在测试寄主上的反应
寄 主 植 物
科 名 种 名
枯斑寄主检测
病毒浓度 ( 2 0天 )
E L IS 人 检 测
病毒浓度 ( 2 0天 )
寄主反应
葬科 昆诺要 c 而e : 即 “ : : 二 。 : : 。 oa s N
觅色蔡 C . a , a , a : t `co z , S N
茄科 蔓陀罗 D a 。` , 。 吕 , 。 。 o : 。。 二 0
心叶烟 N 比“ 二 : a 夕l : ` : : 0 . 0 一 一
黄苗愉 N . “ 加 。 二 0 _
三生烟 N . t a b a 韶二 0
黄花烟 N . , 。币 ca o
德烟 N . 才eb : 叩 ` O
克里芙兰烟 N . cl o el 。 廿: ` S N + + + + +
暇酸浆 N ` e a : d , a p 介, 二 z“ e s L N / ( L n )
洋酸浆 N . lj , 讨 。 L N
番茄 L y e o伴 r s i e o n 。 s e u l o n t u m o
矮牵牛 p e t u n认 h y b r i d a 丫 s
豆科 虹豆 价夕 : 。 , . 瓦。 O
’ 菜豆 p 无。 , 0 12。 。 t, o z; 。 , ;。 o
蚕豆 犷 `e必 f 。如 0
葫芦科 黄瓜 c : 。 , ` , ao t `。 。 。 o
觅科 千 日红 G o , p h , e , 。 夕 l 。如 、 o
鸡冠花 C e l o。 , ,“ a ot L N
玄参科 金鱼草 滩 , t`。 而: , : 二 二 。 洲 。 Y s
菊科 翠菊 e a zz i晚 p 为。 ; 。介: : , , : o
瓜叶菊 S , e。 。 : 。 t。 , 0
番杏科 番杏 少 e t , a ; 。 , : 。 。二 r 。 。二 L N
十字花科 城青 2号白菜 价 。 , co p 。肠。 。 。 。 s y s . s一 s M 十 + + 十 + + + +
早熟 5号白菜 价 。 , ca 那 ik : 朋砌 s 一 M。 + (+ ) + +
小白菜 刀 . 成 ; : 。 , 。 Y s , s N , e + ( + )
6 0 1油菜 B . : a 矛: 5 s M , s N , e + + + 上上 +
79一 6 0 5油菜 刀 . : a 尹 : 。 v e , s M + 十
78一 2 5 1油菜 刀一 a 尸 “ s 子万。 、 、 一 )
w a t e r s 油菜 B . : 。尸。 。 s M 一 十 ` 十 少 一 ( + )
白菜型油菜 刀 . 砧 : , e , , ; s M , e , s t 、 一 + + +
油青菜 刀 . 动 : , e , 反 , s M , v e , s N , D + + + + +
榨菜 刀 . J。 。 。 a s M , e + + +
花挪菜 刀 . o lo a ce a V a , . 乙o t斗 t ; 5 v e , n + ( + )
浙大长萝 卜 凡a 声九a , 。 。 二 t : : 。 。 s M . s N + + + + + + + +
注 : L N : 部斑 沼N : 系统环死 , O : 不浸染 ; L D : 落叶 ; Y s : 局部黄斑 洛Y s : 系统黄斑 ; s M : 花叶 ; s 一 s M : 轻花叶 ;
S 一 M 。 : 轻斑驳 ; c : 皱缩 . v c : 明脉 ; st : 矮 化 ; D :发 僵
“
+
”表示相对病毒浓度 ; “ 一 ” 无
T u M v H
;对大多数供试十字花科蔬菜和油菜品种 (品系 )均有较强的致病力 , 但在 78 一 2 51 油
菜品系和早熟 5号大白菜品种上 只表现轻斑驳症状 , 用昆诺黎作为枯斑指示植物和 E IL S A 检
测接种植株中病毒相对浓度的结果显示 , T u M v H ,在这两个品种 ( 品系 ) 中含量较低 , 而在城
青 2号大 白菜 、 浙大长萝 卜和小白莱上的浓度为最高 。 T u M v H ,不侵染茄科普通烟的数个品种
中国油料 1 9 9 4年 第 16 卷 第 1期
及心叶烟 ,似与一般 T u M v 株系不同 。
(二 )病毒的提纯
选用发病程度中等 , 但病毒浓度较高的城青 2号大 白菜作为毒原繁殖 寄主 , 常温下接种 20
天左右 ,取新鲜病叶提取病毒 ,得率为 6一 7m g 病毒 / 1 0 0 9 鲜病叶 。提纯病毒经磷钨酸 负染 , 在
电镜下可观察到完整 、均一 的病毒粒子并能分辨其外壳蛋白亚基结构 (封三 图 I A ) 。 经多次病
毒提纯结果比较 , 表明这一方法重复性好 。
(三 )抗血清制备和血清学反应
T u M v H
,提纯病毒免疫家兔获得的抗血清经小试管环状沉淀反应测定 , 其效价为 1 / 2 0 ,
0 0 0
。 用免疫修饰 (1 s E M 一 D e c o r at i o n) 电镜观察测定其对同源病毒有强的修饰反应 。 另一 已知
T u M v 抗血清 ( A s 一T u M v )亦能吸附 T u M v H ,病毒粒子且对其进行修饰 ,但病毒吸附量和修
饰强度不如同源抗血清 (封三图 B 、 C ) 。
(四 ) T u M v H l的 R N A 分子量
T u M v H
,总 R N A 的琼脂凝胶 电泳分析结果表明 ,用酚 /氯仿抽提的 T u M v H l为单一组
分 ,其分子量约为 9 . 奴 b 。这一结果说明以上抽提核酸的方法未导致 R N A 明显降解 。
(五 )叶片病变组织的观察
T u M v H
l接种后 7天 、 10 天 、 15 天的城青 2号白菜和 60 1油菜 ,经汁液负染虽然能检查到大
量线状病毒粒子 ,但在叶肉细胞超薄切片中难 以观察到风轮状 内含体 。在接种 30 天后的植株叶
肉细胞质中观察到分散的线状病毒粒子和风轮状内含体 , T u M v 的风轮状内含体具有典型的
片层 状聚 集结构 ( l a m i n a t e d a g g r e g a t i。 n ) , 部分 风轮 状 “ 臂 ” ( p l a t e ) 卷 曲成 卷筒状 ( t u b u z a r
s cr o l
一
1jk
。 ) 。 T u M v H ,的风轮状 “ 臂 ” 在 8个 以上 、 片层状聚集体比较短而且不弯曲 , 这是该病
毒分离物风轮状内含体的突出特征 (封三图 2 ) 。病毒粒子和风轮状内含体似不存在于 同一细咆
质区域 。
讨 论
本文所报道的病毒分离物 T u M v H l与 我们六十年代 划分 的 1 型 〔川 、 王拱辰 的 T p M v
9 8〔” 〕以及李丽丽的 c R Z株系 〔` 〕相似 ,该分离物对十字花科寄主有强的致病力 。
E d w a r d s
o n 等曾将 P o t y v i r u s e s 的风轮状 内含体分为 4个型 , T u M v 大多数供试株系 (分
离物 ) 皆为典型的 l 型川 , 即在横切面上同时具有风轮状 、 卷筒状和片层状聚集的结构 , T u M v
的风轮状臂比较小 、片层状聚集结构比较长〔 ’ 〕。本文的结果显示 : T u M v H ,具有较多的风轮状
臂 、 较短但不形成明显弯曲的片层状聚集结构 。根据这些特点 , T u M v H l的风轮状内含体似介
干 E d w ar d s o n 等所划分的 l 型和 vI 型之间 。
T u M v 提纯的效果一直不够理想 l[, ’ 〕 。要获得大量完整的 、 纯化的线状病毒粒子 , 选择适
当的繁殖寄主和根据病毒特点确定提纯程序显然是重要的 。 线状病毒在经过 P E G 沉淀和超速
离心 沉淀后 的悬浮过 程中损失很大 , 而在这 些步 骤中充分悬浮尤为重要 l[ ` 〕。 本文所采 用的
T u M v 提纯方法的多次重复结果表明 ,提纯病毒经电镜病毒粒子检查和核酸抽提和分子量测
定 ,均获得稳定 的结果 ,所制备的病毒抗血清有较高的效价 , 免疫电镜检查 ,对其同源病毒表现
较高的特异性 。 为进一步进行 。 D N A 文库的构建和对克隆基因的检测 、 基因表达产物的鉴定
提供了条件 。 关于此分离物的基因克隆和植物表达载体的构建工作正在进行之中 。
中国油料 19 9 4年第 1 6卷 第 1 期 28
参 考 文 献
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o
w e d h i g h P a t h o g
e n i e i t y t o m o s t v a r i e t i e s o f
e : u e汀 e : o u s e r o P s t e s t e d . T h e v i r u s e o n e e n t r a -
t i o n i n t h e i n o e u l a t e d P l a n t s w a s d e t e c t e d b y l o e a l l e s i o n t e s t a n d E L I S A
·
A v a r i e t y o f B
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尹 e k ` n e 。 砚 s ( C H E N Q IN Z ) w a s s e l e e t e d a s t h e P r OP a g a t in g h o s t f o r P u r i f i e a t i o n
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A m o d i f i e d
p u r i f i e a t io n s e h e d u xe w a s d e v e l o p e d w h i e h y i e l d e d 6一 7m g v i r io n 八 0 0 5 f r e s h l e a v e s . A r a b b i t
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,
w i t h t h e t i t e r o f l / 2 0
,
0 0 0 ( r i n g p r e e i p i t a t i o n t e s t )
.
T h i s a n t i
-
s e r u m h a d h i g h s P e e i f i e i t y w i t h T u M V H
z b y im m u n o
一
d e e o r a t i o n i n e o m P a r i n g w i t h a n t i
-
s e r u m a g a i n s t a n o t h e r T u M V i s o l a t e
·
T o t a l R N A o f T u M V H
z
w a s s u e e e s s f u l l y e x t r a e t e d
f r o m P u r i f i e a t io n o f t h i s v i r u s
,
t h e m o l e e u la r w e ig h t w a s a b o u t 9
.
4k b w h e n t e s t e d u n d e r a
-
g a r o s e e l e e t r o P h o r e s i s
·
P i n w h e e l i n e lu s i o n b o d i e s w i t h P l a t e n u m b e r o v e r e i g h t a n d s h o r t
la m i n a t e d a g g r e g a t e s a n d s e r o l l
一
l i k e s t r u e t u r a l s w e r e
o b s e r v e d in in f e e t e d e e l l s
o
f B
.
n a P u s
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·
P e k
乙n e n 乳 s · T h e t y P e o f P i n w h e e l in e l u s i o n b o d ie s w a s e o n s id e r e d b e t w e e n S u b d i v i -
5 i o n 111 a n d S u b d i v is i o n I V t h a t d e s cr i b e d b y E d w a r d e s o n e t a l
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S e a t t e r e d v i r u s P a r t i e l e s
w e r e a l s o o b s e r v e d i n e y t o P l a s m o f i n f e e t e d e e l l s
·
K e y w o r d s T u r n i P m o s a i e v i r u s ; P u r i f i e a t i o n ; S e r o l o g y ; R N A ; C y t o P a t h o l o g y