全 文 ：第13 卷
1 9 3 8
第 2期
年 6月
植 物 病 理 学 报
A C TA P HY TO PA T HO LO CI GA S I NCI A
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2
J
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芜普花叶病毒一崇明大白菜
分 离 株 的 鉴 定
压亘 !牛宏舜 黄素珍 郑 礼 王鸣歧
(复旦大学生物系植物病毒研究室 )
蔡同润 杨仁根
(复旦 友学生物系中心试验室 )
公
摘 要
从崇明大白菜 ( B ra s s i c a Pe k f ne n :`s ) 上分离到一 种 病 毒 , 经鉴别寄主测
定 , 在青菜 ( B . c h`n e n s i s ) 、 芜普 ( B . r a P a ) 上为系统花叶 , 千红 日 ( G o 。 -
p h r e o a g l o b
a ; a )
、 览色蔡 ( C I: e n o P o d i u m a o a r a o t i c o l o r ) 上为局斑 , 不侵染
心叶烟 ( N i c o t i a o a g lu * i o o s a ) 、 黄苗榆 ( N J a b a e u 。 ) 、 黄 瓜 ( C o c o m f : s a -
it 。 “ : ) 。 电镜下 , 病叶组 织细胞 内观察到风轮状内含体 , 病叶浸渍液和纯化的
病毒制剂中都可见到均一 的线状粒体 , 长 6 60 ~ 74 0 n m , 宽 1 , . 5~ 15 n m 。 对流
免疫电泳和琼脂扩散试验 , 病毒与其抗血清产生专一 的沉淀线 。 温度钝化 点为
5 5 ~ 65 ℃ , 稀释终点 1-0 3 , 体外保毒期 2 ~ 3 天 。 经 聚丙烯酸胺凝胶电泳和氨
墓酸自动分析仪分别测得该病毒的衣壳蛋 白亚 墓分子量为 2 5 , 0 0 0 , 氨基酸残篆
数2 2 6个。 鉴定结果认为它为芜普花叶病毒崇明分离株 ( T u M V c . M ) 。
添 芜苦花叶病毒是侵染大白菜
、 青菜 、 油莱 ( B . an Pel la ) 等十字花科杭物的 爪 要 病
毒 。 自 1 9 2 1年 G a r d n e r & K e n d r i e k和 S e h n l t z发现芜普花叶病毒以 来 , 国内外有关这
方面的报道颇多 , 但均停留于生物学的诊断鉴定上 。 有关它的株系 , 说法亦颇不一致 。
对其研究进展缓慢。 究其原因是长期来未能完满解决在提纯过程中病毒的集聚现象 , 难
以得到理想的得率。 直至近十年来 , 由于对它的提纯方法的改进和分 子生物学的发展 ,
才逐渐深入到病毒蛋白和核酸的研究领域 。
1 9 8 0年 , 作者从上海崇明县大白莱上分离到芜苦花叶病雌的一个分离物 , 并对它进
行了鉴定 , 其中包括生物学方法 、 血清学方法 、 病毒检体的形态观察和汁液 稳 定 性 测
定 。 在此墓础上测定了该病毒的衣壳蛋白亚基的分子量及其氨基酸组分 。 木文是报道这
方而的研究结果 。
一 、 实验方法和结果
( 一 ) 生物学鉴定
1
。 毒源 : 采 自崇明县菜区大白菜病株。
实无烟草花叶病毒 ( T M V ) 、 黄瓜花叶病毒
经数种鉴别寄主测试和浸 出法电镜观察证
( C M V ) 复合感染 , 用无毒桃蚜 ( M y : u s
2 2植 物 病 理 学 报 13 卷
pes vi
c a e
) 单蚜单株接种于青莱 , 作为纯花毒源保存 。
2
. 传摇方式 : 试验证实该病毒易经桃蚜 、 菜级管 蚜 ( R h o P a l o s i P h u m 夕; e a d o b r a -
: : ` c a e ) 等蚜虫传播 。 未发现土壤和种子传播。 汁液接种易成功。
3
. 寄主反应 : 供试寄主有心叶烟 、 胜利油菜 、芜普 、 甘蓝 (B . ol er ac eQ ) 、 紫罗兰 (M a -
t th i o l
a i n c a n a )
、 萝 卜( R a p h a n u s : a * i。哪 ) 、蓬 篙 ( C h r y s a n th e 。 “ 切 s p a t f o s u m )等三十余种 ,
测定寄主为芜色葬 ,繁殖寄主为青菜 (五月慢 ) 。在诊断寄主上的应反详见图 1 , 表 1 。
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表 1 T u M V c 。 M 。 在不 同寄主上的症状
】, , … 。 。 。 主…· ! 二`一几: 二,`一 } 不 , 染…’
芜 井 { 系统花叶 , 后期
1
二一。霖·素黑, s二 _…不 , 染B . r a P a }叶上常出现祸色纹l状斑甘 蓝 …不 , 染 黄 苗 愉 …不 , 染B 。 o l’ r a e e a N 。 to bo e . 沉花 娜 菜 不 畏 染 黄 花 烟 …不 , 染B . o l e r a e e a V ar . b o f r少 t` s N 。 r u` t` e a羽毛甘蓝 不 畏 染 三生一 N N烟 …不 , 染B . o l e r a e e a V a r 。 a e e P h a l a . N 。 ta b a e . 附 V a r 。 S a衍 s。” N N 。
平顶甘蓝 不 任 染 番 茄 不 畏 染
B
. 0 1即 o c即 V a r . c a P` ta * a - C夕 c o P e r s` c “ 明 ` : e u l e . t u用 不 仅 染
黄种包心菜 不 俊 染 很 成 浆
B
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e a b玄t a t a N i e o ” d r a p人少 s o l o d e s
胜利油菜 系统花叶 洋 酸 浆 系统花叶
B
. ” a P e l l。 P h夕` a li s f lo r i d a爪 a
圆白萝 卜R a P h a . “ 5 s a t公口 u s 不 , 染 蔓 陀 萝 不 任 染
D o t
v r a ` . e r明 i名
长白萝 卜 不 , 染 …攀 觅 色 落R . s a t玄口 . 5 。 科 C h翻 o p o d` u价 a m a r a . t` e o l o r 局部枯斑紫 罗 兰 不 , 染 … 昆诺阿攀 局部枯斑 , 后M o t t h io l a i” c a ” 。 C . q “ `. ao 发展 成系统崎形桂 竹 香 不 , 染 … 灰 镇 局部枯斑C人e f r a” t h“ 5 e h e f r` C 。 a l b“ 价 。葫 黄 瓜 不 , 染 … 小 落 局部枯斑 , 后芦 C “ c u 用 15 S a t f。 “ ` C 。 s e f o t .` u杭 。 发展成系统嘴形科
车 长叶车前 菠 莱 不 俊 染前 P l a ” t口夕 0 la ” c . o la t。 不 , 染
}… S刀 i . a c ` a o l e r a e e a科览 千 日 红 局 , 枯斑 …旋 大花牵牛 不 佼 染科 G o价 P h r e . a 夕 l o b a s。 花 P h a r b i t i s s P .科玄 金 鱼 草 , 统花叶 …}… …鑫 A . t i r r h` . “ 杭 脚 a i “ s科菊 百 日 菊 不 , ” }{ }科 Z`二 i a e l e g a ” s羞 茜 不 , 染 1… …C h r y 忿 a . t h翻口 u爪 S p a t` o s u协
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, 期 徐 来升 }等 : 芜 青花叶病毒— 崇明大自菜 分离 眯的研究
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李 图 1
a 。觅色黎 b。 青莱
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。 小蔡 i。 洋胶浆
T u M V c M在不 同寄主上的症状表现
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.大 白菜 d . 1任!菜 e . ;己浑 f . 昨ti鹅 9 . 千 [ I红
奋
图 2 . 感染 T u M V .c M的青莱表 图 3 . 感染 T u M V .c M的青莱病叶超薄切片 ,
皮细胞中的内含体 .N 核 卜内含体 示风输状内含休 ( PW ) 标尺 长 s o on m
病 理 学 报 1 3卷
户
滚玻
蛋白质
病毒
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吸孜位
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图 5
,幼 肠 0 .翻 , , 面波 长 品 )
纯化 ’ f u M V C . M制剂 中
病毒粗休的形 态 ( 磷钨酸负染 )
标尺长 2 0 o n m
图 4 . T u M V c . M的紫外吸收 曲线
甲
质牡数
质杀主食 (” . ,
今
图 6 T u M V c . M 病毒杜体长度分布图
拉体 长度 ( n m 、
图 7 大 白莱病叶浸 出法 (磷钨 酸负染 )
电镜 叭片示线状病毒粒休 、 标 尺 长 2的川 1
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由表 l 看出 : 该病毒在青菜 、 油菜 、 芜著等十字花科寄主 _ L为系统花叶 ; 千日红 、
觅色蔡和灰黎 ( C . al bu m ) 上局部病斑 , 不侵染 心 叶烟 、 普 通 烟 、 黄 瓜 、 长 叶 车 前
( P l
a . t a g o l a n e e o l a t a )
。 因此它不可能是 T M V和 C M V 。
4
. 内含体观察 : 取具典型症状的病叶 , 撕表皮 , 置载玻片上 , 用 1 %焰红染色 3 ~
5 分钟 , 并用 1 %刚果红— 甲基绿复染 , 水洗后封片。 显微镜下可见蓝色的 、 结构致密的圆形细胞核 , 紫红色的近圆形 、 椭圆形或不定形 , 结构较松散 , 近于或大于细胞核
的内含体 , 有的在细胞核附近 ,有的离开细胞核 (图 2 ) 。 健叶表皮细胞中未发现内含休 。
取同样症状的病叶 , 切成宽 2 m m , 长 10 m m的细条 , 用戊二醛和饿酸固定 , 醋铀酸
染色 , 6 18 色埋剂色埋后作超薄切片 , 切片用醋酸铅复染。 电镜下 ,观察到细胞质内有马
铃薯 Y 病毒群病毒所特有的风轮状内含体 ( 图 3 ) 。
5
。 汁液德定性 : 以芡色黎作测定寄主 。 青莱病叶加 p H 7 。 0 , 0 。 I M磷酸缓冲液 ( l :
Z W / V ) 匀浆抽提 , 以其榨出液作原液。 测得温度钝化点为 5 ~ 65 ℃ , 稀释终点 10 ’ “ ,
体外存活期 2 ~ 3 天 ( 室温 ) 。
6
。 提纯 : 用崔璋京记述的方法〔 1 〕 , 并略经修改。 低温冰冻的青菜病叶 , 用 0 . 5 M磷
酸缓 冲液抽提 , T r i ot n一X 10 0净化 , 聚乙二醉 ( 分子量 6 , 0 0 ) 沉淀 , 经二次差速离心 ,
后再用蔗搪密度梯度离心 , 得纯化病毒制剂 。病毒得率约为 20 ~ 30 毫克 /公斤鲜重病叶 。
用经二次聚 乙二醇沉淀的病毒悬浮液回接大白菜幼苗 , 出现轻型花叶 , 回接青菜和
览色黎 , 分别出现与前相同的系统花叶和局部枯斑 。
7
. 病毒拉体特性 : 纯化病毒制剂经 B e c k m a n 35 型紫外分光光度计测定 , 呈典型的核
蛋白吸收曲线 ( 图 通 ) , 其 2 6 0 / 2 8 0比值为 1 . 2 5 。
纯化的病毒制剂经 40 %磷钨酸负染 , 电镜下可见大量略呈弯曲的线状粒休 ( 图 5 ) 。
测定 2 7 9个粒体 , 长度集中于 6 6 0一 7 4 o n m处 , 直径约 1 2 . 5一 1 5 n m ( 图 6 ) 。
在病叶浸 出制备样品中 , 同样见到与上述形态和大小一致的病毒粒休 ( 图 7 ) 。
( 二 ) 血清反应
该病毒的纯化制剂免疫兔子 , 所得抗血清 , 砂娜柑神 “少协 “ `且甘舫怂 ’ 八 ’ /2 0 4 8 。 用
A
.免庄电泳
上排孔 : T u M V c . M 抗血清
下 排孔 : 左 为青菜健株汁液
右为 T“ M V e . M 抗原
B
。 琼脂扩散试脸
1
、
2 孔 T u M V e . M 杭原
8
、
4 孔 T u M V一 Y 一: 分离株抗原
6
、
6 孔健株汁滚
中间 孔 T u M V C 叹 杭血济 。
图 8 T u M V c . M的免疚 电泳和凉脂扩散试脸
植 物 病 理 `
新鲜配制的 1 %琼脂糖作对流免疫电泳 , 产
生专一的沉淀线 ( 图 S A ) 。 琼脂双扩散试
脸表明该病毒 ( 图 8 B I 、 2 孔 ) 与其抗血
清所形成的沉淀线清浙 , 沉淀线间连接点钝
圆 , 其抗血清与芜普花叶病毒 y : : 分离株 〔 , 〕
( 图 8 B 3 、 4孔 ) 亦有沉淀线产生 , 但其
色较浅 , 较分散 , 并较接近原孔 , 与健株计
掖 ( 图 8 B S 、 6 孔 ) 不产生沉淀线 。 结果
说明该病毒和 T u M V一 Y : : 株之间有较密切
的亲缘关系。
( 三 ) 交叉保护试验
1
。 以 T u M V c . M接种青菜 ,待心叶出现一
症状后再接种 T u M V一Y : : 作 A 组 , T u M V
Y
: :直接接种健青菜作 B 组 。 待 2 ~ 3 周后 ,
A组青菜在重复接种 T u M V一 Y : : 的前后症
状无差别 , 而 B组青莱产生严重花 叶 。 将
A
、
B 二组病株分别接种心叶烟后 , A 组在心
表 2 T u M V .c M衣壳蛋白氛基酸纽分
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u M V P r o t e i n
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株烟上不差生症状 , 而 B 组在心叶烟上产生
系统花叶 , 故 T u M V .c M和 T u M V一Y : 2二毒株间有交叉保护作用。
图 9 T u M V c . M衣亮蛋 白的氮基酸 图语
: 期
{巫三 {等 : 芜。 叶病。一祟明大白。 。 的研究 2 7
2
.蛋白亚基氨酸组分分析 :
纯化病毒制剂甲醋酸处理 , 低速离心得上清液 , 经透检后再真空冰冻干燥制成病毒
蛋白千粉。
解离后的病毒衣壳蛋 白和核酸分别经 B e c k m a n3 5型紫外分光光度计测定 , 分别呈典
型蛋白 , 核酸紫外吸收曲线 ( 图 4 ) 。
蛋白干粉用D T N B法〔妞 〕测得蛋白亚基中含一个半胧氨酸 , 紫外吸收法〔 4 〕测得含 3
个色氛酸和 8 个酪氨酸 。 用对二甲氨基苯甲醛 ( D A B ) 法〔 3 〕作色氨酸验证测 定 ,所结得
果与紫外吸收法相等。
付气
鑫
精确称取蛋白 干 粉 , 加 5 . 7 . N H C I于
1 10 ℃中水解 24 小时 ,用 p H Z。 2 柠檬酸稀释 ,
样品经 L K B 4 4 0 0氨基酸自动分析仪测定 , 其
结果如表 2 , 图 9
( 四 ) 衣宪蛋 白的生化分析
1
。病毒制剂加十二烷基硫酸钠 ( S D S )
和琉基 乙醇 、 隔水加热后在含有 0 . 1% S D S的
5 %聚丙烯联胺凝胶中电泳 , 7 小时后可得
到一条区带。
用细胞色素 C ( a ) 、 胰蛋 白酶 ( b ) 、
胃蛋白酶 ( C ) 、 卵白蛋白 ( d ) 、 牛血清蛋
白 ( e ) 的 标准品作标准曲线 , 测得该病
蛋白亚墓分子量为 2 5 , 0 0 0 ( 图 10 ) 。
口母 0 6
图 1 0 蛋 白亚基分 子蚤
二 、 讨论和结论
从上海崇明大自菜上分离到一种病毒 , 能引起青菜 、 大白菜 、 油菜等十字花科植物
系统花叶 , 在千 日红 、 觅色葬上为局部病斑 , 不感染心叶烟 , 普通烟 、 黄瓜 , 能汁传和
蚜传 , 病叶细胞质中有风轮状内含休 、病毒粒休大小为 6 60 ~ 7 4 0 x 1 2 。 s n m 的细弯曲的线
状 , 经血清学 、 交叉保护试验和汁液稳定性测定 , 蛋白亚基氨基酸分析等 , 显示该病毒
属芜著花叶病毒。
有关芜著花叶病毒的株系问题 , 国外早在 30 ~ 40 年代就有不少报道 。 如W al k e r的廿
蓝 A 病毒 〔 6 〕、 T o m p ik sn 的甘蓝黑环〔们和紫罗兰重型花叶和轻型花 叶 〔” , L e B e a u的
T :
、
T
。 、
T
。 、
T 。〔 8 〕和 B e r k e l e y 的芜蓄花叶病毒 〔 ” 〕等。 这些毒株中有些都可侵染甘蓝 、
花椰菜 、 普通烟 、 心叶烟 、 紫罗兰 、 萝 卜, 有些仅能侵染其中的 2 ~ 3 种 , 而作者分离
的 T u M V对以上几种植物均不侵染 。
日本吉田甫曾把已报道的 56 个分离株 〔 1。〕根据在心叶烟和甘蓝上的症状表 现 而分为
普通株系和甘蓝株系 。 并把我国于 1 9 5 8年前报道 的 4 个毒株均归入普通株系 。 作者分离
的 T u M V 既不侵染甘蓝也不侵染心叶烟 , 所以它又不同于以上两个株系 。
与国内报道的分离株比较 , 作者的分离株与裘维蕃的大白菜孤丁一号 c1 `〕差异较大 ,
与魏景超的华东分离物 1 号〔 1幻亦有差异 , 而与范怀忠的广州分离物 2号 〔 1“ 〕 , 王拱辰的
2 8植 物 病 理 学 报 s l卷
油菜花叶 9 8〔 1 4〕较为相近 , 但范氏的分离物 2 号侵染萝 卜, 王氏的油菜花叶 98 侵染普通
烟 , 这与它们又不尽相同。
有关蛋自亚墓氮基酸组成 , 作者的分离株与H il 和 She p h e r d 的美国毒株 〔 1S 〕及崔璋
京的日本毒株〔 1 6〕比较如表 3 。
表 3 T u M V毒株之问衣壳蛋 白亚基氮基酸组份比较表
组羞映
组 份 …A :; IA yr l·晶lo y S I一 IG`y…H i·…`1· jL二…L y·…M一
1
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heP一卜.10
从表可知 , 作者的分离物氨基酸残基数和分子量均低于其他二毒株。 其 中 赖 氨 限
( L sy )
、 脯氨酸 ( P or ) 和丝氨酸 ( S e r ) 都和其他二毒株差异较大。 所以我们认为 ,
毒株的区别除寄主差异和血清反应等以外 , 蛋白使亚基的氨基酸组分和顺序 、 核酸的组
分和顺序的差异又从分子生物学水平上为鉴别不同毒株或分离株提供了重要依据。
根据以上讨论 , 我们认为从崇明大白菜上分离到的一种病毒为芜著花叶病毒崇明分
离株 ( T u M V e . M ) 。
S期 )…巫三…, : 芜青花叶。 一祟 明大白菜” 离“ 的研究
今 考 文 做
奋
奋
1
。 祖珠京等 日植病报 地 4 3 4 4 0~ 4 4 8 1 9 7 7
2
· 郑 礼等 复旦学报 执 8 19 8 2
8
。 洛家秀等 蛋白质化学研究技术 科学出版社 1 9 62 年版
4
。 汾家分等 蛋白质化学研究技术 科学出版社 1 9 7 1年版
6
。
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。 吉 田甫 日植病报 2 8 ( 4 ) 2 2 1~ 2 2 7 1, 6 3
1 1
。 裘 维蕃等 植物病理学报 8 ( i ) 3 1~ 4 5 1 , 5 7
1 2
。 魏 景超等 植物病理学报 4 ( : ) 9 4~ 1 12 1 0 5 7
1 3
。 范怀忠等 植物病理学报 3 ( 2 ) 1 5 5~ 1 6 5 1 9 5 7
1 4
。 王拱辰 徽生物学报 18 ( 4 ) 2 7 9~ 2 8 9 1 97 8
1 5
。
Jo iln H
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16
。 崔球京等 日植病报 V o 1 4 5 3 2~ 3 5 19 7 6
奉
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3 0植 物 病 理 学 报 1 3卷
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f o l l o w i n g : v a r i o u s s y m p t o m s i n d u e e d i n s e v e r a l d i a g n o s t i e s P e e i e s , a m o r -
Ph o u s a n d t h e p i n w h e e l i n e l u s i o n s s e e n w i t h b o th o p t i e a l m i e r o s e o p e a n d
e l e e t r o n m i e r o s e o p e
, a n d s t a b i l i t y o f t h e i n f e e t e d p l a n t s a p h e a t e d f o r 1 0
m i n
。 a t 5 5一 6 5℃ , D E P t o 1 0一 3 a n d t h e i n f e e t i v i t y a f t e r s t o r a g e f o r 3
d a y s a t 2 0℃ 。 A n t i s e r u m w i t h a t i t r e o f l / 2 0 4 8 ( t u b e p r e e i p i t i n t e s t ) h a s
b e e n o b t a i n e d b y i n t r a m u s e u l a r a n d i n t r a v e n o u s i n je e t i o n o f r a bb i t s
.
T h e s i z e o f t h
e f i l a m e n t p a r t i e l e s 15 6 6 0~ 7 4 0 X 12
。
5~ 15 n m i n p u r i f i e d
v i r u s P r e P a r a t i o n
。
T h e e a p s i d p r o t e i n o f T p M V e
.
M
.
m i g r a t e s a s a s i n g l e e o m p o n e n t i n
S D S一 p o ly a e y l a m id e g e l
.
I t s e l e e t r o p h o r e s i s m o l e e u l a r w e i g h t 15 a t a b o u t
2 5
,
0 0 0 a n d e o n s i s t s o f 2 2 6 a m i n o a e i d r e s i d u e s
。
T p M V e
.
M
.
15 d i f f e r e n t f r o tn m o s t s t r a i n s o f T p M V r e p o r t e d i n C h i n a
a n d a b r o a d
.
I t 15 a l s o d i f f e r e n t f r o m o t h e r t w o T p M V s t r a i n s i n U
。
S
。
A
。
a n d J a p a n b a s e d o n t h e a m i n o a e id a n a l y s i s a s w e l l a s o t h e r s
.
I t 15 e o n e l u d e d t h a t t h e C o n g一 M i n g C a b b e g e i s o l a t e 15 a n e w i s o l a t e
o f t u r n i p m o s a i e v i r u s
。
劝
分
2
,