全 文 ：多酚类物质是一类携带一个或多个羟基的芳香
环类植物化学物， 是植物体内的次级代谢产物， 广
泛分布于植物的皮、 根、 茎、 叶和果实中。 近年来
多酚类物质成为国内外食品及相关学科的研究热点
之一[1]， 植物类多酚的研究主要集中于构效关系与
生理活性作用机理、 新植物多酚资源的开发以及相
关生理活性研究等方面 [2]。 目前， 已有多种天然植
物多酚被开发成为食品添加剂或膳食补充剂 [3-4]。
茶多酚的主要抗癌活性组分 EGCG 已进入医学临
床实验[5-7]。
花红（Malus asiatica Nakai）又名林檎， 蔷薇科
苹果属乔木， 原产于东南亚， 目前广泛种植于中国
大部分山区 [8]。 花红品种很多， 是中国古老的水果
之一， 它皮薄肉脆、 汁多渣少、 味甜香浓， 果实、
根茎、 叶等均可入药， 是传统的药食两用植物 [9]。
但目前关于花红叶多酚的提取研究却鲜有报道。 本
研究以花红叶为原料， 考察乙醇浓度、 液料比、 提
取时间等因素对花红叶多酚提取率的影响， 然后采
用响应面法进行条件优化， 为进一步研究花红叶多
酚的生物活性及结构提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 将自然干燥的花红叶粉碎后，
过 80 目筛收集备用 ； 没食子酸标准品 、 Folin-
Ciocalteus pheone 试剂均购自 sigma-aldrich 公司；
其它均为分析纯级试剂。
1.1.2 仪器与设备 UV8000A 型紫外可见分光光
度计， WK1600A 型高速药物粉碎机， ZD-85 型气
欲恒温振荡器。
1.2 实验方法
1.2.1 标准曲线的制作 称取 30.5 mg 没食子酸，
用超纯水定容至 100 mL， 于 4 ℃储存备用； 分别
将储备液用超纯水稀释成为 12.2、 24.4、 36.6、
48.8、 61.0、 73.2、 85.4 mg/L 的没食子酸标准浓度
工作液[10]； 吸取 0.5 mL 标准浓度没食子酸工作液于
10 mL 试管中， 加入 0.5 mL 0.5 g/L 福林酚（Folin-
Ciocalteu）试剂并摇匀[11]， 反应 3~8 min； 加入1.5 mL
7.5％ Na2CO3溶液 [12]， 室温下避光放置 60 min； 用
10 mm 微量比色皿于 765 nm 波长下用分光光度计
测定吸光度[13]， 得关于吸光度 y 与没食子酸浓度 x
热带作物学报 2013， 34（8）： 1592-1597
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2013-04-15 修回日期 2013-06-04
基金项目 福建省科技重点项目（No. 2009I0019）； 集美大学潘金龙基金（No. ZC2010017）。
作者简介 史运杰（1984年—）， 男， 硕士研究生； 研究方向： 植物活性成分提取。 *通讯作者： 熊何健， E-mail： hjxiong@jmu.edu.cn。
响应面法优化花红叶多酚提取工艺的研究
史运杰， 何传波， 魏好程， 袁珊珊， 熊何健 *
集美大学生物工程学院， 福建厦门 361021
摘 要 研究花红叶多酚的最佳提取条件， 在单因素实验的基础上， 采用响应面法优化花红叶中多酚类物质的
提取条件。 结果表明： 花红叶多酚提取的最优工艺为： 提取液乙醇浓度 60％， 提取时间 60 min， 液料比 12 ∶ 1，
在此条件下花红叶多酚的提取率为 4.61％。
关键词 花红叶； 多酚提取； 单因素实验； 响应面分析
中图分类号 TS201.1 文献标志码 A
Optimization of Extraction of Polyphenol from Malus Asiatica
Nakai Leaves Using Response Surface Methodology
SHI Yunjie, HE Chuanbo, WEI Haocheng
YUAN Shanshan, XIONG Hejian
College of Biological Engineering, Jimei University, Xiamen, Fujian 361021, China
Abstract To study the effect of ethanol volume fraction， extraction time, liquid/material ratio and extraction times
on the extraction rate of polyphenol from Malus asiatica Nakai leaves， a response surface methodology was
designed in this paper. The optimal process parameters for total extraction of polyphenol from Malus asiatica Nakai
leaves were as follows： ethanol volume fraction was 60%， extraction time was 60 min， liquid/material ratio was
12 ∶ 1. The extraction rate of polyphenol from Malus asiatica Nakai leaves was 4.61%.
Key words Malus asiatica Nakai; Polyphenol extration; Single factor experiments; Response surface methodology
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2013.08.032
第 8 期 史运杰等： 响应面法优化花红叶多酚提取工艺的研究
的标准曲线： y=0.011 3x-0.010 1， R2=0.999 5。
1.2.2 多酚含量测定方法 称取 1.000 g 花红叶粉
末至 50 mL 塑料离心管中， 加入适量提取剂密封，
然后放入气浴恒温振荡器中， 沿离心管轴线方向来
回震动进行提取； 提取完成后以 4 000 r/min 离心
10 min， 取上清液（即多酚提取液）并定容至 100 mL
备用； 取多酚提取液适当稀释后， 按照 1.2.1 的方
法进行检测； 根据标准曲线计算花红叶多酚的没食
子酸当量。
1.2.3 单因素试验 以花红叶多酚提取率为指标，
研究乙醇浓度、 提取时间、 液料比及提取次数等因
素对提取率的影响规律。
（1）乙醇浓度对花红叶多酚提取率的影响。 分
别称取干燥的花红叶粉末 1.000 g 置于 50 mL 离心
管中， 按 10 ∶ 1 液料比分别加入体积分数为 0％、
20％、 40％、 60％、 80％的乙醇， 用摇床振摇 75 min，
按照 1.2.2 的方法计算多酚提取率， 分析乙醇浓度
对提取率的影响。
（2）提取时间对对花红叶多酚提取率的影响。
分别称取干燥的花红叶粉末 1.000 g 置于 50 mL 离
心管中， 并按 10 ∶ 1 的液料比加入 60％的乙醇溶
液 ， 分别用摇床振摇提取 15、 30、 45、 60、 75、
90 min， 计算多酚提取率， 分析提取时间对提取率
的影响。
（3）液料比对花红叶多酚提取率的影响。 分别
称取干燥的花红叶粉末 1.000 g 置于 50 mL 离心管
中， 设 3 ∶ 1、 6 ∶ 1、 9 ∶ 1、 12 ∶ 1、 15 ∶ 1 等 5 个液料
比， 分别加入 60％的乙醇溶液， 用摇床振摇提取
60 min， 计算多酚提取率， 分析液料比对提取率的
影响。
（4）提取次数对花红叶多酚提取率的影响。 固
定液料比为 12 ∶ 1， 提取时间为 60 min， 采用 60％
的乙醇对花红叶多酚进行多次提取， 计算花红叶多
酚的提取率， 并分析提取次数对花红叶多酚提取率
的影响。
1.2.4 响应面法优化试验 在单因素实验的基础
上 ， 采用中心组合实验 Box-Behnken 设计方案 ，
选取乙醇浓度（％）、 提取时间（min）、 液料比（mL/g）
为实验因素， 分别用 A、 B、 C 表示， 并以+1、 0、
-1 分别代表变量水平 ； 采用 Design Expert 7.1.3
软件设计 3 因素 3 水平试验方案 [14]； 应用响应曲面
分析法对实验结果进行分析， 确定因素之间的交互
作用对花红叶多酚得率的影响， 优化其工艺条件。
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果及分析
2.1.1 乙醇浓度对花红叶多酚提取率的影响 由
图 1 可知， 在一定范围内， 随着乙醇浓度的提高，
花红叶中多酚类物质的提取率显著增加， 当乙醇体
积分数超过 60％时， 其提取率随着乙醇浓度的增
加而呈现下降的趋势。 这可能是过高的有机溶剂浓
度导致细胞膜变性， 通透性降低， 阻碍了多酚类物
质的溶出[15]。
2.1.2 提取时间对花红叶多酚提取率的影响 由
图 2 可知， 在一定的提取时间内， 花红叶多酚的提
取率随时间的延长相应增加， 并在 60 min 左右时
趋于平衡。 这是因为提取时间较短时， 原料中的多
酚与溶剂间的作用不够充分， 而时间越长， 溶剂与
溶质作用时间越久， 反应越充分。 但时间的过渡延
长会导致多酚氧化且杂质成分的溶解也随之增加，
不利于提取。
2.1.3 液料比对花红叶多酚提取率的影响 由图
3 可知， 其他条件一定时， 花红叶多酚提取率随液
料比的增大而增加， 这是因为较多的溶剂可以加快
整个溶媒的传质速率， 其提取率会明显提高。 但当
液料比大于 12 ∶ 1 时， 花红叶多酚提取率增加幅度
不大， 考虑到溶剂用量及下一步浓缩工艺的负荷，
本实验选择的液料比为 12 ∶ 1。
图 1 乙醇浓度对多酚提取率的影响
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0
多
酚
提
取
率
/％
乙醇浓度/％
0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0
多
酚
提
取
率
/％
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
提取时间/min
图 2 提取时间对多酚提取率的影响
1593- -
第 34 卷热 带 作 物 学 报
多
酚
提
取
率
/％
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
3 ∶ 1 6 ∶ 1 9 ∶ 1 12 ∶ 1 15 ∶ 1
液料比
图 3 液料比对多酚提取率的影响
提取次数
提
取
率
/％
提
取
比
例
/ ％
7.00
6.00
5.00
4.00
3.00
2.00
1.00
0.00
110.00
100.00
90.00
80.00
70.00
60.00
50.00
提取率
提取比例
94.19
97.95 100.00
1 2 3
图 4 提取次数对多酚提取率的影响
2.1.4 提取次数对花红叶多酚提取率的影响 由
图 4 可知， 多次提取比 1 次提取的多酚提取率高，
提取 2次和 3次其多酚提取率差别不明显。 从节约
时间、 物料成本考虑， 本实验采用 1次提取。
2.2 响应面实验结果与分析
2.2.1 响应面实验结果 按表 1 的因素与水平设
计的花红叶多酚提取条件进行实验， 结果如表 2所
示， 对数据的方差分析结果见表 3。
2.2.2 模型的建立及其显著性检验 通过 Design
Expert 7.0 软件对表 2 中花红叶多酚提取率进行处
理， 可得多酚提取率 Y（％）与 A（乙醇浓度/％）、 B
（提取时间 /min）、 C[液料比/（mL/g）]之间的编码值
回归方程为：
Y=4.62+0.093A+0.056B+0.69C+0.04AB+0.085AC-
0.018BC-0.29A2-0.41B2-1.09C2
对此模型进行方差分析（表3）可知 ， 拟合度
R2=0.998 0 说明该实验提取得率的实验值与预测值
之间有很好的拟合度； p＜0.01 说明该模型极其显
著； 失拟量为 4.18 说明失拟量相对于纯误差不显
著； 校正拟合度 0.994 3和预测拟合度 0.971 4 相差
较小， 表明此模型能较好地描述各因素与响应值之
间的关系； 信噪比为 46.292＞4 表明该模型有足够
的信噪比； 该模型的 F 值为 273.98， 失拟项不显
著。 综上表明该模型预测值与实验值的差异很小，
可用于指导实验。 在此模型中 A、 B、 C、 AC、 A2、
B2、 C2均显著， AB、 BC 不显著； 同时各因素的均
方值可以反映出各个因素对实验指标的重要性， 均
方值越大表明其对实验指标的影响越大。 从表 3可
以看出影响花红叶多酚提取率因素的主次顺序为：
液料比＞乙醇浓度＞提取时间。
经响应面设计分析， 最佳提取条件乙醇浓度
（A）为 62.08％， 提取时间（B）为 62.12 min， 液料比
（C）为 12.98 ∶ 1， 在此条件下， 花红叶多酚的提取
率可达 4.74％。
2.2.3 响应曲面法对提取工艺的分析与优化 从
图 5~图 7 可以看出， 乙醇浓度和液料比之间交互
作用显著， 相比较而言乙醇浓度和浸提时间之间交
互作用较小。 图 5为乙醇浓度和浸提时间对多酚提
取率的影响。 结果表明， 当固定液料比时， 多酚提
表 1 花红叶多酚提取实验的因素水平
水平
因素
A（乙醇浓度/％） B（提取时间/min） C[液料比/（mL/g）]
-1 50 30 9 ∶ 1
0 60 60 12 ∶ 1
1 70 90 15 ∶ 1
实验号
因素水平
提取率/％
乙醇浓度/％ 提取时间/min 液料比/（mL/g）
1 70 90 12 ∶ 1 4.14
2 60 60 12 ∶ 1 4.62
3 50 60 15 ∶ 1 3.75
4 70 60 15 ∶ 1 4.11
5 60 90 15 ∶ 1 3.80
6 70 60 9 ∶ 1 2.55
7 60 60 12 ∶ 1 4.58
8 50 60 9 ∶ 1 2.53
9 70 30 12 ∶ 1 3.86
10 60 90 9 ∶ 1 2.46
11 50 30 12 ∶ 1 3.76
12 60 30 9 ∶ 1 2.40
13 50 90 12 ∶ 1 3.88
14 60 30 15 ∶ 1 3.81
15 60 60 12 ∶ 1 4.65
表 2 花红叶多酚提取实验设计方案
1594- -
第 8 期 史运杰等： 响应面法优化花红叶多酚提取工艺的研究
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 Prob>F 显著性
模型 8.85 9 0.98 273.98 <0.000 1 **
A-乙醇浓度 0.068 1 0.068 19.08 0.007 2 **
B-提取时间 0.025 1 0.025 7.05 0.045 1 *
C-液料比 3.82 1 3.82 1 065.29 <0.000 1 **
AB 6.40 E-03 1 6.40 E-03 1.78 0.239 3 -
AC 0.029 1 0.029 8.05 0.036 3 *
BC 1.23 E-03 1 1.23 E-03 0.34 0.584 4 -
A2 0.32 1 0.32 89.29 0.000 2 **
B2 0.63 1 0.63 174.73 <0.000 1 **
C2 4.36 1 4.36 1 215.99 <0.000 1 **
残差 0.018 5 3.59 E-03 - - -
失拟项 0.015 3 5.16 E-03 4.18 0.199 -
误差 2.47 E-03 2 1.23 E-03 - - -
总和 8.87 14 - - - -
表 3 花红叶多酚提取回归模型的方差分析
说明： R2=0.998 0； Adj R2=0.994 3； Pred R2=0.9714； Adeq Precision=46.292； “*” 表示差异显著， p＜0.05； “**” 表示差异极显著，
p＜0.01。 下同。
图 5 Y=f（A， B）的等高线和响应面图
90.00
75.00
60.00
45.00
20.00
B（
浸
提
时
间
） /
m
in
50.00 55.00 60.00 65.00 70.00
A（乙醇浓度）/％
Y（提取率）/％
B（浸提时间）/min A（乙醇浓度）/％
90.00
75.00
60.00
45.00
20.00 50.00
55.00
60.00
65.00
70.00
4.65
4.425
4.2
3.975
3.75
50.00 55.00 60.00 65.00 70.00
15.00
13.50
12.00
10.50
9.00
4.9
4.3
3.7
3.1
2.5
A（乙醇浓度）/％
50.00
55.00
60.00
65.00
70.0015.00
13.50
12.00
10.50
9.00
C（液料比）/（mL/g） A（乙醇浓度）/％
图 6 Y=f（A， C）的等高线和响应面图
Y
（提
取
率
） /
％
Y（提取率）/％
Y
（提
取
率
） /
％
C（
液
料
比
） /
（ m
L/
g）
1595- -
第 34 卷热 带 作 物 学 报
Y（提取率）/％
Y
（提
取
率
） /
％
C（液料比）/（mL/g）
C（
液
料
比
） /
（ m
L/
g）
取率随着乙醇浓度的升高或浸提时间的延长呈先增
大后减小的趋势。 图中等高线近似圆形， 乙醇浓度
和浸提时间的交互作用不明显。 从图 6 可以看出，
随着乙醇浓度的提高和液料比的增大， 花红叶多酚
提取率快速升高， 超过一定值时提取率又显著降
低， 说明乙醇浓度和液料比交互作用显著， 与方差
分析结果一致。 从图 7可以看出， 在浸提时间一定
的情况下， 虽然随着液料比的增大， 花红叶多酚提
取率先增加后减小， 并且变化显著， 但是总体提取
率并不高。
30.00 45.00 60.00 75.00 90.00
4.9
4.25
3.6
2.95
2.3
15.00
13.50
12.00
10.50
9.00
B（浸提时间）/min B（浸提时间）/min
90.00
75.00
60.00
45.00
20.00
15.00
13.50
12.00
10.50
9.00
图 7 Y=f（B， C）的等高线和响应面图
2.3 最优条件验证
考虑实际操作的局限性， 将提取条件修改为乙
醇浓度 60％， 提取时间为 60 min， 液料比 12 ∶ 1。
在此条件下进行 3 次重复实验 ， 平均提取率为
4.61％， 相对标准偏差为 1.49％。 表明提取实验的
重复性和精密度较好。 模型预测的最大提取率 4.74％
比验证实验的平均提取率 4.61％高 2.8％， 表明模
型预测值与实验值之间有很好的拟合性， 证实了模
型的有效性。
3 讨论与结论
响应面实验设计方法能够克服单因素设计法费
时、 忽视不同因素相互作用关系的缺点 [16-17]， 并且
能够弥补由于正交试验不能在给出的整个区内找到
因素和响应值之间明确回归方程的缺点， 从而找到
整个范围内的最佳组合和最优响应值 [18]。 然而响应
面法只能确定各个因素对响应值的影响程度和各因
素间的交互作用程度， 不能解释提取过程中各个因
素对响应值影响的机理[19]。
花红叶是一种经民间长期实践使用的药食两用
植物。 钟海雁等 [20-21]采用微波提取法测定花红叶中
多酚类物质含量在 5％左右， 其中黄酮类占 60％以
上， 其结论与本研究结果基本一致。 林叶新等 [21-23]
证实花红叶提取物具有抑菌和清除自由基的作用。
潘莹等 [24-25]研究证实花红叶中黄酮提取物对大鼠的
急性肝损伤、 四氯化碳致慢性肝损伤、 酒精致慢性
肝损伤等均有保护作用。
本研究采用乙醇-水浸提花红叶中多酚类物质，
使用 Design Expert 7.1.3 软件， 通过 Box-Behnken
中心组合实验， 得到乙醇提取花红叶多酚的二次多
项式回归模型， 通过方差分析和验证试验表明该模
型可靠， 能较好地预测花红叶多酚的提取率。 通过
响应面和等高线图分析探讨各因素对提取率的作
用。 经回归模型预测， 提取花红叶多酚的最佳条件
为乙醇浓度 62.08％， 提取时间 62.12 min， 液料比
12.98 ∶ 1， 理论提取率为 4.74％。 考虑到实际操作
条件， 本实验将提取条件修改为乙醇浓度 60％，
提取时间为 60 min， 液料比 12 ∶ 1， 采用一次提取，
重复 3 次， 得花红叶多酚的平均提取率为 4.61％，
与理论最大值（4.74％）较接近。 今后的研究， 建议
在提取的基础上进一步分离纯化花红叶中的多酚类
物质， 鉴定其具体成分的结构， 探讨其与生物活性
的关系， 为进一步利用这一传统资源打下基础。
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责任编辑： 林海妹
史运杰等： 响应面法优化花红叶多酚提取工艺的研究 1597- -