全 文 ：书第 30 卷 第 2 期 福建师范大学学报 (自然科学版) Vol. 30，No. 2
(2014 年 3 月) Journal of Fujian Normal University (Natural Science Edition) Mar. 2014
文章编号:1000-5277(2014)02-0119-06
中华补血草多酚诱导白血病细胞 HL-60 凋亡的研究
严 卫，肖义军，林 尧，陈炳华
(福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350117)
摘要:采用 MTT法研究了中华补血草根多酚提取物对 HL-60 细胞的抑增殖效果; AO/EB 染色、DNA
片段化检测和 Annexin V-FITC流式细胞术等方法检测了多酚提取物对 HL-60 细胞诱导凋亡结果． Western
blotting检测 HL-60 细胞株中 Bcl-2、Bax蛋白的表达量． 结果表明，中华补血草多酚能明显抑制 HL-60 细胞
增殖，诱导 HL-60 细胞凋亡并具有质量浓度依赖性; Western blotting 检测经药物处理的细胞内 Bax 蛋白显
著升高，而 Bcl-2 蛋白表达水平明显降低，差异具有统计学意义 ( P ＜ 0. 05) ，其凋亡机制可能与下调 Bcl-2
蛋白、上调 Bax蛋白表达量相关．
关键词:中华补血草; 多酚提取物; 白血病; 增殖; 凋亡
中图分类号:Ｒ285 文献标志码:A
收稿日期:2013-07-03
基金项目:福建省自然科学基金资助项目 (2011J01145)
通信作者:肖义军 (1965 － )，副教授，博士，研究方向为肿瘤药理及抗肿瘤天然药物． xiaoyijun@ fjnu. edu. cn
Study of Limonium sinense Polyphenols Inducing
Apoptosis in HL-60 Human Leukemia Cells
YAN Wei，XIAO Yi-jun，LIN Yao，CHEN Bing-hua
(College of Life Sciences，Fujian Normal University，Fuzhou 350117 ，China)
Abstract:MTT assay was used to determine the cells proliferation level． The cell apoptosis
was assayed by staining of cell with AO-EB，DNA fragmentation and Annexin V-TITC /PI FCM．
The expressions of Bcl-2，Bax were measured by Western blotting． Our results showed that Limoni-
um sinense polyphenols can significantly inhibited the proliferation and increased the apoptosis rate of
HL-60 human leukemia cells in a dose-dependent manner． The expression of Bax was increased，
while the expression of Bcl-2 was decreased (P ＜ 0. 05)in HL-60 cell treated with Limonium-
sinense． Its molecular mechanism may be related with the expressions of Bcl-2，Bax．
Key words:Limonium sinense;polyphenols extracts;leukemia;proliferation;apoptosis
大量的研究显示，植物多酚类成分例如茶多酚、白藜芦醇、姜黄素等不但具有良好的抗氧化功
能，也具有较强的抗肿瘤效果［1 － 2］． 作者的前期研究发现，中华补血草中含有丰富的多酚成分具有较
强的抗氧化活性［3］． 但关于补血草属植物抗肿瘤活性方面的研究目前较少，因此，本文以人白血病
细胞株 HL-60 为模型，来研究中华补血草多酚提取物体外对肿瘤细胞的抑制增殖和促进凋亡效果．
Bcl-2 家族是对细胞凋亡具有广泛调控的一个基因家族． 其中，Bcl-2 主要是抑制细胞凋亡，Bax 最主
要是促进细胞凋亡． 在多数的肿瘤细胞株中，Bcl-2 蛋白的水平有所升高，而 Bax 蛋白的表达水平表
现出下降［4］． 已有的研究表明，补血草多酚能够抑制多种恶性肿瘤的的生长，该作用可能与诱导细
胞凋亡、分化和阻滞细胞周期有关． 但对于补血草多酚诱导的白血病 HL-60 细胞株的凋亡是否与 Bcl-
2 和 Bax蛋白的表达情况相关尚无定论． 本研究观察不同质量浓度的补血草多酚对人白血病 HL-60 细
胞体外增殖的影响，初步探讨其分子机制． 本项目研究结果可以为中华补血草的进一步开发提供理论
依据．
福 建 师 范 大 学 学 报 (自 然 科 学 版) 2014 年
1 材料与方法
1. 1 材料、试剂及仪器
供试中华补血草 (Limoniumsinense (Girard)Kuntze)采自福建惠安崇武镇的沙滩湿地，经福建师
范大学生命科学学院刘剑秋教授鉴定．
ＲPMI-1640 培养基 (Gibco公司)、胎牛血清 (杭州四季青公司)、AO (Fluka 公司)、EB (华美
公司)、细胞裂解液 (质量分数 1% NP40，20 mmol·L －1 EDTA、50 mmol·L －1 Tris-HCl pH7. 5)An-
nexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒、显色试剂盒、一抗 Actin 抗体、辣根过氧化物酶 (HＲP)标记的
二抗抗体 (江苏碧云天生物技术研究所)、一抗 Bcl-2、Bax (santacruz 公司)、蛋白酶 K (Sigma 公
司)、ＲNA酶 (Sigma公司)、DMSO (Sigma公司)．
96 孔细胞培养板 (Costar)、电子天平 (Mettler Toledo公司 AL104)、细胞培养箱 (HEAL FOＲCE
公司)、低温离心机 (J2-21 型，Becman公司)、酶标仪 (BioTekSynergy HT型)、离心机 (Thermo 公
司)、超净工作台 (AIＲ TEC公司)、倒置显微镜 (Olympus)、光学显微镜 (Olympus)、微量加样器
(德国 Eppendor)、水平电泳仪 (北京六一仪器厂)、凝胶图象分析仪 (Cell Biosciences FluorChem
Q)、流式细胞仪 (BD公司 FACSCalibur)．
1. 2 实验方法
1. 2. 1 中华补血草多酚提取物的提取制备
取中华补血草根洗净烘干后粉碎，过 60 目筛，以体积分数 45%乙醇为提取剂，采用超声波辅助
浸提 －大孔树脂吸附法制备多酚提取物，具体操作参照文献［3，5］． 提取物贮藏于 － 20 ℃冰箱中备
用． 总酚含量采用 Folin-ciocalteu试剂比色法进行测定，以单宁酸为标准品，根据单宁酸回归方程 y
= 3. 969x + 0. 018(y为吸光度，x为单宁酸质量浓度，Ｒ2 = 0. 999)计算样品中多酚质量分数［6］． 原花色
素含量采用硫酸 －香草醛比色法进行测定，以儿茶素为标准品，根据儿茶素回归方程 y = 9. 484x +
0. 009(y为吸光度，x为儿茶素质量浓度，Ｒ2 = 0. 998)计算样品中原花色素质量分数． 每个样品均设 3
次重复．
1. 2. 2 细胞株及培养条件
人急性早幼粒白血病细胞株 HL-60，由福建医科大学附属协和医院血液病研究所惠赠． 用含体积
分数 10%胎牛血清的 ＲPMI1640 培养液，置 37℃，体积分数 5% CO2，饱和湿度的培养箱中培养，2
～ 3 d换液传代 1 次． 实验用细胞为状况良好的对数生长期细胞．
1. 2. 3 MTT法检测多酚对细胞增殖的影响
将 HL-60 细胞密度调整为每 mL －11 × 104 个，接种于 96 孔培养板，每孔 180 μL． 实验设本底对
照、阴性空白对照以及 5 个不同质量浓度的中华补血草多酚提取液的药物梯度． 实验组中，每孔加入
不同质量浓度的中华补血草多酚提取液 (用无血清 ＲPMI1640 培养液稀释)20 μL，使中华补血草多
酚提取液终质量浓度分别为 3. 125，6. 250，12. 500，25. 000，50. 000 μg·mL －1 ． 本底对照不加细
胞，其他与药物组条件相同． 阴性对照组加 180 μL细胞，再加 20 μL同质量浓度的无血清 ＲPMI1640
培养液． 每组设 4 个平行孔，置于 37℃、饱和湿度、体积分数为 5% 的 CO2 培养箱中培养、分别孵
育 24，48，72 h后每孔加入 5 mg·mL －1的 MTT溶液 20 μL，孵育 4 h 后，小心吸去上清，每孔加入
DMSO 150 μL，振荡至结晶溶解后，置酶标仪上测定 492 nm波长处吸光度值(OD)，计算细胞增殖抑
制率和半数抑制率 IC50值． IC50 = lg
－1［Xm － i(∑ p － 0. 5)］，重复3次，取平均值．实验重复3次，取平均
值．细胞增殖抑制率 = (1 － 用药组平均 OD值 / 对照组平均 OD值)× 100% ．
1. 2. 4 AO-EB荧光染色检测细胞凋亡
精确称取 AO、EB各 1 mg，分别溶于 10 mL pH 7. 2 的 PBS 中，配成 100 μg·mL －1储备液，4℃
避光保存． 用前等量混合，药物处理分组 (0，6. 25，12. 50，25. 00 ，50 . 00 μg·mL －1)，作用 48 h
后的 HL-60 细胞悬液 95 μL加入 AO-EB染料 5 μL混匀，滴于载玻片上，立即在 490 nm 激发波长的
021
第 2 期 严 卫等:中华补血草多酚诱导白血病细胞 HL-60 凋亡的研究
荧光显微镜下观察．
1. 2. 5 DNA片段化检测细胞凋亡
分组同上，细胞密度为每 mL 107 个，处理 48 h后收集细胞，PBS 洗涤 2 次，加入 60 μL 细胞裂
解液充分裂解;12 000 r·min －1离心 5 min，吸上清于另一 EP 管，加入 SDS (终质量分数为 1%)、
ＲnaseA (终质量浓度为 1 μg·μL －1)，置 56 ℃孵育 120 min 后再加入蛋白酶 K (终质量浓度为 2. 5
μg·μL －1)，37 ℃作用 120 min;加入 1 /25 体积的 5 mol·L －1的 NaCl 溶液，2. 5 体积无水乙醇沉淀
DNA， － 20 ℃放置过夜;12 000 r·min －1离心 5 min，弃上清;提取的 DNA 风干后，溶于 20 μL TE
缓冲液;各取 DNA溶液 5 μL上样于质量分数为 1. 0% 琼脂糖凝胶，电压 90 V，电泳时间 0. 5 h，取
出胶板，EB染色 20 min，置入凝胶电泳处理系统成像分析结果．
1. 2. 6 Annexin V-FITC流式细胞术检测细胞凋亡
采用 Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测． 取对照组与 12. 5，25. 0，50. 0 μg·mL －1的补血
草多酚处理 48 h的 HL-60 细胞约 20 万个，1 000 r·min －1离心 5 min，弃上清，PBS洗涤 1 次，1 000
r·min －1离心 5 min，弃上清，收集细胞． 加入 195 μL Annexin V-FITC 结合液轻轻重悬细胞，加入 5
μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温 (20 ～ 25℃)避光孵育 10 min． 1 000 r·min －1离心 5 min，弃上
清，加入 190 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞． 加入 10 μL碘化丙啶 (PI)染色液，轻轻混
匀，冰浴避光放置． 1 h内上机进行流式细胞仪检测． 实验重复 3 次，取平均值．
1. 2. 7 Western blotting免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白的表达
收集对照组与 12. 5，25. 0，50. 0 μg·mL －1不同质量浓度的补血草多酚处理 48 h 的 HL-60 细胞，
加入裂解液提取总蛋白并测定蛋白质浓度，每组取 20 μg的总蛋白进行 12%的 SDS-PAGE，待电泳结
束后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜上;用体积分数 10%的牛血清蛋白封闭后，分别加入
体积比 1∶ 1 000 稀释的抗 Bcl-2、Bax 和 actin 抗体，4 ℃孵育过夜;待复温 1 h 后，TBST 洗涤 3 次，
加入体积比 1∶ 2 000 稀释的相对于一抗的抗体，室温孵育 1. 5 h;TBST洗涤 3 次后，加入 DAB辣根过
氧化物酶显色液于暗室自显影，用凝胶成像仪进行拍照记录并采用 gel pro 4. 0 软件进行灰度分析． 目
的蛋白的相对表达量用目的蛋白条带灰度值与内参 β-actin条带灰度值予以表示．
* 表示与阴性对照组比较，P ＜ 0. 05 ;
＊＊表示与阴性对照组比较，P ＜ 0. 01
图 1 不同质量浓度的中华补
血草多酚作用于 HL-60 细胞 48 h
后对细胞增殖的抑制作用
Fig. 1 Inhibitory effects of HL-60 cells
after the varying concentration of
Limonium sinense polyphenols
treatment for 48 hours
1. 2. 8 统计学分析
采用 SPSS 16. 0 统计分析软件进行数据处理和差异显著性分析． 实验数据以 mean ± S. D. 形式表
示，* P ＜ 0. 05 为显著，＊＊P ＜ 0. 01 为极显著．
2 结果
2. 1 多酚提取物的得率及组成
中华补血草多酚提取物的得率为 11. 81%，总酚含量
(56. 78 ± 0. 58)%，其中含原花色素 (37. 47 ± 0. 85)%，与以前
的研究结果基本一致［5］．
2. 2 中华补血草多酚对 HL-60 细胞的抑增殖作用
不同质量浓度的中华补血草多酚提取物对 HL-60 细胞的生
长有不同程度的抑制作用，呈现明显的量效关系 (见图 1)． 作
用 48 h的半数抑制质量浓度(IC50)为 11. 55 μg·mL
－1 ．
2. 3 AO-EB荧光染色观察结果
对照组 HL-60 细胞形态正常，细胞核显均匀的绿色． 低质
量浓度药物处理组细胞核大多可见不规则的块状绿色荧光 (早
期凋亡细胞)，偶见整个胞体显示不均匀红色的坏死细胞． 高质
量浓度药物处理组细胞大多呈现晚期凋亡细胞的特征，细胞核
形态为浓染的红色块状碎片 (见图 2)．
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福 建 师 范 大 学 学 报 (自 然 科 学 版) 2014 年
A:对照组;B:12. 5 μg·mL －1;C:25. 0 μg·mL －1;D:50. 0 μg·mL －1
图 2 补血草多酚处理 48 h后的 HL-60 细胞形态 (AO-EB染色， ×400)
Fig. 2 HL-60 cells morphology after the Limonium sinense polyphenols
treatment for 48 hours(AO/EB staining，× 400)
M:marker;1:对照组;2:12. 5 μg·mL －1;
3:25. 0 μg·mL －1;4:50. 0 μg·mL －1
图 3 补血草多酚处理 HL-60 细胞
48 h后的 DNA片段化检测结果
Fig. 3 Ｒesult of DNA fragmentation assay
of HL-60 cells after the Limonium sinense
polyphenols treatment for 48 hours
2. 4 DNA片段化检测结果
不同质量浓度的中华补血草多酚处理 HL-60 细胞 48 h 后，
均出现细胞凋亡特征性 DNA梯状条带，药物质量浓度越高，条
带越明显，而对照组细胞未见 DNA片段化现象 (见图 3)．
2. 5 Annexin V-FITC流式细胞术检测细胞凋亡结果
结果如图 4 所示，对照组细胞基本无凋亡，而 12. 5，25. 0，
50. 0 μg·mL-1的补血草多酚分别作用于 HL-60 细胞 48 h，凋亡
细胞百分率 (右下象限:FITC + /PI － +右上象限:FITC + /PI
+)分别为 9. 60%、36. 47%、80. 55%，说明随多酚质量浓度
增加凋亡百分率亦增高，并且在高质量浓度时，大部分细胞处
于凋亡晚期 (47. 35%)．
2. 6 凋亡相关蛋白的表达检测结果
蛋白印迹法结果显示:不同质量浓度 (0，12. 5，25. 0，
50. 0 μg·mL －1)的补血草多酚作用 HL-60 细胞 48 h 后，凋亡
蛋白家族成员 Bax 的表达水平明显上调，与此同时，抗凋亡蛋
Bcl-2 的表达水平下调，与对照组比较差异均有统计学意义 (P
＜ 0. 05);而且随着药物质量浓度的升高，上述凋亡相关蛋白
的表达水平变化明显，呈质量浓度依赖性 (见图 5)．
A:对照组;B:12. 5 μg·mL －1;C:25. 0 μg·mL －1;D:50. 0 μg·mL －1
图 4 中华补血草多酚处理 HL-60 细胞
48 h AnnexinV-FITC流式细胞术检测结果
Fig. 4 Ｒesult of Annexin V-FITC /PI FCM detection of HL-60
cells afterr the Limonium sinense polyphenols treatment for 48 hours
3 讨论
中华补血草 (Limonium-
sinense (Girard) Kuntze)是
白花丹科 (Plumbaginaceae)
多年生泌盐草本植物，喜生
于盐渍化的低洼湿地上，广
泛分布于海边滩涂地区，福
建惠安、晋江、诏安、厦门
以及台湾金门等地均有大量
分布，野生资源量大． 中华
补血草根或全草入药，具有
健脾补血、活血止血和调经
之功效，传统用于治疗感冒、
失血、血热、月经过多等症．
近来的研究显示补血草属植物还具有保肝、抗病毒等多种药理活性［7］．
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第 2 期 严 卫等:中华补血草多酚诱导白血病细胞 HL-60 凋亡的研究
A:对照组;B:12. 5 μg·mL －1;
C:25. 0 μg·mL －1;D:50. 0 μg·mL －1
图 5 中华补血草多酚处理 HL-60
细胞 48 h后 Bcl-2、Bax蛋白表达检测结果
Fig. 5 Expression of Bcl-2、Baxprotienin HL-60
cells afterr the Limonium sinense polyphenols
treatment for 48 hours
关于补血草属植物抗肿瘤活性方面的研究目前
很少，已报道的有汤新慧［8］等初步研究了中华补血
草根提取物的抗肿瘤活性，发现其对人肝癌细胞具
有一定的体外抑增殖活性，对小鼠黑色素瘤也有一
定的体内抑瘤活性． 龙玲等［9］研究了黄花补血草多
糖的抗肿瘤活性，发现其可以体内抑制小鼠肝癌的
生长． 目前研究较多的如茶多酚、白藜芦醇、姜黄
素等可以抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，
还能拮抗化疗药物对正常细胞的毒性、逆转肿瘤细
胞对化疗药物的耐药［10］． 流行病学调查认为西方发
达国家居民的乳腺癌、前列腺癌、结肠癌的发病率
显著高于东南亚居民的部分原因在于摄入多酚类化
合物的量较少［11］．
Bcl-2 与 Bax基因均属于 Bcl-2 家族，它们分别
是 Bcl-2 家族中最具有代表性的抑制凋亡和促进凋
亡的基因，在肿瘤细胞凋亡中具有重要的调控作用［12］． Bcl-2 蛋白由 239 个氨基酸组成，分子质量为
26 ku，主要定位于线粒体外膜，通过线粒体与 caspase-9 等形成复合物，抑制 Cyto C 的释放等，从而
起到抗凋亡的作用，也就是具有拮抗促凋亡蛋白的功能［13］． Bax 蛋白主要位于胞浆中，但当凋亡发
生时，它从细胞浆移到线粒体并与线粒体膜结合，再与位于线粒体的 Bcl-2 相互作用而发挥诱导凋亡
的作用． 细胞内促凋亡蛋白 Bax和抗凋亡蛋白 Bcl-2 通过在线粒体外膜形成不同的孔来调节线粒体膜
的通透性改变，跨膜电位丢失，释放出细胞色素 C (CytoC)． 从而进一步激活 caspase-9、caspase-3 等
一起系列级联反应，诱导细胞凋亡［14］． Bcl-2 和 Bcl-xl 则能与促凋亡蛋白 Bax 和 Bak 结合，从而阻止
后者的活化． 由 Bcl-2 表达呈明显下降趋势，Bcl-2 /Bax 的比值降低，也表明补血草多酚可能通过蛋
白 Bcl-2、Bax的表达经线粒体途径调节诱导细胞的凋亡． 综上所述，中华补血草多酚在体外可以抑
制白血病 HL-60 细胞的增殖，并通过调控蛋白 Bcl-2、Bax的表达经线粒体途径调节诱导细胞的凋亡．
预示着中华补血草多酚将来可应用于白血病或其他肿瘤的治疗或辅助治疗，值得进一步深入研究．
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(责任编辑:余 望
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