全 文 ：周　颖 ,梁利香 ,夏新奎.地肤子粗多糖的提取工艺研究 [ J] .江苏农业科学 , 2011, 39(3):395-397.
地肤子粗多糖的提取工艺研究
周　颖 , 梁利香 , 夏新奎
(信阳农业高等专科学校 ,河南信阳 464000)
　　摘要:为研究中药地肤子可溶性粗多糖的提取工艺 ,通过单因素试验和 L9(33)正交试验 , 以多糖得率为指标 , 研
究了提取温度 、料液比 、提取时间对多糖提取率的影响 , 确定地肤子多糖的最佳提取工艺。结果显示:3因素对多糖提
取率影响的主次顺序为提取温度 >提取时间 >料液比 , 温度为主要因素。最佳提取工艺为提取温度 80 ℃、料液比为
1 g∶12 mL、提取时间 90 min, 地肤子多糖的提取率为 4.92%。同时研究了提取过程中脱蛋白的处理方法 ,结果显示:
木瓜蛋白酶 +Sevag法脱蛋白处理效果最佳。
　　关键词:地肤子;多糖;提取工艺;脱蛋白
　　中图分类号:Q946.3　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2011)03-0395-03
收稿日期:2011-03-24
基金项目:河南省科技攻关计划(编号:102102310319)。
作者简介:周　颖(1963—),女 ,河南信阳人 ,实验师 ,从事植物资源
研究。 E-mail:xynzxb@ 126.com。
　　多糖作为构成生命活动的基本物质之一 ,在抗肿瘤 、抗
炎 、抗病毒、降血糖 、抗衰老 、抗凝血等方面均发挥着特殊的生
物活性作用 。随着分子生物学和细胞生物学的发展 ,多糖及
其缀合物作为支持组织和能量来源的传统观念早已被突破 ,
被认为是生物体内除核酸以外又一类重要的信息分子 ,而且
由于它们常是细胞表面信号识别 、抗原抗体反应 、细胞间信息
传递和感受的关键因子 ,因此 ,具有生物活性的多糖的研究日
益受到重视 。多糖种类繁多 ,广泛存在于动物 、植物 、微生物
和海藻中 ,为充分开发多糖资源 ,我国近年来对植物多糖特别
是具有中国特色的中草药多糖的药物活性已有广泛研究 。本
试验结合当地植物资源 ,选用中药地肤子作为原材料 ,对其多
糖的提取工艺进行了研究 。
地肤子是藜科植物地肤 [ Kochiascoparia(L.)Schrad.]
的干燥种子 。地肤俗称扫帚苗 , 属地肤属一年生草本植物 。
地肤子具有利小便 、清湿热 、止痒之功效 [ 1 ] ,主治小便不利 、
淋病 、带下、疝气 、风疹 、疮毒 、疥癣 、阴部湿痒等;外用可治各
种皮肤瘙痒 、湿疹 、干癣 、皮肤过敏等 [ 2]等;地肤子的营养成
分非常丰富 ,含有三萜皂苷 、齐墩果酸及油酸 、亚油酸等不饱
和脂肪酸 [ 3 ] 。但地肤子多糖的研究还鲜见报道 。本文以地
肤子粗多糖的提取率为考察指标 ,采用单因素试验和 L9(33)
正交试验法对提取过程中温度 、料液比 、提取时间 3因素进行
了优选研究 ,得出了地肤子粗多糖的最佳提取工艺 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
地肤子购自河南省信阳市药材公司 ,产地为河南 ,经信阳
农业高等专科学校药用植物教研室鉴定为中药地肤子 。
1.2　试剂
甲醇 、乙醇 、丙酮 、葡萄糖 、苯酚 、浓硫酸、氯仿 、正丁醇 、三
氯乙酸 、木瓜蛋白酶均为国产分析纯 。 Sevag试剂的配制:氯
仿与正丁醇按 5∶1的体积比配制而成 。
1.3　主要仪器
电热恒温水溶槽:北京市医疗设备厂。 Z323K高速冷冻
离心机:德国 HERML公司 。 752紫外可见分光光度计:上海
精密科学仪器有限公司 。
1.4　提取方法
称取粉碎的地肤子干品粉末 200g,甲醇回流脱去表面脂
肪 ,抽滤 ,药渣风干。再用 80%乙醇回流除去小分子糖 、苷
类 、生物碱等 ,药渣风干。然后分别取药渣 5 g,以水作为溶
剂 ,采用不同的提取温度 、料液比、提取时间对药渣进行多糖
提取试验 。水提液离心除去杂质 ,减压浓缩至小体积 ,加无水
乙醇至浓度为 75%沉淀;静置 24h后过滤 ,用 95%乙醇、无
水乙醇 、丙酮洗涤数次 ,真空干燥 ,得地肤子粗多糖 。
1.5　提取工艺条件的选择
要得到较高的提取率 ,就必须选择合适的提取条件 。本
试验分别考察了提取温度、料液比 、提取时间及提取次数对提
取率的影响 。
1.5.1　提取温度对提取率的影响　温度过低 ,不利于多糖物
质的溶出;而温度过高 ,容易引起多糖降解 。所以本试验选取
提取温度在 50 ～ 90℃之间 。分别在 50、60、70、80、90℃ 5个
温度下 ,以料液比(g∶mL,全文同)1 ∶12提取 45min。
1.5.2　料液比对提取率的影响　一般来说 ,只要能将活性物
质溶出 ,料液比越小越好 ,因为料液比过大时 ,会给以后的浓
缩带来不便 。本试验固定提取温度 80 ℃,提取时间 45 min,
分别以料液比 1∶8、1∶10、1 ∶12、1∶15、1 ∶18进行试验 。
1.5.3　提取时间对提取率的影响　延长提取时间会提高提
取率 ,但当细胞中的有效成分已完全溶出时 ,再延长提取时
间 ,非但不能提高提取率 ,反而会增加提取液中杂质的含量 。
本试验固定提取温度 80℃,料液比 1∶12 ,分别以 30、45、60、
90、120min进行试验 。
1.5.4　提取次数对提取率的影响 　选用温度 80 ℃,料液比
1 ∶12,时间 45min,共提取 4次 。
1.5.5　正交试验　选取提取温度 、料液比 、提取时间 3个因
素及其 3个较好的水平进行正交试验 。
—395—江苏农业科学　2011年第 39卷第 3期DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2011.03.018
1.6　粗多糖纯化方法的选择
1.6.1　粗多糖中蛋白质含量的测定方法　利用紫外吸收法
(280 nm和 260 nm的吸收差法)测定 [ 4] 。配制多糖粗品溶
液 ,以水作为空白对照 ,分别于 280 nm和 260 nm下测吸光度
值 ,根据经验公式:蛋白质浓度 C(mg/mL)=1.45 ×D280 nm -
0.74×D260 nm ,即可求得样品溶液中蛋白质的浓度 。
1.6.2　多糖含量的测定方法　采用苯酚 -硫酸法 [ 5] 。
1.6.3　脱蛋白处理方法　蛋白质是粗多糖中的主要杂质 ,它
们所带电荷可吸附大量其他杂质 ,使其他杂质的去除变得困
难 ,且还会吸附多糖 ,增加了多糖分离的难度 。所以要获得纯
度较高的多糖 ,就必须进行脱蛋白处理 。本试验采用 3种不
同的方法分别对粗多糖进行脱蛋白比较 。
(1)Sevag法 [ 6] :根据蛋白质在氯仿等溶剂中变性的特
点 ,加入多糖溶液体积 1 /5体积的氯仿 ,再加入氯仿体积 1 /5
的正丁醇 ,混合后 ,剧烈振荡 20min,离心除去变性蛋白质沉
淀 ,重复 5次 ,再浓缩 、醇沉 、洗涤 、真空干燥 。
(2)3%三氯乙酸法 [ 6 ]:在多糖溶液中滴加 3%三氯乙酸 ,
直至不再继续浑浊为止 , 5 ～ 10 ℃放置过夜 ,离心除去胶状蛋
白 ,再浓缩、醇沉 、洗涤 、真空干燥 。
(3)木瓜蛋白酶 +Sevag法:将木瓜蛋白酶按蛋白酶 ∶多
糖 =1∶20加入多糖溶液中 ,于 70℃下恒温磁力搅拌器中保
温 5 h,再按上述 Sevag法加入 Sevag溶液 ,重复 3次 。再浓
缩 、醇沉 、洗涤 ,真空干燥得脱蛋白多糖 。
将 3种方法获得的粗多糖分别配成 0.05 mg/mL的样品
液 ,测定它们的吸光度值 ,算出溶液中的蛋白质及多糖含量。
1.6.4　脱盐　粗多糖中还含有无机盐 ,须作脱盐处理 。将脱
蛋白多糖置于透析袋中 ,透析 48 h,不断换水 ,然后浓缩、醇
沉 、洗涤得多糖半纯品 。
2　结果与讨论
2.1　提取工艺条件的探讨
2.1.1　温度对提取率的影响　由图 1可以看出 ,提取率随温
度升高而增加 , 70 ～ 90 ℃为较理想的提取温度 ,所以选 70、
80、90℃进行以后的正交试验 。
2.1.2　料液比对提取率的影响　由图 2可以看出 ,提取率随
料液比的增大而呈上升趋势 ,但增加到一定程度就趋于平稳 ,
1 ∶10 ～ 1 ∶15为较好的提取条件 ,以此条件进行以后的正交
试验 。
2.1.3　时间对提取率的影响　由图 3可以看出 ,提取率随时
间的延长而增加 ,但 90 min之后增加不大 ,所以选取 45、60、
90 min进行正交试验 。
2.1.4　提取次数对提取率的影响　由图 4可知 ,提取 3次已
足可以将地肤子多糖提取出来 ,故在正交试验中不考虑这一
因素 。
2.1.5　正交试验结果　为了优化提取工艺条件 ,本试验选取
对提取率有较大影响的 3个因素及其 3个水平:提取温度(70
～ 90 ℃)、料液比(1 ∶10 ～ 1 ∶15)、提取时间(45 ～ 90 min)进
行 L9(33)正交试验 。选用因素水平见表 1,正交试验结果见
表 2。
表 1　地肤子粗多糖提取因素水平编码
水平 A:提取温度(℃)
B:料液比
(g∶mL)
C:提取时间
(min)
1 70 1∶10 45
2 80 1∶12 60
3 90 1∶15 90
　　(1)由表 2可看出 ,不同因素水平对提取率有明显的影
响 。若以提取率为目标 ,温度 80 ℃, 料液比 1 ∶12 ,时间
90 min为最适条件 。
(2)从极差 R值可知 , 3因素对多糖提取率影响的主次顺
序为 A>C>B,温度为主要影响因素 。由此确立最佳提取工
艺为 A2B2C3 ,即提取温度 80 ℃、料液比为 1 ∶12、提取时间
90 min。
—396— 江苏农业科学　2011年第 39卷第 3期
表 2　地肤子粗多糖提取正交试验方案及结果
编号 A B C 提取率(%)
1 1 1 1 4.43
2 1 2 2 4.56
3 1 3 3 4.85
4 2 1 2 4.80
5 2 2 3 4.92
6 2 3 1 4.35
7 3 1 3 4.21
8 3 2 1 4.50
9 3 3 2 4.52
k1 4.61 4.48 4.43
k2 4.69 4.66 4.63
k3 4.41 4.57 4.66
R 0.28 0.18 0.23
　　(3)正交试验所确定的最佳条件包含在正交表的 9个试
验内 ,试验结果显示 ,在最佳提取工艺条件下地肤子多糖的平
均提取率为 4.92%。
2.2　苯酚 -硫酸法测定多糖含量的标准曲线
根据表 3的数据 ,计算得回归方程式为 D=6.864 3C+
0.012 9 ,相关系数 r=0.998 3。
表 3　葡萄糖浓度与吸光度的关系
葡萄糖浓度 C(mg/mL) 吸光度 D
0.01 0.088
0.02 0.145
0.03 0.218
0.04 0.291
0.05 0.352
0.06 0.412
0.07 0.506
2.3　脱蛋白方法的探讨
由表 4可知 , Sevag法对蛋白质的去除率达 93.13%,但
同时多糖损失达 51.66%,且此法效率不高 ,需要重复数次 ,
尤其对于蛋白质结合多糖的处理较为困难 ,容易一起絮凝沉
淀 ,造成样品多糖的损失 。三氯乙酸法对于蛋白质的去除率
也较高 ,但同样多糖的损失率大 ,达 69.78%,且此法较为剧
烈 ,容易引起某些多糖的降解 。木瓜蛋白酶 +Sevag法利用木
瓜蛋白酶切断蛋白链 ,水解了大部分结合蛋白和游离蛋白 ,再
配以 Sevag法脱 3次 ,不仅脱蛋白效率高 ,达 99.01%,且多糖
的损失大大降低 。此过程中木瓜蛋白酶作用于蛋白质大分
子 ,有利于多糖物质的溶出;同时也降低了多糖溶液的黏稠
度 ,有利于真空浓缩和粗多糖的进一步纯化 ,故此法有明显的
优点 。
表 4　地肤子粗多糖 3种脱蛋白方法的比较
方法 蛋白质去除率(%)
多糖损失率
(%)
Sevag法 93.13 51.66
3%三氯乙酸法 95.86 69.78
木瓜蛋白酶 +Sevag法 99.01 21.04
3　结论
为了寻求地肤子多糖较为满意的提取方法 ,主要研究了
地肤子多糖的提取工艺及 3种脱蛋白方法的比较 ,得出如下
结论:(1)以水为溶剂进行提取 ,控制温度为 80℃,加 12倍
的水 ,提取时间 90 min,提取 3次 ,即可达到较高的提取率 。
(2)脱蛋白过程中 ,采用 2种化学法(Sevag法和 3%三氯乙酸
法)和酶结合 Sevag法进行比较 ,无论在蛋白质的去除率方面
还是就多糖的损失率而言 , 2种化学法脱蛋白效率均不如酶
结合 Sevag法 。 Sevag法虽然条件温和 ,但其操作繁琐 ,多糖
的损失率大 。虽然三氯乙酸法脱蛋白效率比 Sevag法稍高 ,
但多糖的损失也大 ,且反应剧烈 ,会导致某些活性物质的降
解 。所以 2种化学法在脱蛋白方面均不及酶结合 Sevag法 ,
不宜推广 。而酶结合 Sevag法操作简便 、高效 、毒性小 ,是理
想的脱蛋白方法 。
参考文献:
[ 1]丁宝章 ,王遂义 ,高增义.河南植物志:第一册 [ M] .郑州:河南
科学技术出版社 , 1978.
[ 2]中国药材公司.中国中药资源志要 [ M] .北京:科学出版社 ,
1994.
[ 3]路洪顺 ,王　曼.地肤的营养价值和栽培技术 [ J] .中国林副特
产 , 2001(11):39-40.
[ 4]马如复.生物化学实验 [ M] .武汉:武汉大学出版社 , 1998.
[ 5]李　俊 ,韩向晖 , 李仲洪 , 等.茯苓多糖的提取及含量测定 [ J].
中国现代应用药学杂志 , 2000, 17(2):49-50.
[ 6]方积年.多糖的分离纯化及其纯度鉴别与分子量测定 [ J].药学
通报 , 1984, 19(10):46-49.
—397—周　颖等:地肤子粗多糖的提取工艺研究