全 文 ：浙 江 农 业 大 学 学 报 20 ( 4 ): 3 6 3一 3 6 8, 1 9 94
oJ u r n a l o f Z h e ji a n g A g r ie u l t u r a l U n i v e r s i t y
芜菩花叶病毒外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达①
许建平 徐 平 陈集双 李德葆
(浙江农业大学生物技术研究所 , 杭州 31 0 0 2 9)
摘 要 本文报道采用反转录酶一聚合酶链式反应 , 体外扩增芜著花叶病毒 ( T u M v )外壳蛋白
基因及其克隆 , 并在大肠杆菌中获得表达的结果 . 从杭州市郊区感病的油菜上分离到一株致病力极
强的芜蔷花叶病毒分离物 ,提纯后 ,经 50 gn /m L 蛋白酶 K 和 0 . 5 % S D S 处理 , 苯酚 /氯仿和氯仿抽
提两次 ,酒精沉淀 , 获得了纯化的病毒 R N A ,该 R N A 与 ol i g o( d T ) 15退火后 ,在 A M v 反转录酶的作
用下合成了单链 c D N A , 然后加入用以扩增 T u M V 一 C P 基因的上下游引物 , 35 个循环后 , 得到了一
条长约 Q. 85 kb 的片段 ,将该片段克隆到 P U C 18 质粒的 S al l 限制性酶切位点 ,分析了限制性酶切
图谱 ,分析表明该片段含有 E co R I 和 X ab l 以及引物设计时带入的 cN 口 I三个酶切位点 ,该片段克
隆到大肠 杆菌 ( E s c入e r i c人i a c o l i )原核表达载体 p K K 2 3 3一 2 质粒的 cN o l 和 H i n d l 位点后 , 经
IP T G 诱导 , 以该病毒的抗血清为第一抗体 , W es t e m b lot 检测该基因的表达产物 , 结果表明该基因
的表达产物为 T u M v 一 C P 蛋 白 , 因而认为所获得的扩增片段确为芜著花叶病毒外壳蛋白基因 .
关 键 词
中图分类
芜普花叶病毒 ; 外壳蛋白基因 ; 反转录酶一聚合酶链式反应
5 4 3 5
.
5 ; 5 4 3 2
.
4 ; 5 4 8 2
.
7
X u J i a nP i
n g ; X u P i n g ; C h e n J i s h u a n g ; L i eD ab
o ( I n 对 . of B i o t e c h
. ,
Z h ej i
a n g A g r i e
.
U
n i v
. ,
H
a n g 之石o u 3 1 0 0 2 9 , hC i , : a )
M
o一e e u 一a r e一o n i n g o f t u r n i p m o s a i e v i r u s 一 r a p e i s o . a te e a p s id p r o t e i n g e n e . Jo u r n a l o f Z h e ji a n g A -
g r i e u l t
u r a l U n iv e r s it y
,
1 9 9 4
,
2 0 ( 4 ) : 3 6 3一 3 68
A b s t r a e t T h
e p r e s e n t p a p e r d
e a ls w i th t h
e r e s u l t s o f m o l e e u l a r e lo n i n g a n d e x p r e s s i n g i n E s
-
c h e r i c h i a c o l i o f t h
e g e n e w h i
e
h
e n e o d in g t h
e t u r n i p m
o s a ie v ir u s e a p s i d p
r o r e in
.
A
v ir u l
e n t i s o l
a t e
o f T u M V w
a s is o l
a t e d f r o m B ar
s s i c a ar P
e a r o u n d t h e s u b u r b o f H a n g z h o u
.
T h e v ir a l R N A w a s e x
-
t r a e t e d f
r o m p u r i f ie d v i r u s w h a t p e r t r e a t e d w it h 0
.
5% SD S
a n d 5 0 n g / m L p
r o t e i n a s e K
,
p r e e i p i t a
-
t i o n b y e t h a n o l
.
F i r s t s t r a n d
o f e D N A w a s s y n t h e s iz e d f r o m v i r a l R N A a s a t e m p l a t e w it h 0 119 0
( d T )
1 5 p r im e r u s i n g A M V
r e v e r s e t r a n s e r ip t a s e
.
A D N A f r a g m e n t a b o u t 0
.
85 k b w a s o b t a i n e d a f
-
t e r a m p li fi e d b y p o ly m e r a s e e h a in r e a e t io n w it h a r t if ie ia l s y n t h e t ie o lig o n u e le o t id e p r im e fo r 3 5 e y
-
e l e s t h a t d e n a t u r e d in 9 4 C f o r 4 5 5
, a n n e a
l i
n g i n 3 7 ℃ f o r 2 m i n s a n d s y n t h e s iz e d i n 7 2 ,C of r 3
m i n s
.
E
x t r a e t e d b y p h
e n o
l /
e h lo r o f o r m a n d e h lo r o f o r m
, t h e P C R p r o d u e t w a s e lo n e d in t o P U C 1 8
p l
a s
m id S
a z 1 m
u
l t ip l
e e l o n i n g s i t e a n d t h
e w h
o
l
e r e s t r ie t io n m
a p w a s a n a l y
z e
d
.
I t w a s s h
o w n t h
a t
t h
e r e a r e t h
r e e r e s t r ie t i o n s i t e s o n t h
e D N A f r a g m e n t
,
X ba l
,
E e o R 1 a n d
a N e o 1 s i t e w h ie h w a s d i s
-
g i
n e d o n t h e p r im e
.
T h
e f r a g m e n t w a s e lo n e d in t o N c o 1 a n d H i
n d 1 m
u
lt i p l
e e
l
o n
i
n g s i t e o f
P K K 2 3 3
一
2 p r o k a r y o t i e e x p r e s s io n p l a s m i d
, a f t e r in d u e e d b y I P T G
, t h
e
E
.
e o l i e x p r e s s e d t h e
T
u
M V
e a p s id p
r o t e in d
e t e e t e d b y W
e s t e r n B l
o t t i n g u s i n g T
u
M V
一 r a p e a n t i s e r iu m
a s s f i r s t a n t i
-
b o d y
.
T h e r e s u l t s s h e w t h a t t h e e n t i r e g e n e e n e o d i n g t h e e a P s id p r o t e in 11 a s b e e n e l o n e d
.
K e y w o r d s t
u r n ip m
o s a ie v i r u s ; e a p s id p
r o t e in g e n e ; r e v e r s e t r a n s e r ip t
a s e 一 p o l y m e r a s e e h a in
r e a C t l o n
收稿日期 : 1 99 3一 0 9一 2 0
①浙江省科委资助项 目
浙 江 农 业 大 学 学 报 2 0卷
芜着花叶病毒是十字花科作物上的重要病原 , 广泛分布于北美 、 亚欧大陆以及大洋洲和非
洲等地区 [ ’ 」, 寄主范围很广图 , 生产上造成严重的危害 ,我国南方地区是导致十字花科作物病
毒病的重要病原 3[ 一 5〕 , 自然界中主要以蚜虫的非持久性方式传播 , 目前生产上尚无 良好的防治
措施 ,转基因工程植株研究的成功给植物病毒病害的防治提供了一条新途径 6[] , 目前国内外对
芜蓄 花叶病毒的研 究主要在 生物学性状 、 寄主 范围 、 传播方式 、 物理性状和株系 划分等方
面 〔 , 一 ’ “ · ’ 〕 , 有人对它的血清学 、 组织病理学以及病毒颗粒的特性作过研究10[ · ’ l] ,但在病毒基 因
组的结构 、 功能和调控机制上 , 研究不多 〔” 一 ` 3〕 . 本文主要报道从杭州郊区感病的油菜植株上分
离到一株致病力极强的分离物 ,采用反转录酶一聚合酶链式反应 ( R ve er se T r a sn er itP as e 一oP l y -
m e ar
s e C h a in R ea c it o n
,
R T
一
P C R )方法 ,体外扩增外壳蛋白基 因 , 以及克隆 ,并在大肠杆菌中
获得表达的结果 .
1 材料与方法
1
.
1 材 料
从杭州市郊区感病的油菜上分离到的一株致病力极强的芜蔷花叶病毒分离物 ,保存在城
青二号大 白菜上 ,并 以城青二号大 白菜为扩增毒源的材料 . 实验 中常用的限制性内切酶 、 T 4
D N A 连接酶 、 克 隆试 剂 盒 、 c D N A 合 成 试 剂 盒 和碱性磷 酸 酶标记羊抗 兔 Ig G 均 购 自
B o e h r i n g e r M a n n h e im 公司 , 聚合酶链式反应试剂盒购自 P e r k in 一 E lm e r C e t u s 公司 , 大肠杆菌
表达载体 P K K 2 3 3一 2 试剂盒购 自 P h a r m a o ia 公司 ,硝酸纤维素膜为 A m o sr ha m 公司产品 , 碱
性磷酸酶 底物 N B T 和 B C I P 购 自 P r o m e g a 公 司 , 宿 主菌为大肠杆菌 ( E sc h e icr h i a c of i ) JM
1 0 5
,标准蛋 白质分子量为中国科学院上海生物化学研究所东风生化试剂厂产品 , 其它常用试
剂均为国产分析纯级试剂 .
1
.
2 方 法
1
.
2
.
1 病毒纯化 、 杭血清制备和 病毒 R N A 的提取 ①病毒纯化方法 : 感病 的大 白菜病叶
冷 冻至一 20 C 20 分钟后 ,高速组织捣碎器捣碎 ,加入 10 写氯仿 /正丁醇 ( 1 : 1 , v/ v) 继续搅拌
20 分钟 ,双层纱布过滤 , 4 ` C 下 8 0 0 9 离心 20 分钟取上清 , 往上清液加入 N a CI 和 P E G 一 6 0 0 0
至终浓度分别 为 0 . 1 m ol / L 和 4% , 沉淀 3 小时 , 8 0 0 9 离心 20 分钟取沉淀 , 沉淀经 0 . 02
m ol / L 磷酸缓冲液悬浮后 , 12 0 0 9 离 心 ,取上清 ,上清液再于 78 0 0 9 , 4 C 下离心 1 0 分钟 ,
取沉淀 , 悬浮后于 5%至 40 写甘油梯度 78 0 0 9 离心 2 小时 , 沉淀物即为纯化的病毒 . ②芜著
花叶病毒抗血清的制备 : 取纯化的病毒 1 m g 与等体积的 rF e un d ` s 不完全佐剂乳化后 , 皮内免
疫家免 , 一个月后 , 每隔一周用提纯的病毒 0 . 3 m g 耳静脉加强免疫 2 次 ,血清效价测定采用环
状沉淀法和 E IL S A 方法测定 . ③病毒 R N A 的提取 : 提纯的病毒液经 0 . 5% S D S , 50 n g /m L 蛋
白酶 K 处理后 ,用苯酚 /氯仿和氯仿各抽提 二次 , 2 倍体积的乙醇沉淀 , 便得到提纯的病 毒
R N A
.
1
.
2
.
2 聚合酶链式反应 ( P C R )上下游 引物 的设计 据文献 ls[ 」报道 , 参考了 P ot vy iur s 病毒
组其它病毒外壳蛋白基因的序列 ,并考虑到今后工作的方便 ,设计了适用于 P C R 反应的上下
游引物 ,该引物由中国科学院上海细胞生物学研究所合成 ,其序列为 :
P r im e r A
: 5 ,
一
G C G T C G A C C A T G G C A G G T G A A A CG C T T G
一
3 ,
浙 江 农 业 大 学 学 报 2 0卷
芜着花叶病毒是十字花科作物上的重要病原 , 广泛分布于北美 、 亚欧大陆以及大洋洲和非
洲等地区 [ ’ 」, 寄主范围很广图 , 生产上造成严重的危害 ,我国南方地区是导致十字花科作物病
毒病的重要病原 3[ 一 5〕 , 自然界中主要以蚜虫的非持久性方式传播 , 目前生产上尚无 良好的防治
措施 ,转基因工程植株研究的成功给植物病毒病害的防治提供了一条新途径 6[] , 目前国内外对
芜蓄 花叶病毒的研 究主要在 生物学性状 、 寄主 范围 、 传播方式 、 物理性状和株系 划分等方
面 〔 , 一 ’ “ · ’ 〕 , 有人对它的血清学 、 组织病理学以及病毒颗粒的特性作过研究10[ · ’ l] ,但在病毒基 因
组的结构 、 功能和调控机制上 , 研究不多 〔” 一 ` 3〕 . 本文主要报道从杭州郊区感病的油菜植株上分
离到一株致病力极强的分离物 ,采用反转录酶一聚合酶链式反应 ( R ve er se T r a sn er itP as e 一oP l y -
m e ar
s e C h a in R ea c it o n
,
R T
一
P C R )方法 ,体外扩增外壳蛋白基 因 , 以及克隆 ,并在大肠杆菌中
获得表达的结果 .
1 材料与方法
1
.
1 材 料
从杭州市郊区感病的油菜上分离到的一株致病力极强的芜蔷花叶病毒分离物 ,保存在城
青二号大 白菜上 ,并 以城青二号大 白菜为扩增毒源的材料 . 实验 中常用的限制性内切酶 、 T 4
D N A 连接酶 、 克 隆试 剂 盒 、 c D N A 合 成 试 剂 盒 和碱性磷 酸 酶标记羊抗 兔 Ig G 均 购 自
B o e h r i n g e r M a n n h e im 公司 , 聚合酶链式反应试剂盒购自 P e r k in 一 E lm e r C e t u s 公司 , 大肠杆菌
表达载体 P K K 2 3 3一 2 试剂盒购 自 P h a r m a o ia 公司 ,硝酸纤维素膜为 A m o sr ha m 公司产品 , 碱
性磷酸酶 底物 N B T 和 B C I P 购 自 P r o m e g a 公 司 , 宿 主菌为大肠杆菌 ( E sc h e icr h i a c of i ) JM
1 0 5
,标准蛋 白质分子量为中国科学院上海生物化学研究所东风生化试剂厂产品 , 其它常用试
剂均为国产分析纯级试剂 .
1
.
2 方 法
1
.
2
.
1 病毒纯化 、 杭血清制备和 病毒 R N A 的提取 ①病毒纯化方法 : 感病 的大 白菜病叶
冷 冻至一 20 C 20 分钟后 ,高速组织捣碎器捣碎 ,加入 10 写氯仿 /正丁醇 ( 1 : 1 , v/ v) 继续搅拌
20 分钟 ,双层纱布过滤 , 4 ` C 下 8 0 0 9 离心 20 分钟取上清 , 往上清液加入 N a CI 和 P E G 一 6 0 0 0
至终浓度分别 为 0 . 1 m ol / L 和 4% , 沉淀 3 小时 , 8 0 0 9 离心 20 分钟取沉淀 , 沉淀经 0 . 02
m ol / L 磷酸缓冲液悬浮后 , 12 0 0 9 离 心 ,取上清 ,上清液再于 78 0 0 9 , 4 C 下离心 1 0 分钟 ,
取沉淀 , 悬浮后于 5%至 40 写甘油梯度 78 0 0 9 离心 2 小时 , 沉淀物即为纯化的病毒 . ②芜著
花叶病毒抗血清的制备 : 取纯化的病毒 1 m g 与等体积的 rF e un d ` s 不完全佐剂乳化后 , 皮内免
疫家免 , 一个月后 , 每隔一周用提纯的病毒 0 . 3 m g 耳静脉加强免疫 2 次 ,血清效价测定采用环
状沉淀法和 E IL S A 方法测定 . ③病毒 R N A 的提取 : 提纯的病毒液经 0 . 5% S D S , 50 n g /m L 蛋
白酶 K 处理后 ,用苯酚 /氯仿和氯仿各抽提 二次 , 2 倍体积的乙醇沉淀 , 便得到提纯的病 毒
R N A
.
1
.
2
.
2 聚合酶链式反应 ( P C R )上下游 引物 的设计 据文献 ls[ 」报道 , 参考了 P ot vy iur s 病毒
组其它病毒外壳蛋白基因的序列 ,并考虑到今后工作的方便 ,设计了适用于 P C R 反应的上下
游引物 ,该引物由中国科学院上海细胞生物学研究所合成 ,其序列为 :
P r im e r A
: 5 ,
一
G C G T C G A C C A T G G C A G G T G A A A CG C T T G
一
3 ,
浙 江 农 业 大 学 学 报 2 0卷
芜着花叶病毒是十字花科作物上的重要病原 , 广泛分布于北美 、 亚欧大陆以及大洋洲和非
洲等地区 [ ’ 」, 寄主范围很广图 , 生产上造成严重的危害 ,我国南方地区是导致十字花科作物病
毒病的重要病原 3[ 一 5〕 , 自然界中主要以蚜虫的非持久性方式传播 , 目前生产上尚无 良好的防治
措施 ,转基因工程植株研究的成功给植物病毒病害的防治提供了一条新途径 6[] , 目前国内外对
芜蓄 花叶病毒的研 究主要在 生物学性状 、 寄主 范围 、 传播方式 、 物理性状和株系 划分等方
面 〔 , 一 ’ “ · ’ 〕 , 有人对它的血清学 、 组织病理学以及病毒颗粒的特性作过研究10[ · ’ l] ,但在病毒基 因
组的结构 、 功能和调控机制上 , 研究不多 〔” 一 ` 3〕 . 本文主要报道从杭州郊区感病的油菜植株上分
离到一株致病力极强的分离物 ,采用反转录酶一聚合酶链式反应 ( R ve er se T r a sn er itP as e 一oP l y -
m e ar
s e C h a in R ea c it o n
,
R T
一
P C R )方法 ,体外扩增外壳蛋白基 因 , 以及克隆 ,并在大肠杆菌中
获得表达的结果 .
1 材料与方法
1
.
1 材 料
从杭州市郊区感病的油菜上分离到的一株致病力极强的芜蔷花叶病毒分离物 ,保存在城
青二号大 白菜上 ,并 以城青二号大 白菜为扩增毒源的材料 . 实验 中常用的限制性内切酶 、 T 4
D N A 连接酶 、 克 隆试 剂 盒 、 c D N A 合 成 试 剂 盒 和碱性磷 酸 酶标记羊抗 兔 Ig G 均 购 自
B o e h r i n g e r M a n n h e im 公司 , 聚合酶链式反应试剂盒购自 P e r k in 一 E lm e r C e t u s 公司 , 大肠杆菌
表达载体 P K K 2 3 3一 2 试剂盒购 自 P h a r m a o ia 公司 ,硝酸纤维素膜为 A m o sr ha m 公司产品 , 碱
性磷酸酶 底物 N B T 和 B C I P 购 自 P r o m e g a 公 司 , 宿 主菌为大肠杆菌 ( E sc h e icr h i a c of i ) JM
1 0 5
,标准蛋 白质分子量为中国科学院上海生物化学研究所东风生化试剂厂产品 , 其它常用试
剂均为国产分析纯级试剂 .
1
.
2 方 法
1
.
2
.
1 病毒纯化 、 杭血清制备和 病毒 R N A 的提取 ①病毒纯化方法 : 感病 的大 白菜病叶
冷 冻至一 20 C 20 分钟后 ,高速组织捣碎器捣碎 ,加入 10 写氯仿 /正丁醇 ( 1 : 1 , v/ v) 继续搅拌
20 分钟 ,双层纱布过滤 , 4 ` C 下 8 0 0 9 离心 20 分钟取上清 , 往上清液加入 N a CI 和 P E G 一 6 0 0 0
至终浓度分别 为 0 . 1 m ol / L 和 4% , 沉淀 3 小时 , 8 0 0 9 离心 20 分钟取沉淀 , 沉淀经 0 . 02
m ol / L 磷酸缓冲液悬浮后 , 12 0 0 9 离 心 ,取上清 ,上清液再于 78 0 0 9 , 4 C 下离心 1 0 分钟 ,
取沉淀 , 悬浮后于 5%至 40 写甘油梯度 78 0 0 9 离心 2 小时 , 沉淀物即为纯化的病毒 . ②芜著
花叶病毒抗血清的制备 : 取纯化的病毒 1 m g 与等体积的 rF e un d ` s 不完全佐剂乳化后 , 皮内免
疫家免 , 一个月后 , 每隔一周用提纯的病毒 0 . 3 m g 耳静脉加强免疫 2 次 ,血清效价测定采用环
状沉淀法和 E IL S A 方法测定 . ③病毒 R N A 的提取 : 提纯的病毒液经 0 . 5% S D S , 50 n g /m L 蛋
白酶 K 处理后 ,用苯酚 /氯仿和氯仿各抽提 二次 , 2 倍体积的乙醇沉淀 , 便得到提纯的病 毒
R N A
.
1
.
2
.
2 聚合酶链式反应 ( P C R )上下游 引物 的设计 据文献 ls[ 」报道 , 参考了 P ot vy iur s 病毒
组其它病毒外壳蛋白基因的序列 ,并考虑到今后工作的方便 ,设计了适用于 P C R 反应的上下
游引物 ,该引物由中国科学院上海细胞生物学研究所合成 ,其序列为 :
P r im e r A
: 5 ,
一
G C G T C G A C C A T G G C A G G T G A A A CG C T T G
一
3 ,
浙 江 农 业 大 学 学 报 0 2卷
芜着花叶病毒是十字花科作物上的重要病原 , 广泛分布于北美 、 亚欧大陆以及大洋洲和非
洲等地区 [ ’ 」, 寄主范围很广图 , 生产上造成严重的危害 ,我国南方地区是导致十字花科作物病
毒病的重要病原 3[ 一 5〕 , 自然界中主要以蚜虫的非持久性方式传播 , 目前生产上尚无 良好的防治
措施 ,转基因工程植株研究的成功给植物病毒病害的防治提供了一条新途径 6[] , 目前国内外对
芜蓄 花叶病毒的研 究主要在 生物学性状 、 寄主 范围 、 传播方式 、 物理性状和株系 划分等方
面 〔 , 一 ’ “ · ’ 〕 , 有人对它的血清学 、 组织病理学以及病毒颗粒的特性作过研究10[ · ’ l] ,但在病毒基 因
组的结构 、 功能和调控机制上 , 研究不多 〔” 一 ` 3〕 . 本文主要报道从杭州郊区感病的油菜植株上分
离到一株致病力极强的分离物 ,采用反转录酶一聚合酶链式反应 ( R ve er se T r a sn er itP as e 一oP l y -
m e ar
s e C h a in R ea c it o n
,
R T
一
P C R )方法 ,体外扩增外壳蛋白基 因 , 以及克隆 ,并在大肠杆菌中
获得表达的结果 .
1 材料与方法
1
.
1 材 料
从杭州市郊区感病的油菜上分离到的一株致病力极强的芜蔷花叶病毒分离物 ,保存在城
青二号大 白菜上 ,并 以城青二号大 白菜为扩增毒源的材料 . 实验 中常用的限制性内切酶 、 T 4
D N A 连接酶 、 克 隆试 剂 盒 、 c D N A 合 成 试 剂 盒 和碱性磷 酸 酶标记羊抗 兔 Ig G 均 购 自
B o e h r i n g e r M a n n h e im 公司 , 聚合酶链式反应试剂盒购自 P e r k in 一 E lm e r C e t u s 公司 , 大肠杆菌
表达载体 P K K 2 3 3一 2 试剂盒购 自 P h a r m a o ia 公司 ,硝酸纤维素膜为 A m o sr ha m 公司产品 , 碱
性磷酸酶 底物 N B T 和 B C I P 购 自 P r o m e g a 公 司 , 宿 主菌为大肠杆菌 ( E sc h e icr h i a c of i ) JM
1 0 5
,标准蛋 白质分子量为中国科学院上海生物化学研究所东风生化试剂厂产品 , 其它常用试
剂均为国产分析纯级试剂 .
1
.
2 方 法
1
.
2
.
1 病毒纯化 、 杭血清制备和 病毒 R N A 的提取 ①病毒纯化方法 : 感病 的大 白菜病叶
冷 冻至一 20 C 20 分钟后 ,高速组织捣碎器捣碎 ,加入 10 写氯仿 /正丁醇 ( 1 : 1 , v/ v) 继续搅拌
20 分钟 ,双层纱布过滤 , 4 ` C 下 8 0 0 9 离心 20 分钟取上清 , 往上清液加入 N a CI 和 P E G 一 6 0 0 0
至终浓度分别 为 0 . 1 m ol / L 和 4% , 沉淀 3 小时 , 8 0 0 9 离心 20 分钟取沉淀 , 沉淀经 0 . 02
m ol / L 磷酸缓冲液悬浮后 , 12 0 0 9 离 心 ,取上清 ,上清液再于 78 0 0 9 , 4 C 下离心 1 0 分钟 ,
取沉淀 , 悬浮后于 5%至 40 写甘油梯度 78 0 0 9 离心 2 小时 , 沉淀物即为纯化的病毒 . ②芜著
花叶病毒抗血清的制备 : 取纯化的病毒 1 m g 与等体积的 rF e un d ` s 不完全佐剂乳化后 , 皮内免
疫家免 , 一个月后 , 每隔一周用提纯的病毒 0 . 3 m g 耳静脉加强免疫 2 次 ,血清效价测定采用环
状沉淀法和 E IL S A 方法测定 . ③病毒 R N A 的提取 : 提纯的病毒液经 0 . 5% S D S , 50 n g /m L 蛋
白酶 K 处理后 ,用苯酚 /氯仿和氯仿各抽提 二次 , 2 倍体积的乙醇沉淀 , 便得到提纯的病 毒
R N A
.
1
.
2
.
2 聚合酶链式反应 ( P C R )上下游 引物 的设计 据文献 ls[ 」报道 , 参考了 P ot vy iur s 病毒
组其它病毒外壳蛋白基因的序列 ,并考虑到今后工作的方便 ,设计了适用于 P C R 反应的上下
游引物 ,该引物由中国科学院上海细胞生物学研究所合成 ,其序列为 :
P r im e r A
: 5 ,
一
G C G T C G A C C A T G G C A G G T G A A A CG C T T G
一
3 ,
3 6 8 浙 江 农 业 大 学 学 报 2 0 卷
茄 、 马铃薯等作物 , 因而开展十字花科作物抗病毒基因工程研究 ,不仅在理论上 , 而且现实意义
上都十分重大 , 我们实验室 已经建立 了一套完整 的大 白菜等十字花科 作物原生质体成株技
术 l[ ’ 〕 , 我们期望构建成植物表达载体 , 将该基因导入十字花科作物 , 培育出具有应用价值的作
物新品系 .
参考文献
G r e e n S K
,
eD
n g T C
.
T u r n ip m o s a i e
v
i r u s s t r a i n s i n e r u e i f e r o u s h o s i n T a i w a n
.
P la n t iD s e a s e
.
1 9 8 5
.
6 9
:
2 8一 3 1
朱培坤 ,陆妙康 ,王 鸣岐等 . 芜蔷花叶病毒在上海市郊 区蔬菜等植物上分布范围的血清学侧定 . 植物病理学报 , 19 84 ,
1 4 ( 2 )
: 1 0 1一 1 0 6
王拱辰 . 浙江油菜 花叶病毒类型研究 . 微生物学报 , 1 97 8 , 18 (4 ) : 2 98 一 309
李丽丽 , 黄早花 ,王圣玉等 . 华中地区油菜病毒的毒源种类血清学诊断 . 中国油料 , 19 78 , 4 : 52 一 5
方小平 ,李丽丽 , 黄早花等 . 油菜芜著花叶病毒 C R Z 株系的提纯及其特性 ,见 : 黄可训主编 . 首届全 国中青年植物保
护工作者学术讨论会论文集 北京 : 中国科学技术 出版社 . 1 9 9 2 . 1 13 一 1 18
P o w e l l
一
A b e l P A
,
N e l s o n R S
,
eD B
, e r a l
.
D e l a y o f d i s e a s e d e
v e l o p m e n t i n t r a n s g e n i e p l a n t t h a t e x p r e s s ht e t o ba e
-
e o m o s a i e v i r u s e o a t P r o t e i n
. 段 i e n e e , 1 9 8 6 , 2 3 2 : 7 3 8一 7 4 3
李德葆 , 周家炽 . 罗 卜花叶的病毒类群和复合病侵染的研究初报 . 植物保护学报 , 19 “ , 3( 2) : 15 5一 16 3
裘维蕃 , 梁训生 . 京津大白菜孤丁病毒源的类型及其分布 . 植物病理学报 , 19 63 , 6( 2) : 16 9一 1 7
徐来升 , 牛宏舜 , 黄素珍等 . 芜著花叶病毒— 崇明大白菜分离株的鉴定 . 植物病理学报 , l9 83 . l 3( 2) : 21 一 2 9朱海英 , 裘维蕃 . 大白菜孤 丁病 主要病原芜著花叶病毒的研究 . 植物病理学报 , 1 989 , 19 ( l ) : l 一 5
李彦勇 . 应用间接酶联免疫吸附技术对芜著花叶病毒血清学关系的研究 . 植物病理学报 , 19 84 , 1 4( 4) : 2 19 一 2 24
S h i e ld
s
S A
,
W i l l s o n T M A
.
C e l l
一
f
r e e t r a n s la r i o n o f r u r n ip m o s a ic v i r u s R N A J
.
G e n
.
V i r o l
. ,
19 8 7
,
6 8
:
1 6 9一 18 1
T r e m b la y M F
,
N i e o la s ( )
,
S in h a R C
,
e t a l
.
eS q
u e n e e o f t h e 3
`一 t e r m in a l r e g i o n o f t u r n ip mo sa ic v扮us R N A a nd
e a p s id p r o t e i n g e n e J
.
G e n
.
V i r o l
. ,
19 9 0 , 7 1 : 2 7 6 9一 1 7 7 2
S h im i
z n Y
,
T a k a b a y
a s h i E
,
Y a n o S
, 。 r a z . M o l e e u l a r e l o n in g a n d e x p r e s s io n in E 3c公“ ch ia C讨￡o f t he e D N A e闭 in g
f o
r r a r lip o e o
r t i n l ( C a l p
a e t i n l ) G e n e
,
19 8 8
,
6 5
: 1 4 1一 1 4 7
S a m b r o o k J
,
F i r t s e h E F
,
M
a n i a t i s T
, 〔 r a l
.
M
o l e e u l a r e l o n i n g
一
A l a b o r a t o r y m a n u a l
,
2月 d 记 . N e w Y o kr t U S A
C o ld S p r i n g H a r b o r I
J
a bo r a t o r y P r e s s
,
1 9 8 9
K o az k M
.
P o i n t m u t a t i o n s e lo s e t o t h e A U G 泣n i t i a t i o r e o d o n a f fe e t t h e e f f i e i e n e y o f t ra ns la t io n s o f ra t p re p r ion s a l in
i n u i u o
.
N a t u r e
,
1 9 84
,
3 0 8
:
2 4 1一 2 4 6
李世君 ,盂 征 , 李德葆 . 大白菜无菌叶肉原生质体再生 . 生物工程学报 , 19 92 , 8 ( 3) : 2 49 一 254
叮口只éQùnó,立,曰口
ōJ .
I
五1人主