全 文 ：第 41 卷　第 1 期
2002年 2月
复旦学报(自然科学版)
Journal of Fudan University(Natural Science)
Vol.41 No.1
Feb.2002
　　文章编号:0427-7104(2002)01-0036-06

长叶车前花叶病毒上海株(RMVsh)外壳蛋白基因
的克隆 、序列分析及原核表达
洪　军 , 朱洪庆 , 叶　荣 , 于善谦
(复旦大学 生命科学学院 微生物和微生物工程系 , 上海　200433)
摘　要:长叶车前花叶病毒上海分离株(RMVsh)是从上海郊区的青菜(Brassica chinensis)上分离鉴定的.以提
纯的病毒为材料 , SDS-酚法纯化的基因组 RNA 作为模板 , 通过 RT-PCR 方法克隆了该病毒的外壳蛋白基因
(CP).DNA序列测定结果表明 , 外壳蛋白基因全长 474 个碱基 ,编码 157个氨基酸.将 CP 基因插入原核表达载
体 pBAD/His-C 中 ,转化 E .coli Top10后 , 诱导表达 ,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈一特异性的蛋白条带.West-
ern blot 检测表明 ,表达产物与 RM Vsh 抗血清呈阳性反应.RMVsh CP 基因的核苷酸序列及氨基酸序列与烟草
花叶病毒属中其他能侵染十字花科作物的成员相比 , 同源率分别为 83.5%～ 98.9%和 87.9%～ 99.4%, 并讨论
了 RMVsh 的分类地位为烟草花叶病毒属侵染十字花科植物 2 个亚组中的第一亚组的代表.
关键词:长叶车前花叶病毒;外壳蛋白基因;序列分析;原核表达
中图分类号:Q 939.46;Q 786　　　　文献标识码:A
　　长叶车前花叶病毒上海分离株(ribgrass mosaic virus shanghai isolate简称 RMVsh)是从上海郊区的青
菜 Brassica chinensis)上分离得到的 ,并经生物学方法 ,血清学方法 ,病毒的分离纯化以及外壳蛋白氨基酸
分析等方法鉴定为长叶车前花叶病毒上海分离株[ 1 ～ 4] .RMVsh为烟草花叶病毒属的成员之一 ,寄主范围
广泛 , 能感染 10 科 50 多种植物[ 5] ,特别包括长叶车前(Plantago lanceolate)和拟南芥(Arabidopsis
thaliana)模式植物.在我国广泛流行于青菜 、大白菜(B .pekinensis)等十字花科植物.周家炽曾由油菜(B .
campestris)上分离到类似于烟草花叶病毒的分离物 ,称油菜花叶病毒(YMV15)[ 6] ,盛方镜等在杭州地区
油菜上也分离到一个车前草花叶病毒分离物[ 7] ,但是国内至今未作过序列分析 ,也未作过与国外类似病
毒分离物的比较.本文对 RMVsh 的外壳蛋白基因进行了克隆与序列分析及原核表达 ,并与国外同类病毒
的外壳蛋白基因核苷酸序列及氨基酸序列进行了比较 ,为确立 RMVsh的分类地位提供了重要的实验依
据.
1　材料与方法
1.1　材料与试剂
克隆质粒 pGEM-T Easy Vector及连接试剂盒为 Promega公司产品.E .coli 菌株 TG1由本室保存.
原核表达载体 pBAD/ His-C 和 E .coli 菌株 Top10为 Invit rogen公司产品.RMV 上海分离物(RMVsh)由
本研究室分离鉴定.RMVsh抗血清由本室制备.阿拉伯糖为 Sigma 公司产品.cDNA 合成试剂盒 、PCR扩
增试剂盒为 TaKaRa公司产品.限制性内切酶及其他酶类均为 Promega公司产品.
1.2　病毒提纯及病毒基因组 RNA的纯化
病毒经单斑分离纯化 ,在青菜(Brassica chinensis)上繁殖 ,然后按郁操国等的方法[ 2]提取病毒.纯化的
收稿日期:2001-04-16
基金项目:上海市建设技术发展基金资助项目(A9600809)
作者简介:洪　军(1970—), 男 ,硕士研究生;通讯联系人于善谦教授.
DOI :10.15943/j.cnki.fdxb-jns.2002.01.011
病毒制剂用酚/氯仿抽提 3次 ,乙醇沉淀病毒 RNA ,真空抽干后用经 DEPC处理过的水溶解.
1.3　CP 基因的 cDNA合成及克隆
通过比较分析已报道的能侵染十字花科植物的烟草花叶病毒属成员的序列[ 8] ,参照保守区域的碱基
序列合成以下 2个引物(引物由上海 Sangon 公司合成):上游引物 pR-1 为 5′-CCATGGT TTACAACAT-
CACG-3′(下划线处为 Nco Ⅰ位点),下游引物 pR-2为 5′-CTATCGTGCGCACTACGC-3′,分别对应于 CP
基因的上下游区域.以基因组 RNA为模板 , pR-2 为引物 ,按 cDNA 合成试剂盒提供的方法反转录出 cD-
NA第一链.取 1μL 第一链 cDNA 为模板 ,加上下游引物各 1 μL , dN TP 2 μL , 10×Buf fer 2.5 μL , Taq
DNA Polymerase 0.5 μL ,在 25 μL 体系内进行PCR扩增.扩增条件为 94 ℃解链3 min ,94 ℃变性 30 s , 46
℃退火 50 s , 72 ℃延伸 1 min ,共 35个循环;最后一轮循环后 72 ℃延伸 7 min ,反应终止.PCR产物经 10
g/L 的琼脂糖凝胶电泳 ,切胶后用透析袋法纯化.
纯化的 PCR产物中加入 pGEM-T Easy Vector ,在 T 4DNA 连接酶的作用下 ,参照操作说明 ,于 16 ℃
条件下连接过夜.将连接产物转化 TG1感受态细胞 ,37 ℃保温 1 h ,涂布于含有氨苄青霉素(50 μg/mL)的
LB/ IPTG/X-gal选择培养基上 , 37 ℃培养过夜 ,进行蓝/白斑筛选 ,挑选白色菌落 ,酶切鉴定阳性克隆.
1.4　序列分析
抽提纯化阳性克隆质粒 DNA ,用 BigDyeTM Terminato r Cycle Sequencing Ready Kit (Perkin Elmer)/
ABI PRISMTM 377 DNA Sequencer/Version 3.0自动测序系统进行序列测定.
1.5　原核表达载体的构建及Western印迹检测
为使病毒的 CP 基因以正确的阅读框架(ORF)构建在 pBAD/His-C表达质粒中 ,选用内切酶 Nco Ⅰ
及 EcoR Ⅰ对重组子 pRMV16进行双酶切 ,回收0.5 kb的片段 ,插入 pBAD/His-C的 Nco Ⅰ和 EcoR Ⅰ位
点 ,使 CP 基因在表达载体的启动子控制之下.转化 Top10菌株后用阿拉伯糖诱导培养 ,收集菌体 ,裂解变
性后进行 SDS-PAGE电泳.电泳完成后 ,切下一部分胶条用考马斯亮蓝染色 ,观察蛋白的表达情况 ,另一
部分胶条转移至硝酸纤维素膜(NCM)上进行Western blo t检测.显色采用 BCIP/NBT 系统.所用抗体为
作者实验室制备的 RMVsh 兔抗血清 ,第二抗体为碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体(Sigma产品).
2　结果与分析
2.1　CP 基因的 cDNA合成 、PCR扩增及克隆
图1　RMVsh CP 基因的 RT-PCR产物
F ig.1　RMVsh CP cDNA synthesized
by RT-PCR
1 , 2 , 3 , 4.RT-PCR产物;M.Marker
由纯化的 RMVsh病毒制剂提取的病毒 RNA 经 10 g/L 的琼脂糖
凝胶电泳 ,紫外灯下观察只发现一个条带 ,比 TMV 的基因组 RNA 略
小 ,大小约 6.3 kb.RNA 经反转录后进行 PCR扩增 ,电泳检查扩增产
物 ,得到长度约 0.5 kb的均一条带(图 1),与预计的大小一致.扩增产
物经切胶纯化后 ,在 T 4DNA 连接酶的作用下 ,直接插入到 pGEM-T
Easy Vector中 ,并转化大肠杆菌 E .coli TG1.用含有氨苄青霉素(50
μg/mL)的 LB/ IPTG/X-gal培养基筛选转化菌 ,从平板上随机挑选了
36个白色菌落 ,用碱法抽提重组质粒 ,获得 17个有插入片段的阳性克
隆.对其中部分阳性克隆用 PCR法扩增 ,可以得到预计的 0.5 kb大小
的条带 ,进一步验证了阳性克隆所含的目的基因片段.因为目的基因
cDNA 片段近 3′端自带有一个 Nco Ⅰ酶切位点 ,在插入的 pGEM-T
Easy Vector 质粒上游的多酶切位点中也有一个 Nco Ⅰ位点 ,所以用
Nco Ⅰ酶切分析阳性克隆 pRMV16 DNA ,能切下 0.5 kb大小的片段;而用 Nco Ⅰ酶切阳性克隆 pRMV12
DNA则未能切下同样大小的片段.结果表明 ,含有目的基因片段的重组质粒 pRMV16和 pRMV12存在着
不同方向的插入片段.
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2.2　RMVsh CP 基因的 cDNA序列
对阳性克隆 pRMV16用通用引物 T7和 SP6为引物双向测序 ,得到的插入片段序列相同但方向相反
(Genbank/EMBL:AF185272);对反方向插入的阳性克隆 pRMV12以 SP6 和 T7为引物独立双向测序所
得的结果与 pRMV16相同.GCG 分析发现 ,在插入片段中存在一完整的阅读框架(ORF),以 AUG为起始
密码子 ,UAG 为终止密码子 ,长为 474 nt.包括起始氨基酸在内 ,编码 157个氨基酸 ,其中含有 5个甲硫
氨酸.
2.3　RMVsh CP 基因及蛋白质序列与类似病毒分离株的比较分析
RMV 上海分离株 CP 基因由 474个碱基组成 ,编码 157个氨基酸 ,计算机推测分子质量为 16.5 ku.
将该序列与已报导的侵染十字花科植物的 tobamoviurses各成员 CP 基因的核苷酸序列及氨基酸序
列[ 8 ～ 16]进行了比较.结果表明:RMVsh CP 基因与侵染十字花科的烟草花叶病毒另外 7个成员之间核苷
酸序列同源性在 83.5%～ 98.9%之间 ,其中与中国油菜花叶病毒(Chinese rape mosaic vi rus , CRMV)的核
苷酸序列同源性高达 98.9%(表 1).氨基酸序列同源性在 87.9%～ 99.4%之间(表 1).RMVsh的 CP 氨
基酸序列与CRMV之间仅在第 66位上有一个残基之差.RMVsh CP 氨基酸序列与其他分离株的差异集
中在CP 基因的两端及中间第 55 ～ 80位氨基酸序列上(图 2).CP 基因核苷酸序列与不能侵染十字花科植
物的烟草花叶病毒属成员之间的同源性仅在 44.5%～ 52.5%之间.
分别以 CP 基因核苷酸序列和氨基酸序列为参数进行的系统树分析显示了侵染十字花科的烟草花叶
病毒属病毒之间的关系(图 3).分析结果表明这些病毒可分为 2个亚组:一组以 RMVsh为代表 ,包括 CR-
MV ,TMV-Cg ,RMV-CAB和 Cr-TMV;另一组以 TuVCV 为代表 ,包括 TMV-Cr1.其中 RMV-US 在以核
苷酸序列为参数的系统树中 ,显然划归为第二亚组.在以氨基酸序列为参数的系统树中 , RMV-US似乎与
HRV(Holmes ribgrass virus)分离株共同组成另一个单独亚组.
表 1　侵染十字花科的烟草花叶病毒属成员外壳蛋白氨基酸和基因核苷酸序列的同源性比较
Tab.1　Comparison of the homology in the nucleotide and amino acid sequence of the coat pro tein
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　of different crucifer-tobamoviruses　　　　　　　　　　　　　
2.4　RMVsh CP 基因在E.coli中的表达及表达产物的鉴定
pRMV16经 Nco Ⅰ和 EcoR Ⅰ双酶切 ,回收纯化目的片段 ,重新插入到 pBAD/His-C 的相应位点中 ,
从而得到了 CP 基因的正确阅读框架的原核表达载体 pBRCP .转化 Top10菌株 ,在 LB液体培养基中培养
至对数生长期 ,加入 0.2 g/L 的 L(+)阿拉伯糖诱导.4 h后取样进行 SDS-PAGE电泳及Western blot 检
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测.电泳后染色结果显示 ,凝胶在 16.5 ku附近有一条特异性的蛋白带(第 40页图 4A),未经诱导的及空
质粒对照均没有发现相应的条带.用 RMVsh抗血清进行Western blot 检测结果见图 4B(第 40页).只有
该特异性条带及 TMV 外壳蛋白条带能和抗血清产生阳性反应 ,从而证实了所克隆的基因确实是 RMVsh
外壳蛋白基因.
图 2　烟草花叶病毒属 8 种病毒外壳蛋白推测氨基酸序列的比较
Fig.2　Alignment of deduced amino acid sequence of CP gene from 8 tobamoviruses
“ -”表示与 RMVsh相同的残基
图 3　几个侵染十字花科植物的烟草花叶病毒属成员的系统树分析
F ig.3　Phylogenetic trees of crucifer-infecting tobamoviruses
左图:以 CP 基因核苷酸序列为参数的系统树;右图:以 CP氨基酸序列为参数的系统树.
＊:图中数字如 97 , 98……等为亲缘关系指数(%)
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图 4　RMVsh CP 基因原核表达的 SDS-PAGE(A)及 Western blot(B)检测
Fig.4　SDS-PAGE and Western blot of prokaryo tic expression of RMVsh CP gene
(A)1.空载体不诱导;2.RMVsh外壳蛋白;3 , 4.pBRCP诱导;5.空载体诱导.
(B)1.RMVsh外壳蛋白;2.空载体诱导;3 , 4.pBRCP 诱导;5.TMV 外壳蛋白
3　讨　论
长叶车前花叶病毒上海分离株(RMVsh)是本室从上海郊区的青菜上分离得到的.对该病毒的 CP 基
因的克隆与测序表明 ,基因全长为 474个碱基 ,编码 157个氨基酸 ,是国内烟草花叶病毒属侵染十字花科
的病毒(Crucifer-tobamovirus)分离株 CP 基因序列的首次报道.原核表达的蛋白能与 RMVsh 抗血清反
应 ,表明所克隆的 CP 基因的表达蛋白与原来的完全一致.RMVsh 的 CP 基因与国外已报道的该类病毒
的CP 基因序列相比 ,核苷酸序列同源率为 83.5%～ 98.9%,外壳蛋白氨基酸序列的同源性为 87.9%～
99.4%.有报道将 tobamovirus中能侵染十字花科植物的分离株归为一个组群 ,以区别于不能侵染十字花
科植物的烟草花叶病毒[ 17 ,18] .我们进行的系统树分析表明 ,该组群的病毒分离物大致可分为 2个亚组:第
一亚组以 RMVsh 为代表 ,包括 CRMV 等;第二亚组以 TuVCV 为代表 ,包括 TMV-Cr1 等(见图 3).这在
以核苷酸序列和以氨基酸序列为参数的系统树分析中基本一致.只有 RMV-US 稍有不同 ,它在后者的系
统树中较为独立 ,有待更多的资料予以确定.
综上分析 ,根据目前的结果可以把 RMVsh 和 TuVCV 看成 Tobamovirus中侵染十字花科植物组群中
的 2种病毒.在 RMVsh与 CRMV的比较中发现 ,两者在核苷酸序列的同源性与推测的氨基酸序列的同
源性都是该亚组内最高的.CRMV 是西班牙的 Isabel Aguilar等在 1996 年报道的[ 10] ,他们只提到该病毒
材料来自中国 ,称中国油菜花叶病毒.依据原来报导的病毒分离物的生物学特性 ,我们猜测他们所用的材
料可能是或类似于 YMV15[ 6] ,但 YMV15从未见过序列报道.我们早期的研究将 RMVsh 与 YMV15进行侵
染性比较时发现 ,前者不能感染普通烟草(黄苗榆品种),后者能感染 ,并表现出系统花叶症状;前者能感染
长叶车前并表现系统花叶症状 ,后者也能感染长叶车前但表现为局部病斑[ 1] .RMVsh与 CRMV 的外壳蛋
白氨基酸序列只在第 66位有一个氨基酸的差异(图 2).上述分析表明 RMVsh与 CRMV显然是不同的病
毒分离株.已有实验表明 RMVsh CP 的 ly s残基经三硝基苯磺酸(TNP)修饰后 ,病毒便丧失了侵染青菜的
能力[ 3 , 4] ,而 TMV-U1株系 CP 基因上单一碱基改变也会导致其在烟草上症状的改变[ 19] .至于 RMVsh与
CRMV之间是否因一个氨基酸序列的差异即可引起感染性的许多变化尚待进一步研究 ,目前我们正在进
行的 RMVsh全基因组序列测定及感染性 cDNA克隆的构建 ,将为进一步研究该病毒的基因功能创造条
件.
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(下转第 46 页)
41第 1 期　　　　洪　军等:长叶车前花叶病毒上海株(RMVsh)外壳蛋白基因的克隆 、序列分析及原核表达
tains an open reading frame of 819 bp encoding a 272 residue polypeptide that includes a typical plant two-fingered
Cys2/His2 zinc finger mitif.Nor tern blot analy sis revealed that the expressed level of CS TZ in cotton seedling in-
creased in response to 220 mmol/ L NaCl treatment.CS TZ is highly expressed in leaves , roo ts , petals , and anthers ,
but with low expression in stigmas.
Keywords:cotton;salt tolerance;zinc finger pro tein;gene expression
～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～
(上接第 41 页)
Sequence Analysis of Coat Protein Gene of Ribgrass Mosaic
Virus Shanghai Isolate and Expression in E .coli
HONG Jun , ZHU Hong-qing , YERong , YU Shan-qian
(Department of Microbiology and Microbial Biotechnology , School of Li fe Sciences ,
Fudan University , Shanghai 200433 , China)
Abstract:An Shanghai isolate o f ribgrass mosaic virus(RMVsh)w as isolated from Brassica chinensis(Qingcai).Viral
RNA ex tracted from virus preparation was used as template fo r cDNA synthesis of coat protein gene by RT-PCR .PCR
products w ere purified with agarose gel and cloned into pGEM-T easy vector to construct the recombinant plasmid for
nucleotide sequencing.The coat protein CP gene consists of 474 nt encoding 157 amino acids.The CP gene was insert-
ed into pBAD/His-C vector and expressed in E .coli Top10 strain.The product was identified by SDS-PAGE and
Western blot with RMVsh antiserum.The homology of nucleotide and predicted amino acid sequences of CP gene with
those of o ther isolates of tobamovirus infecting crucifer were 83.5%-98.9% and 87.9%-99.4%, respectively.
RMVsh as a representative in first sub-g roup of Tobamovirus infecting cruciferae plants was discussed.
Keywords:ribg rass mosaic virus;coat protein gene;sequence analy sis;CP gene expression in E.coli.
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人类新基因的研究
余龙教授课题组应用基于“蛋白质的四种方式进化”的假设而设计的“四级同源筛选法” ,分
离和克隆到人类新基因 253条 ,已全部在 GenBank 登录 ,其中 90 条有潜在开发应用价值的基
因 ,已申报了中国发明专利 ,从中选出 6条有直接开发应用价值的基因 ,申报了国际 PCT 发明专
利.所克隆基因中 ,有 51个基因的组织表达谱 ,基因组结构 ,染色体定位等特征得到阐明.相关
论文已分别在 Genomics , Biochemical Journal , Gene等国际刊物上发表.
遗传工程国家重点实验室
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