全 文 ：[作者简介 ] 　钟秀茵(1972 - ),女 ,硕士 , 主管技师 ,主要从事微
生物检验工作。
【研究报告】
药用佛手柑酶水解条件的研究
钟秀茵1 ,黄晓钰 2
(1.广州市黄埔区疾病预防控制中心 ,广州　510700;2.华南农业大学 , 广州　510700)
[摘要 ] 　目的:研究纤维素酶水解药用佛手柑的最佳条件。 方法:通过正交实验方案测定不同酶解条件佛手柑的酶解
率 , 并比较酶解浆液的营养成分。结果:纤维素酶水解佛手柑的最佳条件为:T=60℃, pH =4. 5, S=8.0%, E /S =1.0%, t
=1. 5 h,此条件下酶解率可达 64.6%。所得的酶解浆液可溶性糖 、游离氨基酸总量 、黄酮等营养成分均比水浸出液及酸
解液高。结论:合适的酶解处理能较好地提高佛手柑的使用价值。
[关键词 ] 　佛手柑;纤维素酶;酶解
[中图分类号 ] 　R151.3　　　　[文献标识码 ] 　A　　　　[文章编号 ] 　1004 - 8685(2005)02 -0157 - 03
Enzymatic hydrolys is ofCitrus medica L. var. sarcodactylis(Noot.) sw ingle
Zhong X iu-y in1 , Huang X iao-yu2
(1.H uangpu Cente r for D isease Con tro l and P revention, Guangzhou 510700, Ch ina;2.South Ch inaAg ricu lture Unive rsity, Guan-
g zhou 510700, Ch ina)
[ Abstract] 　Objective:To seek an appropriate condition o f hydro ly sis o fCitrusm ed ica powder by ce llu lase.M ethods:Different
hydro ly tic ra te s through L16(45) experimenta lm ethod w ere compared, nutritions of hydro lysa te w ere a lso te sted.Resu lts:The ap-
propr ia te condition o f hydro ly sis o fCitrusm edica pow de rw as T=60℃, pH =4. 5, S=8. 0%, E /S=1. 0%, t=1. 5 h.Under this
cond ition, the hydro ly tic rate wa s up to 64. 6%.The enzym a tic hydro lysa te conta ined mo re solub le sugars, to tal am ino ac ids and
flavone s than those by acid hyd ro ly sis o rw a te r ex trac tion.Conclu sion:The m ed ica l va lue o fCitrus med ica can be we ll ra ised by
appropriate enzym atic hydro ly sis.
[ Keyw ords] 　Citrusm edica;Ce llulase;Enzym a tic hydro ly sis
　 　 佛 手 柑 是 芸 香 科 植 物 佛 手 ( Citrus m edica
L. var. sarcodacty lis(Noo t.) sw ing le)的果实。成熟的佛手柑外
皮鲜黄 , 果肉白色 , 果实气味芳香 、浓郁。它性温 , 味甘微辛 ,
具有理气化痰 、舒肝和胃的作用 , 是一种药用价值很高的果
实 , 在我国的广东 、广西 、福建 、云南 、四川等地均有栽培 1。
目前 , 我国佛手柑的贮藏加工普遍采用切片晒干制成佛
手柑片的方法 , 蒸馏佛手柑制成佛手柑露的方法虽有记载 [ 1] ,
但未见广泛应用于生产。 佛手柑含水量高 , 但果肉致密 , 果
胶 、纤维素等含量高 , 普通机械榨汁出汁率低 , 弃去的果渣有
效成分含量高 , 为充分利用佛手柑中的有效成分 , 本文对酶法
水解佛手柑进行了研究 ,得到营养丰富的酶解液 , 为加工多种
佛手柑产品提供理论依据。
1　材料与方法
1. 1　材料
60℃下烘干的佛手柑片经电磨机机械粉碎到 10目 ,备用。
1. 2　试剂
纤维素酶 , 中科院上海生化所生产 , 活力 >15000单位(以
滤纸法测酶活力);柠檬酸 , 市售食用级;其它所用化学试剂均
为市售分析纯。
1.3　主要仪器与设备
721W微机型可见分光光度计 ,岛津 LC - 6A型高效液相
色谱仪 , HHS -4型电热恒温水浴锅。
1.4　实验方法
1.4.1　佛手柑粉的酶水解　按 L16(45)的正交表设计配制不
同底物浓度的佛手柑粉悬浮液于三角瓶内 , 调水浴温度于所
需值 , 搅拌分散悬浮液 5 m in, 同时用柠檬酸或氢氧化钠调节
pH值至所需值 , 再加入一定量的酶进行水解 , 一定时间后升
温至 100℃并维持 5 m in以使纤维素酶失活。冷却后 ,得佛手
柑酶解液 , 测定酶解率。
1.4.2　酶解率的测定　取适量酶解液 , 用 DNS法 [ 2]测还原糖
生成量 , 将其生成量与佛手柑干粉纤维素含量之间的比率作
为佛手柑酶解率 [ 3] 。
1.4.3　可溶性糖的分离与分析 　采用高效液相色谱法
(HPLC)。色谱分离条件:HRC -NH2柱(150 mm ×4. 6 mm);
流动相乙腈 +水 (75 +25), 流速 0. 6 ～ 0.8 m l /m in;进样量
20 μl;示差折光检测器;室温下进行。
1.4.4　其它理化指标的测定均采用国标法。
2　结果与分析
2.1　酶促水解佛手柑最佳条件的选择
酶催化水解反应 , 受到 pH值 、温度及水解时间 、底物浓度
和酶 -底物浓度比 、金属离子等因素的影响。 必须确定适当
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的参数来满足较快水解的要求。本实验采用 L
16
(45)正交表 ,
以酶解率为指标 , 拟定出试验方案(表 1)来考察 5个因素对水
解的影响 , 结果如表 2,表 3。
表 1　酶解最佳条件试验因素水平表
水平 温度(℃) pH值 底物浓度(S%) 酶 /底物浓度(E /S)% 时间(h)
A B C D E
1 35 4. 5 2. 5 0.5 0. 5
2 45 5. 0 5. 0 1.0 1. 0
3 55 5. 5 6. 5 1.5 1. 5
4 60 6. 0 8. 0 2.0 2. 0
表 2　酶解正交试验设计表
表头
设计 A B C D E 试验结果
列号 1 2 3 4 5 Yik Yi Y i /4
1 1 1 1 1 1 7. 8 7. 5 8. 0 8. 7 32. 0 8.0
2 1 2 2 2 2 19. 018. 619. 520. 577. 619.4
3 1 3 3 3 3 27. 325. 225. 725. 0103.225.8
4 1 4 4 4 4 34.6 35.4 36.0 33.2139.234.8
5 2 1 2 3 4 32.0 34.0 36.1 33.8135.934.0
6 2 2 1 4 3 27.2 32.3 31.0 29.5120.030.0
7 2 3 4 1 2 42.6 40.0 37.1 38.4158.139.5
8 2 4 3 2 1 30.4 33.1 36.3 34.0133.833.5
9 3 1 3 4 2 55.4 49.6 52.0 51.5208.552.1
10 3 2 4 3 1 53.7 56.1 52.2 54.3216.354.1
11 3 3 1 2 4 41.2 43.4 36.0 45.1165.741.4
12 3 4 2 1 3 34.0 33.3 37.7 35.8140.835.2
13 4 1 4 2 3 68.0 60.4 63.1 66.9258.464.6
14 4 2 3 1 4 54.9 60.3 63.6 57.0235.859.0
15 4 3 2 4 1 65.5 62.8 60.0 61.7250.062.5
16 4 4 1 3 2 61.3 59.2 56.1 63.7240.360.1
Ⅰ 352. 0 634.8 558.0 566.7 632. 1
Ⅱ 547. 8 649.7 604.3 635.5 684. 5
Ⅲ 731. 3 677.0 681.3 695.7 622. 4
Ⅳ 984. 5 654.1 772.0 717.7 676. 6
R i(×106) 1. 928 1. 711 1. 737 1. 724 1. 713
Si 13605.5 57.3 1647.2 860 182.5
　　G=∑ Yi=2615.6;CT =G 2 /nm =106896. 3;S总 =∑ Y ik2 - CT=
16631. 8;S总 1=16352. 5;Se=S总 - S总 1=279. 3;R i=Ⅰ 2 +Ⅱ 2 +
Ⅲ 2 +Ⅳ 2;S i=Ri /16 - CT
表 3　酶解方差分析表
方差来源 离差平方和 自由度 均方和 F值 显著性
A(T℃) 13605. 5 3 4535. 2 779. 2 **
B(pH) 57. 3 3 19. 1 3. 3 *
C(S%) 1647. 2 3 549. 1 94. 3 **
D(E /S)% 860. 0 3 286. 7 49. 3 **
E( t) 182. 5 3 60. 8 10. 5 **
Se 279. 3 48 5. 82
　　F0.05(3, 48) =2. 80;F0.01(3 , 48) =4. 22
从表 3可以看出 , 在所选择的影响酶解率的 5个因素中 ,
其影响程度大小为:温度 >底物浓度 >酶 /底物浓度比 >时间
>pH值。
由表 2的趋势可知 , 随着温度的升高 , 酶解率明显增加 ,
因为温度过低酶的活性不能得到充分发挥 , 但温度过高酶被
部分钝化甚至严重钝化 , 活性也会下降 , 在本研究的预试验中
同时还测定了 65℃、 70℃ 时的酶解率 , 发现当温度达 65℃
时 , 酶解率已稍有下降 , 70℃ 时的酶解率比 60℃ 时下降
30%。由正交试验可知这种纤维素酶制剂的合适处理温度为
60℃。此外 ,底物浓度 、酶 /底物浓度比 、酶解时间 、 pH值都不
同程度地影响着酶解率 , 除了 pH值的影响为显著外 , 其它几
项的影响都为极显著。从分析中可知 , 酶解佛手柑比较理想
的工艺参数为:温度 60℃;底物浓度 8.0%;时间 1. 5 h;酶 /底
物浓度比 1. 0%;pH值 4.5, 应用该组参数酶解佛手柑 ,酶解率
可达 64. 6%。
2.2　佛手柑酶解液的营养成分分析
2.2.1　取最佳酶解条件下的佛手柑酶解液与相同条件下的酶
液及佛手柑干粉水浸出液 、2 mo l /L盐酸酸解液营养成分进行
比较 , 结果见表 4。
表 4　佛手柑粉酶解液 ,水浸液 ,酸解液及酶溶液营养成分比较
(单位:m g /m l)
处理 还原糖 纤维素 V c 黄酮 游离氨基酸总量
酶溶液 4. 1 / / / 0. 024
酶解液 31. 6 6. 4 0.233 1. 05 1. 084
水浸液 21. 0 10. 8 0.205 0. 80 0. 896
酸解液 26. 1 7. 0 0.155 0. 65 0. 940
结果表明佛手柑酶解后 , 可溶性糖 、Vc、黄酮 、游离氨基酸
含量比水浸出液 、酸解液高 , 其原因主要是酶的作用 , 使佛手
柑细胞壁裂解 , 并使部分不溶性多糖水解为单糖 , 因而可溶性
糖含量增高;细胞壁内的 Vc、氨基酸等成分随着细胞壁的裂解
游离出来而含量上升。
2.2.2　佛手柑酶解液的可溶性糖成分　应用高效液相色谱法
分离了佛手柑酶解液和佛手柑干粉水浸出液的可溶性糖成分
(图 1,图 2), 并与标准糖色谱图(图 3)相比较 , 结果见表 5。
图 1　佛手柑酶解液可溶性糖类的分离
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表 5　佛手柑酶解液与水浸出液的可溶性糖鉴定结果
糖种类
标准糖溶液
保留时间
(m in)
浓度
(mg /m l)
佛手柑水浸出液
保留时间
(min)
浓度
(mg /m l)
佛手柑酶解液
保留时间
(m in)
浓度
(mg /m l)
鼠李糖 4. 022 1 4. 048 0. 39 4.058 0. 82
果糖 5. 192 1 5. 225 0. 84 5.233 0. 76
葡萄糖 5. 620 1 5. 640 0. 35 5.635 0. 93
未知糖 / / / / 6.232 未知
蔗糖 6. 922 1 6. 940 0. 05 6.952 微
麦芽糖 7. 700 1 7. 665 0. 09 7.690 0. 15
乳糖 8. 398 1 / / / /
蜜二糖 9. 943 1 9. 954 微 9.967 微
总量 1. 72 2. 66
　　结果(表 5)表明 , 佛手柑经纤维素酶处理后 , 可鉴定出的
可溶性糖总量明显高于来经酶处理的对照液 , 其中葡萄糖含
量升高尤为显著。 在酶解液色谱图上出现一个新的峰 , 由于
缺乏相应的糖标样 , 未能确定该峰是何种糖分 , 但根据纤维酶
作用机理 [ 4]及其保留时间 , 推测此糖可能是纤维二糖。
酶解液中鼠李糖 、麦芽糖含量也增多 , 由于是市售的纤维
素酶 , 一般均混有少量的半纤维素酶 、淀粉酶和蛋白酶 [ 4] , 酶
的作用使细胞壁分解 , 存在于细胞壁中的鼠李糖被释放出来
而引起含量上升;淀粉酶的存在则使淀粉水解产生麦芽糖和
葡萄糖等 , 从而使这些成分的含量都比空白水浸出液高。
在实验中发现酶解液的果糖含量比对照液稍低 , 原因可
能是吡喃型结构的葡萄糖比呋喃型结构的果糖稳定 , 在 pH
4.5的溶液中 , 部分果糖转变为葡萄糖的缘故。
3　小结
酶法液化果蔬技术应用渐广 , 本研究经多次试验探索出
纤维素酶水解佛手柑的较佳工艺为:温度 60℃, pH值 4. 5, 底
物浓度 8.0%, 酶 /底物浓度比 1. 0%,时间 1.5 h, 此条件下酶
解率达 64. 6%。
所得酶解浆液可溶性糖 、黄酮 、游离氨基酸等营养成分均比
未酶解前高 ,且浑浊度均匀 ,适用于加工多种佛手柑保健产品。
[参考文献 ]
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1994. 530 -534.
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出版社 , 1995. 9 - 11.
[ 3] 陈惠忠 .同时酶解发酵(SSF)转化造纸厂废细小纤维为酒精 [ J] .
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[ 4] 相尺孝亮(日), 等著 ,黄文涛 ,胡学智 , 译 .酶应用手册 [M ] .上
海:上海科学技术出版社 , 1989.214 - 215.
(收稿日期:2004 -09 - 09)
(上接第 150页)
(见图 5), 选择 CID为 0.75 V, 其主要碎片离子为 m /z:91
[ C7H7] +和 m /z:148[ M -C6H5] +, 这与 6 - BA标准的同等条
件下的二级质谱数据也完全吻合。结果表明 , 豆芽中干扰物与
6 -BA已获得了完全的分离 ,得到的色谱峰具有高度的专属性。
图 4　 6 - BA的一级质谱图
图 5　 6 - BA的二级质谱图
3　结论
应用 RP -HPLC法测定豆芽中 6 -苄基腺嘌呤残留量具
有灵敏度高 、精密度和准确度好等优点 , 可作为豆芽中 6 -苄
基腺嘌呤残留量分析的检测方法。
(致谢:本工作得到宁波市贸易局 、宁波市农业局和宁波市技
术监督局标准处的大力支持。)
[参考文献 ]
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