全 文 ：侵染花椰菜的芜菁花叶病毒及 RT-PCR
扩增外壳蛋白基因研究*
许建平　李德葆
(浙江农业大学生物技术研究所 , 杭州 310029)
提要　从杭州市郊区及本校附近菜园地表现严重花叶症状的花椰菜上分离到一种线状病毒 ,接种 6
科 31种鉴别寄主 ,能侵染 5科 22种植物。病组织超薄切片可见风轮状内含体和片层聚集状内含体。
感病的芥菜叶片 ,用 0. 5 mo l / L磷酸钾缓冲液 ( pH 7. 5)匀浆后汁液加 4% PEG-8000沉淀 3 h, 5% ～
40%甘油梯度离心纯化病毒 ,可获得较高的产量。 提纯的病毒均为一弯曲的线状颗粒 ,长度 740 nm
左右。病毒提纯液于 264 nm处有一吸收峰 ,为典型的核蛋白紫外吸收。 TuMV-H分离株抗血清包被
的铜网能大量吸附病毒颗粒。 用特异的 PCR引物扩增其外壳蛋白基因 ,可得 - 0. 9 Kb的片段。
关键词: 　芜菁花叶病毒　花椰菜　外壳蛋白基因
芜菁花叶病毒 ( Turnip Mosaic Virus, TuMV )是十字花科作物上的重要病原 ,它的寄主范围
很广 ,可侵染 20余科 202种植物。我国江浙一带发生普遍。1941年 ,凌立和杨演首先报道四川油
菜上发生的花叶病由 TuMV引起的 ,此后许多学者对该病毒进行了深入研究 [1～ 8 ]。 各研究者所
获得的分离株在形态、血清学、寄主范围、理化性质上都有一些差异。
我们从杭州市郊区及本校附近菜园地表现严重花叶症状的花椰菜上分离到一种线状病毒 ,
经鉴别寄主鉴定 ,电镜观察、血清学特性及 RT-PCR扩增其外壳蛋白基因的研究 ,将该病毒鉴定
为芜菁花叶病毒。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　毒源　从杭州市郊区及本校菜园地表现严重花叶症状的花椰菜病株上分离所得 ,单斑分
离纯化后 ,保存在土油菜和榨菜上 ,定名为 HY分离株。
1. 1. 2　抗血清　 TuMV-H分离株 [8 ]的抗血清为本所陈集双老师提供 ,环状沉淀法效价为 1∶
20000以上。 HY分离株抗血清 ,环状沉淀反应测得的效价为 1∶ 1024, CMV, TMV抗血清均为
本所保存。
1. 1. 3　供试鉴别寄主　普通鉴别寄主为本所保存。黑龙江省农科院园艺所刘栩平先生馈赠部分
十字花科作物鉴别品种。
1. 1. 4　试剂　 Taq DN A聚合酶和 MMLV反转录酶为 Promega公司产品 ,其它试剂为国产分
析纯试剂和 Sigma产品。
1. 2　方法
　　* 浙江省科委资助项目
收稿日期: 1997- 03- 31
植 物 病 理 学 报　　　　　 AC TA PHYTO PATHOLOGIC A SIN ICA　　　　　 1998. 28( 2): 151～ 157
1. 2. 1　病毒的提纯　病叶 100 g于- 20℃冰冻 20 min后 ,于 100 ml 0. 5 mo l /L ( pH 7. 5)磷酸
钾缓冲液 (内含 0. 1%巯基乙醇 , 2% Tri tion X-100, 0. 01 mol /L EDT A)匀浆 ,加入 10%氯仿 /正
丁 醇 ( 1∶ 1)继续匀浆 1～ 2 min,经双层纱布过滤后 ,于 4℃下 8000 g 离心 10 min取上
清液 , 78000 g离心 100 min取沉淀 ,沉淀悬浮于 0. 02 mol /L磷酸钾缓冲液后 , 5% ～ 40%甘油梯度
78000 g离心 2 h取沉淀 ,沉淀悬浮于 3 m l左右的 0. 02 mo l /L磷酸钾缓冲液中即为提纯的病毒。
1. 2. 2　超薄切片 ,免疫电镜　参考文献 [9 ]的方法。
1. 2. 3　病毒 RNA的提取　按常规方法 ,见参考文献 [10]。
1. 2. 4　 PCR引物设计及反应条件　引物 1. 5′-GCGTCGACCATGGCAGGTGAAACGCT TG-
3′,引物 2. 5′-TGTCGACT TT ATTCCCGGGTCA TAACCCCT GAACGC-3′。反应条件为: RN A
与引物 1退火后 ,常规方法反转录为 cDN A,取 2μl为模板 ,进行 PCR反应。反应体系按试剂盒
提供的方法配制。 反应条件为: 94℃变性 45 s, 45℃退火 45 s, 72℃延伸 60 s。反应共进行 30轮
循环。 PCR产物在 1%琼脂糖凝胶上电泳分离。
2　结　果
2. 1　寄主范围的测定
HY分离物接种 7科 31种植物 ,其寄主范围如表 1所示 ,主要症状如图 1所示。
图 1　病毒接种于部分鉴别寄主的症状
Fig . 1　 The symptoms of Turnip Mosaic V irus-HY isolate infected plants
1花椰菜上的系统花叶症状　 2病毒接种于假酸浆后形成的枯斑　 3病毒接种于 C2不结球白菜上的系统花叶
1 Th e sys temic mosaic of Brassica oleracea var.botryti s　 2 Th e local lesions of N icandra pbysalodes
3 Th e sys temic mosaic of Brassica cbinensis cv. C2
　　由图 1和表 1可知 ,该分离物对十字花科的花椰菜、芜菁、甘蓝型油菜等叶表具有一层蜡质
的植物 ,具有较强的侵染力。而对广为栽培大白菜品种如城青二号、早熟五号等致病力比较弱。心
叶烟侵染后形成系统枯斑 ,而后叶脱落 ,但并不使植株矮化。
2. 2　病毒的浓度及粒体特性
按上述方法提纯的病毒其产量为 7 mg /100 g病叶。
提纯的病毒呈典型的核蛋白 UV吸收峰 (图 2) ( Simudo zu UV-2201) ,在 264 nm左右处吸
收值最高。纯化的病毒经 3%磷钨酸负染 ,电镜下可见大量弯曲的线性颗粒 (图 3)。随机测量 100
个病毒的颗粒长度 ,多数集中于 700～ 760 nm,宽约 12 nm左右 ,尤以 740 nm长为主。
152 植　　物　　病　　理　　学　　报 28卷
表 1　 TuMV-HY分离株的寄主范围及症状
Table 1　Host range and symptoms of TuMV-HY isolate
科
Fami ly
中文名
Ch inese name
学名
Latin name
反应类型
Reaction type
茄科 心叶烟 Nicotiana glut inosa LA /SN. L R
(Solanaceae ) 黄苗榆 N . tabacum var. huangmiaoyu LN /-
德烟 N . debneyi LN /-
克利夫兰烟 N . cleveland ii LN /SN
辣椒 Capcicum annum - /-
番茄 Lycop ersicum eaculentum - /-
蔓陀罗 Datura st ramon ium - /-
假酸浆 Nicandra physalod es LN- LD /-
龙葵 Solanum nig rum - /-
十字花科 花椰菜 B rassica oleracea var.botrytis LA /SM. Y. VC
(Crucif erae) 法国花椰菜 B .oleraoea v ar.botryt is SYS /SM. V C
甘蓝型油菜 B . napus LA /SN. C
早熟五号大白菜 B . pekinensis cv. zh aosh u no. 5 LA /LA
城青二号大白菜 B . pekinensis cv. ch ungu n no. 2 - /-
芥菜 B . juncea LA /SYS. SM
油冬儿 B . cbinensis LA /SM
土油菜 B . cbinensis LA /SM
秦白 1号大白菜 B . cbinensis cv. qunbai no. 1 LA /LA
C2不结球白菜 B . cbinensis cv. C2 LA /SM
山东菜籽芜菁 B . rapa LA /SYS
萝卜 Rapbanus sa tivus LA /LA
藜科 苋色藜 Cbenopod ium ama ranticolor LN /-
(Cbenopod iaceae) 昆诺藜 C . quinoa LN /-
灰藜 C .album LA /SN
菠菜 Spina cia oleracea LA /SM
葫芦科 黄瓜 Cucum is sativus - /-
(Curcurbitacea )
番杏科 番杏 Tetragonia expansa CS /-
( Aizoaceae)
豆科 蚕豆 Vicia faba LN /-
( Legum inosae) 大豆 Glycine max - /-
菜豆 Pbaseolus vulga ris - /-
豌豆 Pisum sat ivum - /-
　　注:接种叶症状 /新生叶症状 ; M:花叶 ; LN:局部坏死斑 ; SM:系统花叶 ; SN:系统枯斑 ; C S:局部褪绿斑 ; LR:卷叶 ; SY S:系
统黄斑 ; VC:明脉 ; C:皱缩 ; Y:黄化 ; LD:落叶 ; LA:隐症带毒 ; - :无症不带毒
Note: Sym ptoms of inoculated leaves /Symptom s of new leaves: M: Mosaic; LN: Local necrosis; SM: Systemic m osaic; SN:
Sys temic n ecrosi s; CS: Local chlorosi s; LR: Leaf curl; SYS: Sys temic yel low spo t; V C: V ein cleaning; C: Crink le; Y:
Yel lowing; LD: Leaf dropping; L A: Latent; — : Non-infection
2. 3　病组织的超薄切片观察
感病的花椰菜病组织超薄切片后 ,电镜下可见 Po tyvi rus属病毒所特有的风轮状内含体和
长直片层聚叠体类型细胞质内含体。 同时在细胞质中还有病毒颗粒的存在 (图 4)。
2. 4　病毒的血清学特性
纯化的病毒经 Freund s不完全佐剂乳化后 ,免疫家兔 ,获得抗血清效价为 1∶ 1024。纯化的
病毒直接包被酶标板后 ,分别与 CMV、 TMV、 TuMV-H分离株和 TuMV -HY分离株的抗血清
进行 ELISA反应 , PB缓冲液为负对照 , TuMV-H分离株为正对照。反应结果见表 2。 TuMV-H
分离株抗体包被铜网后 ,直接用含有 TuMV-HY分离株的病叶粗提液进行吸附 , 3% PT A染色
1532期 许建平等:侵染花椰菜的芜菁花叶病毒及 RT-PC R扩增外壳蛋白基因研究
后 ,电镜下观察到较多的病毒颗粒。
　　综合上述的研究结果认为 ,从花椰菜上分离到的线状病毒属于芜菁花叶病毒的一个分离物。
图 2　提纯的病毒紫外吸收图
Fig. 2　 The UV-abso rbent of
purified vir us o f HY-isolate
图 3　病毒的形态 ( 3%磷钨酸负染 60K× ,标尺: 100 nm)
Fig. 3　 Vir al pa rticles, negativ e stained by 3% PTA ( 60K
× , ba r: 100 nm)
图 4　感病的花椰菜超薄切片 ,示病毒粒子及风轮状内含体 ,标尺: 100 nm
Fig. 4　 Virus pa rticles and pin-w heel inclusion bodies showing in ultra thin sec tion o f
diseased cauliflow er tissue, Bar: 100 nm
表 2　提纯病毒的 ELISA反应结果
Table 2　 The results of ELISA reaction of purif ied virus
病毒
Virus
血清种类 Types of ant ibody
TuMV-HY TuMV-H TMV CMV
TuMV-HY 　　　 1. 54* 1. 47 0. 32 0. 31
TuMV-H 1. 38 1. 71 0. 27 0. 26
2. 5　外壳蛋白基因的扩增
提纯的病毒 RNA与 PCR3′端引物退火后 ,经 MM LV反转录酶合成 cDN A,取 2μl为模板 ,
经过 30轮的 PCR反应 ,可扩增出一条 0. 9 Kb的 DNA片断 (图 5)。并与所预计的大小一致 ,说
明该分离物是属于 TuMV的一个分离物。
154 植　　物　　病　　理　　学　　报 28卷
图 5　 PCR扩增 TuMV-HY分离株外壳蛋白基因
Fig. 5　 The results o f PCR amplification of TuMV-HY coat
pro tein gene
M:标准分子量 (λDN A/ HindⅢ + Eco RⅠ ) , 1. PCR产物
M: Marker,λDN A/ HindⅢ + EcoRⅠ , 1. Th e PCR product
3　讨　　论
关于芜菁花叶病毒的报道已经很多 ,除十字花科作物上的分离物外 ,还从蚕豆 [6 ]、芝麻 [7 ]等
豆科作物上分离到该病毒。国内许多学者从十字花科作物上分离到该病毒还主要局限于大白菜、
油菜、青菜等作物。 除西北农业大学植保系在西安地区的花椰菜上检测到 TuMV,朱培坤等用
ELISA方法在花椰菜上检测到该病毒外 ,还没有文献比较详细地研究它在花椰菜上的致病力以
及与其它来源的病毒之间的差异。因而详细地研究花椰菜上 TuMV的分离物 ,显得十分重要。该
病毒与其它文献上所报道的 TuMV寄主范围之差异见表 3所示。
从表 3可以看出 TuMV-HY分离株与国内其它已知分离株相比 ,在寄主症状变化上既有一致
性 ,又有特殊之处。除个别分离株外 ,它们在茄科、藜科、豆科等寄主上的侵染范围基本一致。 TuMV-
HY分离株在油菜上为系统枯斑 ,菠菜为系统花叶 ,而蚕豆上则为局部枯斑。 尤其在十字花科寄主的
致病力上有较大的差异 , TuMV-HY分离株对叶表面具有一层腊质的花椰菜、甘兰型油菜、芜菁等寄
主是有强致病力的 ,而对大白菜、萝卜等常见的寄主植物是不致病或者是致病力相对较弱的。 尤其值
得指出的是 TuMV-HY分离株很容易回接到花椰菜上 ,而城青二号大白菜却不受其侵染 ,早熟五号
大白菜又是无症带毒 ,这和其他许多来源于十字花科植物上的 TuMV有较大的区别 ,也与本所保存
的 TuMV -H分离株有较大的差异。显示了不同来源 TuMV的多样性。因而深入研究各分离株之间
的区别 ,尤其是由于致病基因的某些差异 ,而导致的致病力的变化 ,可以为我们提供防治病害的手段
和措施。
　　 TuMV侵染植物后引起细胞的病变 ,在病变的细胞中 ,可以明显地看到 Po tyv irus组病毒侵
染植物后引起的典型的风轮状内含体 ,它不仅有卷轴状 ( Tubula r scroll-like)的卷曲 ,而且还可
以清晰地看到直而粗的片层聚集体 ( Lamina ted agg regates) ,在分类上属第 3亚组的形态 ,只是
其片层聚集体并不很长 ,而且在末端稍有卷曲 ,比文献中记载的长度要短 ,而且弯曲度要小。
线状病毒在提纯过程中最主要的问题是病毒不可逆的积聚 ,致使在提纯过程中损失太多而使提
纯的产量下降。 在提纯过程中我们用 5%～ 40%浓度的甘油梯度来提纯 ,能获得较好的提纯效果。
1552期 许建平等:侵染花椰菜的芜菁花叶病毒及 RT-PC R扩增外壳蛋白基因研究
表 3　 TuMV-HY与其它国内 TuMV分离株寄主范围比较
Table 3　 The Comparison of host range with other TuMV isolates
寄主
Hosts
病毒分离物 TUMV isolates
白菜孤丁
病毒 [1] TuMV58
[2 ]
黄斑型毒
株 [3 ] 萝卜 29
[4]
崇明大白菜
分离株 [5]
蚕豆分离
物 [6] Dne-1
[7]
TuMV-HY TuMV-H
[8]
芜菁 SM SM SM SM SY S SM
Brassica rapa
花椰菜 0 SM. VC. Y VC
B.oleracea var. botrytis
大白菜 SM SM SM LA SM
B. pekinensis cv. Zhaoshu no. 5
白菜 SM SM SYS
B. cbinensis
芥菜 SM SM SM. SY S SM
B. juncea
油菜 SN SM SM SM SM SN. C SM
B. cbinensis
萝卜 SM SM SM SM 0 Y. D LA SM
Rapbanus sativus
黄苗榆 LN LN LN 0 0 LN 0
N icotiana taba cum var. huangmiaoyu
心叶烟 SN SN 0 SN 0 0 SN 0
N icotiana glutinosa
番茄 0 0 0 0 0 0 0
Lycopersicum eaculentum
蔓陀罗 0 0 0 0 0 0 0
Datura stramonium
番杏 LN 0 CS CS
Tetragonia expansa
黄瓜 SN 0 0 0 0 0 0 0
Cucumis sativus
菜豆 0 0 0 0
Pbaseolus vulgaris
菠菜 SN SN 0
Spinacia oleracea
辣椒 0 0 0 0
Capcicum annum
苋色藜 LN LN SM CS LN LN
Chenopodium amaranticolor
昆诺藜 LN /S C SM CS LN LN
C. quinoa
蚕豆 SM CS LN 0
Vicia faba
　　注: SN:系统枯斑 ; SM:系统花叶 ; V C:明脉 ; CS:局部黄斑 ; YS:系统黄化 ; LN:局部枯斑 ; Y. D:黄化、矮缩 ; LA:隐症带毒; 0:不侵染 ,空格为未做本实验。
N ote: SN: Sys temic necrosis; SM: Sys temic mosaic; V C: V ein cleaning; CS: Local chlorosis; YS: Sys temic yellowing; LN: Local necrosis; Y. D: Yellowing dwarf; LA:
Latent; O: N on-infection; Blank: Did n t tes t
　　许多文献研究报道 TuMV的病毒颗粒长度在 720 nm左右 ,也有报道病毒颗粒长度在 760
～ 800 nm之间 [ 6]。而 TuMV -HY分离株病毒颗粒长度大多在 700～ 760 nm间 ,尤以 740 nm长
度为主 ,显然属于马铃薯 Y病毒组 ,然而众多文献报道其长度的差异 ,可能是由于各分离株的来
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源及分离地点差异或是各种测量方法的差异所致。 在病毒颗粒的分布图中 ,有些病毒颗粒较短 ,
也有的比较长 ,这可能是在提纯过程中病毒粒子断裂或者连接较长的病毒颗粒所致。
病毒的血清学反应和免疫修饰电镜研究表明 ,该病毒与 TuMV -H分离株之间有血清学反
应 ,对此还需要进一步深入研究。
参　考　文　献
[1 ]　裘维蕃等 , 1957.植物病理学报 , 3( 1): 31～ 44
[2 ]　王拱辰 , 1978.微生物学报 , 18( 4): 298～ 309
[3 ]　沈淑琳等 , 1965.植物保护学报 , 4( 1): 35～ 43
[4 ]　李德葆等 , 1964.植物保护学报 , 3( 2): 155～ 168
[5 ]　徐来升等 , 1983.植物病理学报 , 13( 2): 21～ 29
[6 ]　许志刚等 , 1985.南京农业大学学报 , ( 4): 42～ 48
[7 ]　杨书军 , 1992.首届全国中青年植物保护工作者学术讨
论会论文集 .北京:中国科学技术出版社 , 18～ 26
[8 ]　陈集双等 , 1994.中国油料 , 16( 1): 24～ 28
[9 ]　林钧安等主编 , 1989.实用生物电子显微术 .沈阳: 辽宁
科学技术出版社
[10 ] 许建平等 , 1994.浙江农业大学学报 , 20( 4): 363～ 368
IDENTIFICATION AND AMPLIFICATION OF COAT PROTEIN GENE OF
AN ISOLATE OF TURNIP MOSAIC VIRUS INFECTED CAULIFLOWER
Xu Jianping　 Li Debao
( Insti tute of biotechnolog y Zh ejiang Agricultural University, Hang zh ou 310029)
More than 20 samples of cauli flow er leaves w ere collected f rom the campus of Zhejiang A-
g ricultural Univ ersi ty and the suburb o f Hang zhou ci ty, mo st of them were caused by turnip
mosaic vi rus based on their symptoms, ho st range, vi rion characteristics, inclusion bodies, sero-
logical test and ampli fica tion of it s coa t pro tein gene. The HY-iso lates w as obtained from natu-
ral infecting caulif low er show n serious mosaic, yellowish, and vein clean in the fields w as identi-
fied. The vi ral par ticles in crude sap and puri fied so lution w ere long flexuous rod wi th a mean
leng th of 740 nm. It could infect 22 indica ting plant species belonging to 5 fami lies. The antisera
o f CMV , TMV and TuMV-H isolates w ere used in the serolog ical test. Many vi rions w ere
t rapped by the antisera of TuMV-H under immunoso rbent elect ron microscopy ( ISEM ). Typi-
cal pin-wheel inclusion bodies such as tubular scroll-like and laminated agg rega tions w ere found
in ult rathin section of diseased tissue. The vi rus w as purified f rom homogenized o f infected B.
juncea leav es in 0. 5 mol /L KPB ( pH 7. 5) containing 0. 1% mercaptoethanol, 2% Trition X-
100 mol /L and 0. 01 mol /L EDT A. Af ter precipi ta tion by 4% PEG-8000, high vi rus yield mo re
than 7 mg per 100 g ram diseased leaves could be purified by using 5% ～ 40% g lycerine g radi-
ents fo r centrifug ation. Using the v iral RN A as the templa te, the coa t protein could be ampli fied
by PCR.
Key words: Turnip mosaic vi rus　 Immunoso rbent electron microscopy ( ISEM )　 Ultra-
st ructure　 cauli flower　 Coat pro tein gene
1572期 许建平等:侵染花椰菜的芜菁花叶病毒及 RT-PC R扩增外壳蛋白基因研究