全 文 ： 2011, Vol. 32, No. 14 食品科学 ※工艺技术134
苦丁茶多酚的提取及抗氧化活性
刘 佳，焦士蓉 *，唐远谋，唐鹏程，冯 慧
(西华大学生物工程学院，四川 成都 610039)
摘 要：对苦丁茶中多酚的提取及抗氧化活性进行研究。通过单因素和响应面试验可知，在乙醇体积分数 52%、
料液比 1:24(g/mL)、提取时间 62s、微波功率 291W条件下可获得最高的提取量 115.40mg/g。苦丁茶多酚提取液对
DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的半清除质量浓度以及对脂质过氧化的半抑制质量浓度分别为 29.24、
34.14、872.3、11.48mg/L。表明苦丁茶多酚具有较强的抗氧化作用。
关键词：苦丁茶；多酚；提取；响应面分析法；抗氧化
Extraction and Antioxidant Activity of Polyphenols from Kuding Tea
LIU Jia，JIAO Shi-rong*，TANG Yuan-mou，TANG Peng-cheng，FENG Hui
(School of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China)
Abstract ：The optimal conditions for the extraction of Kuding tea polyphenols for achieving maximum extraction yield were
determined by response surface methodology to be ethanol concentration of 52%, material/liquid ratio of 1:24 (g/mL), micro-
wave power of 291 W, and microwave treatment time of 62 s. The extraction rate of polyphenols was 114.82 mg/g under the
optimal extraction conditions. The IC50 values of the obtained extract against DPPH, hydroxyl, superoxide anion ion free radicals
and lipid peroxidation were 29.24, 34.14, 872.3 mg/L and 11.48 mg/L, respectively, suggesting that Kuding tea polyphenols have
a remarkable antioxidant effect.
Key words：Kuding tea；polyphenols；extraction；response surface analysis；antioxidant
中图分类号：TS272.2；TS272.5 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)14-0134-05
收稿日期：2010-09-19
基金项目：四川省教育厅自然科学重点项目(09ZA158)；西华大学 2008校人才培养与引进科研项目(R0920501)
作者简介：刘佳(1987—)，女，硕士研究生，研究方向为食品营养与安全。E-mail：liujia13568864205@163.com
*通信作者：焦士蓉(1968—)，女，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：jsrong2004@163.com
“苦丁茶”是我国一大类代茶植物或代茶产品的统
称。冬青属苦丁茶主要产于我国南部及西南部地区，是
民间传统的药用植物。据文献报道，苦丁茶有防治心
脑血管系统疾病、降低血压、降脂、抗氧化等药理保
健作用[1 ]，其粗提物均有不同程度的抑菌作用[2 ]。由苦
丁茶冬青叶片制成的苦丁茶是民间常用中草药，是传统
中成药“甘和茶”的主要原料之一[ 3 ]，含有丰富的黄
酮、多酚、三萜类皂甙及金属元素[ 4 -5 ]，所含的各种成
分的药理作用及保健功能日益引起人们的关注[6]，具有
广阔的开发应用前景[7 ]。
本实验采用响应面法，以苦丁茶冬青树 ( I l e x
Kudincha C.J.Tseng)叶片中的多酚含量作为响应值，对
苦丁茶多酚的提取工艺进行探讨，旨在得到最优工艺条
件，并通过几个方面研究苦丁茶多酚的抗氧化性能，为
苦丁茶保健成分的开发利用提供一定参考。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
苦丁茶(市售)粉碎过 80目筛；福林 -酚试剂 北京
奥博星生物技术有限责任公司；DPPH自由基 美国
Sigma公司；2-硫代巴比妥酸 上海科丰化学试剂有限
公司；其他常见试剂(分析纯) 成都科龙化工试剂厂。
TB-214型电子天平 美国丹佛仪器设备厂；HH-S
型数显恒温水浴锅 金坛市金城国胜实验仪器厂；UV-
2600型紫外可见分光光度计(配有玻璃比色皿) 上海尤尼
柯仪器有限公司；MP17C-KE家用微波炉 美的集团。
1.2 方法
1.2.1 多酚提取方法
称取苦丁茶粉样品2g，采用不同的提取溶剂，分别探
究提取时间、料液比、微波功率因素对多酚得率的影响。
135※工艺技术 食品科学 2011, Vol. 32, No. 14
1.2.2 多酚提取量测定
采用福林 -酚比色法[7-8]，以没食子酸为标准品，标
准曲线 y=0.0081x＋ 0.0286，R2=0.9999，计算公式为：
　　
C× v× n
p=——————
　　 m× 10
3
式中：p为总多酚类物质提取量 /(mg/g)；c为从回
归方程计算得到样品中多酚类物质质量浓度 /(μg/mL)；
v 为苦丁茶溶液的体积 /mL；n 为稀释倍数；m 为茶粉
质量 / g。
1.2.3 抗氧化活性的测定
1.2.3.1 对DPPH自由基的清除
按照文献[9]的方法并做适当修正：称取 2,2-二苯代
苦味酰基(2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)标准品
20mg，无水乙醇定容至 500mL，得质量浓度 0.04mg/mL
溶液。取此溶液 3mL，加入不同质量浓度样品液 1mL，
室温反应 30min，于 517nm波长处测定吸光度，空白组
以 1mL 无水乙醇代替样品液，并按下式计算清除率：
　　
A试样
DPPH自由基清除率(E)/%=(1－———)× 100
　　 A空白
1.2.3.2 对羟自由基的清除
按照金鸣等[10]的比色法，0.75mmoL/L的邻二氮菲溶
液 1mL，加入 pH7.4的磷酸缓冲溶液(PBS)2mL和蒸馏水
1mL，充分混匀后，加入0.75mmol/L硫酸亚铁溶液1mL，
然后再加入 0.01%过氧化氢 1mL，于 37℃保持 60min，
在波长 536nm处测吸光度 Ap；用 1mL乙醇代替 1mL过
氧化氢，测得吸光度 A b，1mL不同质量浓度的样液代
替蒸馏水，测得吸光度 A s。以下式计算苦丁茶多酚对
OH自由基的清除率(H/%)：

AS－Ap
H/%=————× 100

Ab－Ap
1.2.3.3 对 O 2
_
·的清除
参照文献[11]方法，50mmol/L、pH8.2的 Tris-HCl
缓冲液 4.5mL于试管中，置于 25℃水浴预热 20min，然
后加入不同浓度的样品 0.1mL，2.5mmol/L的邻苯三酚溶
液 0.4mL，混匀后，25℃水浴反应 4min，用 8mol/L盐
酸两滴终止反应。在(299± 1)nm处测吸光度。空白组
以 0.1mL蒸馏水代替待测样液。按照下式计算苦丁茶多
酚对 O 2
_
·清除率( S )。
　　
A空白－(A样品－ A背景)
S/%=——————————× 100

A空白　　
1.2.3.4 对脂质过氧化的抑制
参考文献[12]的方法并做适当改进，小鼠处死后取
肝洗净，剪碎，用生理盐水制成 3 % 的匀浆。取匀浆
0.6mL，加入不同浓度样液 0.34mL，0.0024%过氧化氢
0.2mL，0.03mmol/L硫酸亚铁溶液 0.2mL，于 37℃水浴
保温60min后，加入2mL 20%三氯乙酸及2mL 0.67% TBA
溶液，90℃保温 15min，用水冷却至室温，4000r/min离
心 20min，取上清液，在 532nm波长处测得吸光度，以
水代替 TBA 的平行试验管调零，以蒸馏水代替料液的
反应管为空白管，抑制率( I /%)计算公式为：
　　
A空白－(A样品－ A背景)
I/%=——————————× 100

A空白　　
2 结果与分析
2.1 提取溶剂的筛选
按照 1.2.1节方法，在提取时间 80s、料液比 1:20、
微波功率 291W 条件下进行试验，结果见图 1。由图 1
可知，提取溶剂为丙酮时，苦丁茶多酚提取量最高，
乙醇次之；由于丙酮的毒性以及溶剂价格较高的因素，
选取乙醇作为提取溶剂。
2.2 单因素试验
2.2.1 乙醇体积分数对苦丁茶多酚提取的影响
图 2 乙醇体积分数对苦丁茶多酚提取的影响
Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols
from Kuding tea
120
100
80
60
40
20
0
多
酚
提
取
量
/(
m
g/
g)
乙醇体积分数/%
10 30 50 70 90
图 1 溶剂对苦丁茶多酚提取的影响
Fig.1 Effect of solvents on extraction rate of polyphenols from
Kuding tea
100
80
60
40
20
0
多
酚
提
取
量
/(
m
g/
g)
溶剂
水 乙醇 丙酮 乙酸乙酯
2011, Vol. 32, No. 14 食品科学 ※工艺技术136
按照 2.1节方法，改变乙醇体积分数进行试验，结
果见图 2。由图 2可知，当乙醇体积分数为 50%时，苦
丁茶多酚的提取量最高，故乙醇体积分数选取 50%。
2.2.2 料液比对苦丁茶多酚提取的影响
乙醇体积分数为 50%，其他条件同 2.2.1节，改变
料液比进行试验，结果如图 3。由图 3 可知，当料液
比 1:20 (g/mL)时苦丁茶多酚提取量最高，故选取料液比
1:20(g/mL)。
2.2.3 提取时间对苦丁茶多酚提取的影响
料液比 1:20，其他条件同 2.2.2节，改变提取时间
进行试验，结果见图 4。由图 4 可知，当提取时间为
60s时，苦丁茶多酚提取量最大，时间过长多酚提取量
反而降低，可能是因为时间过长导致部分多酚类物质被
氧化或分解，故提取时间选取 6 0s。
2.2.4 微波功率对苦丁茶多酚提取的影响
选取提取时间 60s，其他条件同 2.2.3节，改变微
波功率，结果见图 5。由图 5可知，微波功率为 291W
时，苦丁茶多酚提取最高，但随着微波功率的增大多
酚提取量迅速降低，可能是因为功率过大加速了多酚类
物质的氧化分解或使溶剂大量挥发，故选取提取功率为
291W。
2.3 响应曲面法结果与分析
响应曲面由法常用于优化最佳测试条件[13-14]。由单
因素试验结果可知，乙醇体积分数、料液比、提取时
间 3个因素对苦丁茶多酚提取率的影响较大，故选取这
3个因素做Box-Behnken设计，并且以苦丁茶多酚提取
量作为响应值，设计及结果见表 1。
变量
代码 编码水平
未编码 编码 － 1 0 +1
乙醇体积分数/% X1 A 40 50 60
液料比(mL/g) X2 B 15 20 25
提取时间 /s X3 C 50 60 70
表 1 Box-Behnken设计试验因素水平及编码
Table 1 Factors and levels in Box-Behnken design
注：A=(X1－ 50)/10；B=(X2－ 20)/5；C=(X3－ 60)/10。
试验号 A B C 多酚提取量 /(mg/g)
1 － 1 － 1 0 95.00
2 1 － 1 0 99.36
3 － 1 1 0 98.55
4 1 1 0 109.15
5 － 1 0 － 1 104.36
6 1 0 － 1 104.85
7 － 1 0 1 95.65
8 1 0 1 100.20
9 0 － 1 － 1 110.45
10 0 1 － 1 110.04
11 0 － 1 1 96.24
12 0 1 1 114.63
13 0 0 0 112.02
14 0 0 0 113.83
15 0 0 0 113.80
表 2 Box-Behnken试验设计及结果
Table 2 Results of Box-Behnken design tests
利用 Design Expert软件对上述结果进行分析，得
到多酚含量(Y)对乙醇体积分数(A)、料液比(B)、提取时
间(C )的二次多项回归方程：
Y=113.22＋2.50A＋3.92B－2.87C＋1.56AB＋1.02AC＋
4.70BC－ 9.64A2－ 3.06B2－2.31C2
试验所选用模型 P值为 0.0019，极显著(P＜ 0.05)，
决定系数 R2=0.9741，说明响应值的变化有 97.41%来源
于所选变量，该方程的拟合情况好。
图 3 料液比对苦丁茶多酚提取的影响
Fig.3 Effect of material/liquid ratio on extraction rate of polyphenols
from Kuding tea
120
100
80
60
40
20
0
多
酚
提
取
量
/(
m
g/
g)
料液比(g/mL)
1:10 1:15 1:20 1:25 1:30
图 4 提取时间对苦丁茶多酚提取的影响
Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of polyphenols from
Kuding tea
110
105
100
95
90
85
80
多
酚
提
取
量
/(
m
g/
g)
提取时间 /s
20 40 60 80 100
图 5 微波功率对苦丁茶多酚提取的影响
Fig.5 Effect of microwave power on extraction rate of polyphenols
from Kuding tea
110
105
100
95
90
85
80
多
酚
提
取
量
/(
m
g/
g)
微波功率 /W
119 291 385 539
137※工艺技术 食品科学 2011, Vol. 32, No. 14
响应面图形是响应值对各试验因素 X 1、X 2、X 3 所
构成的三维空间的曲面图，从响应面分析图上形象地看
出最佳参数及各参数之间的相互作用。当特征值均为正
值时，响应面分析图为山谷形曲面，有极小值存在；
当特征值为负值时，为山丘曲面，有极大值存在；当
特征值有正有负时，为马鞍形曲面，无极值存在。
分数对苦丁茶多酚提取量影响比较大，曲线较陡。
2.4 验证实验
通过辅助软件Design Expert优化提取条件得到多酚
提取量最高的超过 114.80mg/g的 5组数据，分析这 5组
数据，得到苦丁茶多酚含量超过 114.80mg/g的各参数
的范围为乙醇体积分数 51%～53%、料液比 1:23～1:25
(g/mL)、提取时间 60～64s。经以上分析，再综合实验
的好操作性，选取乙醇体积分数 52%、料液比 1:24、提
取时间 6 2 s，进行验证实验。根据回归方程，计算其
预测值为 114.4832mg/g。进行 3次平行实验，得到平均
结果为 115.40mg/g，相对误差为 0.8%，证明响应面优
化苦丁茶多酚的提取工艺可行。
2.5 抗氧化活性测定
2.5.1 对DPPH自由基的清除
如图 7所示，由回归方程得苦丁茶多酚对DPPH自
由基的半清除质量浓度 EC50=29.24mg/L。
2.5.2 对羟自由基的清除
由图 6A可知，乙醇体积分数对苦丁茶多酚提取量
影响比较大，表现为曲线较陡，料液比对苦丁茶多酚
提取量影响不是很大，表现为曲线较为平缓。当乙醇
体积分数在 0水平，即 50%时，多酚提取量最大，说
明过高过或过低的乙醇体积分数均不适合苦丁茶多酚的
提取。由图 6B 可知，料液比对苦丁茶多酚提取量影响
比较小，而提取时间对苦丁茶多酚提取影响较大，且
较短的时间更有利于提取。图 6C 进一步说明乙醇体积
图 7 苦丁茶多酚对 DPPH自由基清除作用
Fig.7 Scavenging rate of polyphenols from Kuming tea on
DPPH free radicals
100
80
60
40
20
0
y=1.0858x＋ 18.249
R2=0.903
清
除
率
/%
质量浓度 /(mg/L)
0 20 40 60 80
由图 8回归方程可得，苦丁茶多酚对OH自由基的
半清除质量浓度HC50=34.14mg/L。
2.5.3 对 O 2—·的清除
115
110
105
100
95
多
酚
提
取
量
/(
m
g/
g)
B：料液比
1.00
0.500.00－0.50－1.00 －1.00
－0.50
0.000.50
1.00
A：
乙醇
体积
分数
a.乙醇体积分数与料液比
115.00
110.25
105.50
100.75
96.00
多
酚
提
取
量
/(
m
g/
g)
C：提取时间
1.00
0.500.00－0.50
－1.00
B：
料液
比
b.料液比与提取时间
－1.00－0.50
0.000.50
1.00
图 6 各两因素交互作用对多酚提取量的响应面图
Fig.6 Response surface plot for the effect of cross-interaction between
ethanol conceration, material-liquid ratio and extraction time on the
extraction rate of polyphenols from Kuding tea
115.00
109.75
104.50
99.25
94.00
多
酚
提
取
量
/(
m
g/
g)
C：提取时间
1.00
0.50
0.00－0.50－1.00
c.乙醇体积分数与提取时间
固定水平：均为零水平。
A：
乙醇
体积
分数－1.00－0.50
0.00
0.50
1.00
图 8 苦丁茶多酚对羟自由基的清除作用
Fig.8 Scavenging rate of polyphenols from Kuming tea on
hydroxyl free radicals
100
80
60
40
20
0
清
除
率
/%
质量浓度 /(mg/L)
25 50 75 100 125 150
y=0.918x－ 18.66
R2=0.9905
2011, Vol. 32, No. 14 食品科学 ※工艺技术138
由图 9 回归方程计算可得，苦丁茶多酚对 O 2—·的
半清除质量浓度 SC50=872.3mg/L。
2.5.4 对脂质过氧化的抑制
由图 10回归方程计算可得，苦丁茶多酚对脂质过
氧化的半抑制质量浓度 IC50=11.48mg/L。
3 结 论
3.1 通过单因素试验，确定了苦丁茶多酚提取的最佳
工艺条件为乙醇体积分数 50%、料液比 1:20(g/mL)、提
取时间 60s、微波功率 291W。
3.2 通过Box-Behnken响应曲面法优化，确定苦丁茶
多酚提取的最佳试验条件为乙醇体积分数 52%、料液比
1:24(g/mL)、提取时间 62s。以该优化条件在微波功率
291W时提取苦丁茶多酚含量达到 115.40mg/g。
3.3 由抗氧化实验可知，苦丁茶多酚对DPPH自由基、
羟自由基、O2—·的清除能力以及对脂质过氧化的抑制能
力都随苦丁茶多酚浓度呈线性增加，其对 D PPH 自由
基、羟自由基、O2—·的半清除质量浓度分别为 29.24、
34.14、872.3mg/L，对脂质过氧化的半抑制质量浓度为
11.48mg/L。
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图 10 苦丁茶多酚对脂质过氧化的抑制作用
Fig.10 Inhibition rate of polyphenols from Kuming tea on
lipid peroxidation
80
60
40
20
0
清
除
率
/%
质量浓度 /(mg/L)
5 10 15 20
图 9 苦丁茶多酚对 O 2·的清除作用
Fig.9 Scavenging rate of polyphenols from Kuming tea on
superoxide anion ion free radicals
80
60
40
20
0
清
除
率
/%
质量浓度 /(mg/L)
500 750 1000 1250 1500
y=0.0447x+10.62
R2=0.9959
y=3.6743x+7.8238
R2=0.9907