全 文 :基金项目:湖南省教育厅重点项目(编号:09C1294)
作者简介:王文渊(1969-),男,湖南永州职业技术学院副教授。
E-mail:wwy07@163.com
收稿日期:2011-05-01
第27卷第6期
2 0 1 1年1 1月
Vol.27,No.6
Nov.2 0 1 1
10.3969/j.issn.1003-5788.2011.06.024
超临界CO2流体萃取苦瓜叶中黄酮的研究
Study on extraction of flavones from momordica charan tia
leaves L.by supercritical CO2fluid
王文渊1
WANG Wen-yuan1
唐守勇1
TANG Shou-yong1
龙红萍2
LONG Hong-ping2
(1.湖南永州职业技术学院,湖南 永州 425000;2.中南大学药学院,湖南 长沙 410013)
(1.Hunan Yongzhou Vocational Technical College,Yongzhou,Hunan425000,China;
2.School of Pharmacy,Central South University,Changsha,Hunan410013,China)
摘要:研究超临界流体萃取苦瓜叶黄酮的影响因素,并对提
取工艺进行优化设计。在单因素试验和正交试验的基础上,
得到超临界萃取工艺的最优化条件:以用量为1∶1(V∶m)
的95%乙醇浸润1h,夹带剂体积与原料质量比2∶1,CO2流
量22L/h、萃取压力28 MPa、萃取温度44 ℃,萃取时间
150min。该工艺条件下,黄酮的提取率可达到3.69%。
关键词:超临界;苦瓜叶;黄酮;提取
Abstract:The extraction technology of flavonoids from momordica
charantialeaves L.by supercritical CO2fluid was studied and the
processing parameters were optimized.Based on the single experi-
ments and orthogonal tests,the optimal process conditions were as
folows:soak the matrix by 95%ethanol(contrast to matrix 1∶1)
for one hour,95%ethanol(contrast to matrix 2∶1)serve as entrai-
ner.CO2flow rate 22L/h,extracting pressure 28MPa,extracting
temperature 44℃,and extracting time 150min.The yield of fla-
vonoids was 3.69%under the optimal condition.
Keywords:SFE;momordica charantial leaves;flavonoids;extraction
苦瓜又名癞葡萄、凉瓜,因有特殊苦味而得名,研究[1-4]
表明,苦瓜的果实和茎叶中富含黄酮;苦瓜黄酮具有抗癌防
癌、降血糖、血脂、抗心律失常和增强免疫力等有多种生理和
药理功效,因其独特的功效可作为治疗心脑血管疾病的药
物[5]。苦瓜黄酮还具有清除自由基抗氧化和抗衰老作用[6],
是一种天然的抗氧化剂,可用作为食品中的天然添加剂[7],
在医药和食品领域中有着广泛的用途。目前,对苦瓜中的多
糖、皂苷等生物活性成分研究的较多,而对苦瓜茎叶中黄酮
类物质研究报道的较少。
超临界CO2萃取作为近年来发展的一种集萃取、分离于
一体的新兴提取技术,具有提取条件温和、活性成分不易被
破坏、消耗少、传质速率快、溶剂残留少等优点[8],且最终的
提取效率和经济性同水提法、有机溶剂提取法、微波法、超声
波法等常规方法相比也有很大提高,被广泛应用在天然产物
有效成分的提取中[9]。本试验以苦瓜叶为原料,先用乙醇进
行浸润预处理,然后采用超临界流体萃取技术提取其中黄酮,
并与固体直接进料方式的试验结果进行比较,以期得到更高
效的提取苦瓜叶中黄酮类化合物的工艺。为充分利用苦瓜叶
中的生物活性物质-苦瓜黄酮,提供一定的理论基础和指导。
1 试验部分
1.1 试剂与仪器
苦瓜叶,采自永州市农科所蔬菜园区,干燥粉碎,过40
目筛,装瓶备用;
CO2(纯度≥99.5%):食品级,永州市医用氧气厂;
芦丁对照品:批号100080,中国药品生物制品检定所;
无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠等试剂:均为国
产分析纯;
二次蒸馏水:本实验室自制;
超临界萃取装置:HA221-40,江苏南通华安超临界萃取
有限公司;
紫外-可见分光光度计:UV-9100,上海民仪电子有限
公司;
高速万能粉碎机:FW-100型,天津市泰斯特仪器有限
公司;
电子天平:AEU-210,湘仪天平仪器设备有限公司;
1.2 方法
1.2.1 工艺流程
苦瓜叶→干燥→粉碎→称量→乙醇浸润→超临界萃取
→合并萃取物→减压浓缩→黄酮提取液
89
1.2.2 操作要点
(1)原料预处理:新鲜苦瓜叶经漂洗、阴干,于65℃烘
箱内干燥12h后取出,粉碎,过40目筛。称取50.0g苦瓜
叶粉于250mL三角瓶中,按用量为1∶1(V∶m)加入95%
乙醇浸润1h。
(2)超临界CO2流体萃取:将经过乙醇浸润的苦瓜叶粉
通过料筒装入萃取釜,以95%乙醇为夹带剂,按预定的设计
调节CO2流量、萃取釜的压力和温度,设定分离釜I压力
8MPa,温度40℃,分离釜Ⅱ压力6MPa,温度45℃,萃取
一定的时间,每隔30min收集萃取物,合并萃取物,减压浓
缩得样品溶液。
1.2.3 黄酮提取的单因素试验
(1)夹带剂及其用量的确定:使用加夹带剂可提高苦瓜
黄酮的提取率,根据前期预试验结果,并考虑安全性、成本等
因素,确定以95%的乙醇作为夹带剂。再固定 CO2流量
20L/h,萃取压力 25 MPa,萃取温度 50 ℃,萃取时间
150min,夹带剂的用量分别控制为1∶1,1.5∶1,2∶1,
2.5∶1,3∶1(V∶m),以黄酮提取率为评价指标,考察夹带
剂用量对黄酮提取率的影响。
(2)萃取压力对黄酮提取率的影响:以95%的乙醇作为
夹带剂,固定 CO2流量20L/h,温度 50℃,夹带剂用量
2∶1(V∶m),萃取时间120min,萃取压力分别控制为16,
18,20,22,24,26,28,30,32MPa,以黄酮提取率为评价指标,
考察萃取压力对黄酮提取率的影响。
(3)萃取温度对黄酮提取率的影响:以95%的乙醇为夹
带剂,固定CO2流量20L/h,压力22MPa,时间120min,夹
带剂用量2∶1(V∶m),萃取温度分别控制为32,34,36,38,
40,42,44,46,48,50℃,以黄酮提取率为评价指标,考察萃取
温度对黄酮提取率的影响。
(4)萃取时间对黄酮提取率的影响:以95%的乙醇为夹
带剂,固定CO2流量20L/h,温度44℃,压力28MPa,夹带
剂用量2∶1(V∶m),萃取时间分别控制为60,90,120,150,
180,210,240min,以黄酮提取率为评价指标,考察萃取时间
对黄酮提取率的影响。
(5)CO2流量对黄酮提取率的影响:以95%的乙醇作为
夹带剂,固定温度44,压力28MPa,时间150min,夹带剂用
量2∶1(V∶m),CO2流量分别控制为15,18,21,24,27,30,
33L/h,以黄酮提取率为评价指标,考察CO2流量对黄酮提
取率的影响。
1.2.4 正交试验设计方案 根据各单因素试验结果确定正
交试验的因素及水平取值范围,再设计L9(34)正交试验,以
黄酮提取率为评价指标,进一步优化苦瓜叶黄酮的超临界
CO2流体萃取工艺参数。
1.2.5 总黄酮含量的测定
(1)标准曲线的绘制:采用 NaNO2-Al(NO3)3化学络
合分光光度法[10],以芦丁对照品溶液做标准曲线,求得回归
方程:
A=0.943 7Y-0.085 7(R2 =0.999 6) (1)
式中:
A——— 吸光度;
Y——— 芦丁浓度,mg/mL;
(2)样品中总黄酮含量的测定:精密取适量黄酮提取液
于25mL容量瓶中,其余步骤与标准曲线的绘制方法相同,
测定吸光度值,照标准曲线法计算总黄酮的含量,按式(2)计
算提取率:
Y = c×V×25M×V1×1000×
100% (2)
式中:
Y——— 黄酮提取率,%;
C——— 被测液黄酮浓度,mg/mL;
V1——— 测定时吸取的黄酮提取液体积,mL;
V——— 黄酮提取液的总体积,mL;
M——— 原料粉质量,g;
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果分析
2.1.1 夹带剂用量对黄酮提取率的影响 由图1可知,随
着夹带剂用量的增加,黄酮提取率先增加后减少。这是因为
夹带剂的加入,改善了超临界流体对黄酮的溶解性和选择
性,但用量过多,反而会使超临界CO2流体的渗透力减弱。
因此,只有夹带剂量适当,才能达到理想的萃取效果,可以看
出,当夹带剂用量为2∶1(V∶m)时黄酮提取率最高。
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
黄
酮
提
取
率
Ex
tra
ct
io
n
ra
te
of
fla
vo
no
id
s/%
夹带剂体积/原料质量
Cosolvent volume/weight of raw materials(V∶m)
1.0∶1 1.5∶1 2.0∶1 2.5∶1 3.0∶1
图1 夹带剂用量对黄酮提取率的影响
Figure 1 Effect of amount of entrainer on
extraction rate of flavonoids
2.1.2 萃取压力对黄酮提取率的影响 由图2可见,随着
萃取压力的提高,溶剂的溶解能力增强,黄酮提取率增大。
当压力增大到一定程度时,继续增加压力,超临界流体的黏
度增加,使得流体的传质速率下降,影响萃取效果,当压力>
28MPa时,提取率呈降低趋势。
2.1.3 萃取温度对黄酮提取率的影响 由图3可知,在其
它条件恒定的情形下,黄酮提取率先随温度的升高而增大,
44℃时达到最大值,而后开始下降,这是因为密度变化引起
的溶解能力占主导所致[11]。
2.1.4 萃取时间对黄酮提取率的影响 由图4可知,随着
萃取时间的延长,溶剂的传质能力逐步达到良好状态,萃取
99
提取与活性 2011年第6期
量逐渐增加,萃取率增大,至150min时达到较大值。当黄
酮基本溶出,继续延长萃取时间,萃取率增幅不大。
3.0
2.5
2.0
1.5
16
黄
酮
提
取
率
Ex
tra
ct
io
n
ra
te
of
fla
vo
no
id
s/%
压力
Pressure/MPa
18 20 26 28 30
1.0
22 24
◆
◆
◆
◆
◆
◆ ◆
◆ ◆
32
图2 萃取压力对黄酮提取率的影响
Figure 2 Effect of extracting pressure on
the extraction rate of flavonoids
3.5
2.5
2.0
1.5
34
黄
酮
提
取
率
Ex
tra
ct
io
n
ra
te
of
fla
vo
no
id
s/%
温度
Temperature/℃
36 38 44 46 48
1.0
40 42
◆
◆
◆
◆ ◆
◆ ◆
◆ ◆
50
3.0
图3 萃取温度对黄酮提取率的影响
Figure 3 Effects of extracting temperature on
the extraction rate of flavonoids
4.0
2.5
2.0
1.5
60
黄
酮
提
取
率
Ex
tra
ct
io
n
ra
te
of
fla
vo
no
id
s/%
时间
Time/min
90 210
◆
◆
◆
◆ ◆
◆ ◆
3.0
3.5
180150120 240
图4 萃取时间对黄酮提取率的影响
Figure 4 Effect of extracting time on the
extraction rate of flavonoids
2.1.5 CO2流量对黄酮提取率的影响 由图5可知,随着
CO2流量的增加,流体的湍流和扰动加强,增加了流体分子
与溶质间的碰撞机会,萃取速率提高。但流量过大,会使超
临界流体与待萃取组分接触时间减少,影响萃取效果。CO2
流量对黄酮提取率的影响呈抛物线形,流量为21L/h时,黄
酮提取率最高。
2.2 正交试验
根据单因素的试验结果确定用量为2∶1(V∶m),选取
萃取温度、压力、时间、CO2流量四因素进行正交试验优化研
究,以确定超临界流体萃取的最优化工艺,正交试验的因素
及水平取值见表1,结果见表2。
3.5
2.5
2.0
1.0
15
黄
酮
提
取
率
Ex
tra
ct
io
n
ra
te
of
fla
vo
no
id
s/%
CO2流量
CO2 flow/(L·h-1)
18 30
◆
◆
◆ ◆ ◆
◆
◆
3.0
272421 33
1.5
图5 CO2流量对黄酮提取率的影响
Figure 5 Effect of CO2flow on the
extraction rate of flavonoids
表1 正交试验因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
水平
A压力/
MPa
B温度/
℃
C CO2流量/
(L·h-1)
D时间/
min
1 26 42 20 120
2 28 44 21 150
3 30 46 22 180
表2 超临界流体萃取苦瓜叶总黄酮
正交试验结果与极差分析
Table 2 The results and analysis of orthogonal test
试验号 A B C D 黄酮提取率/%
1 1 1 1 1 1.83
2 1 2 2 2 2.84
3 1 3 3 3 2.38
4 2 1 2 3 3.37
5 2 2 3 1 3.76
6 2 3 1 2 3.04
7 3 1 3 2 3.43
8 3 2 1 3 3.24
9 3 3 2 1 2.89
k1 2.35 2.88 2.71 2.
83
k2 3.39 3.28 3.03 3.10
k3 3.19 2.77 3.19 3.00
R 1.04 0.51 0.49 0.27
由表2可知,萃取温度、压力、时间、CO2流量四因素对
黄酮提取率影响的主次顺序:萃取压力>温度>CO2流量>
萃取时间。苦瓜叶中黄酮的超临界流体萃取最佳工艺条件
是:A2B2C3D2,即萃取压力28MPa,温度44℃,CO2流量
22L/h,萃取时间150min。
(下转第130页)
001
第27卷第6期 王文渊等:超临界CO2流体萃取苦瓜叶中黄酮的研究
4.4 检出限的确定
根据美国环境保护所(EPA)相关标准[10],在置信水平
为99%时,重复测定浓度与方法检出限接近的样品n次,计
算出标准偏差STD。检出限(MDL)计算公式:
MDL=2.821×STD (5)
对标准样品1#重复测定10次,4种指标10次测定结
果的标准偏差分别为2.573,0.297,0.001 32,0.105,4种指
标的方法检出限分别为7.259,0.837,0.003 72,0.296。
4.5 验证性实验
将发酵过程中的样品取样(发酵96h),采用国标方法进
行各指标测定,并对测定结果进行比较,结果见表3。
表3 验证实验结果
Table 3 Results of validation test
指标 国标方法 仪器结果 偏差/%
还原糖 2430 2476 1.89
氨基氮 35 35 0.00
二氧化碳 0.42 0.43 2.38
酒精度 36 35 -2.78
由表3可知,采用连续流动化学分析仪测定的试验结果
同采用国家标准规定的方法测定的结果相差较小。
5 结论
使用定时控制器控制进样泵,配合连续流动化学分析仪
自动、定时测定发酵液样品中还原糖、氨基氮、二氧化碳和酒
精度的含量,采用进样60s,冲洗90s,检测波长分别为460,
570,550,590nm,每隔2h自动测定标准品和样品。在该条
件下测定结果较好,具有较好的重复性、较稳定的加标回收
率及较低的检出限。
采用该方法能自动、快速、准确的测定发酵系统中多种
物质的含量是可行的,并能有效减少化学药品的用量,减少
相应的污染。这些优点是传统测定方法所不具备的,但该方
法针对的准确测定范围有一定限度,对于发酵过程中物质变
化过大的发酵液需进一步改进。
参考文献
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(上接第100页)
2.3 验证实验
按正交试验确定的最佳提取工艺条件,进行3次重复试
验,黄酮提取率分别为3.70%,3.65%,3.81%,平均提取率
为3.72%,与理论预测值的相对误差为1.06%,表明正交试
验得出的最优工艺是符合实际的。
3 结论
(1)前期预试验发现,在相同条件下对原料进行乙醇浸
润预处理以后进行超临界萃取,比直接固体进料进行超临界
萃取黄酮平均提取率高28%以上。
(2)超临界流体萃取苦瓜叶中总黄酮的最佳工艺条件
为:以用量为1∶1(V∶m)的95%乙醇对原料进行浸润1h(预
处理),用量为2∶1(V∶m)的95%乙醇为夹带剂,控制CO2流
量22L/h,压力28MPa,温度44℃,循环萃取150min。
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031
安全与检测 2011年第6期