全 文 ： 2011, Vol. 32, No. 11 食品科学 ※基础研究60
苦丁茶冬青苦丁茶中多酚类物质的
分离纯化与结构解析
孙 怡，张 鑫，张文芹，曾晓雄，胡秋辉*
(南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095)
摘 要：利用带二极管矩阵检测器的高效液相色谱仪(HPLC-DAD)分析苦丁茶冬青苦丁茶与绿茶多酚类化合物的组
成，结果表明它们的色谱峰图呈现明显的不一致，说明苦丁茶冬青苦丁茶的主要化学成分可能不同于绿茶。利用
半制备型HPLC从苦丁茶冬青苦丁茶中分离纯化得到了 5种单体化合物，通过质谱(MS)和核磁共振(NMR)分析，将
5种单体化合物分别鉴定为羟基酪醇葡萄糖苷、绿原酸、4,5-O-二咖啡酰奎尼酸、3,5-O-二咖啡酰奎尼酸和 3,4-O-
二咖啡酰奎尼酸。因此，认为苦丁茶冬青苦丁茶的主要多酚类化合物为绿原酸及其衍生物。
关键词：苦丁茶冬青苦丁茶；多酚；纯化；结构鉴定；咖啡酰奎尼酸
Purification and Structural Identification of Polyphenols in Kudingcha
SUN Yi，ZHANG Xin，ZHANG Wen-qin，ZENG Xiao-xiong，HU Qiu-hui*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)
Abstract ：The polyphenolic substances in Kudingcha made from Ilex kudingcha C.J. Tseng and green tea made from Camellia
sinensis L. were analyzed by high-performance liquid chromatography with diode-array detector (HPLC-DAD). The chromato-
graphic patterns of the two types of tea were distinctively different. The results indicated that the polyphenolic substances in
kudingcha might be quite different from those in green tea. In addition, 5 compounds were isolated from kudingcha extract by
semi-preparative HPLC and identified as hydroxytyrosol glucoside, 5- caffeoylquinic acid (5-CQA), 3,4-dicaeoylquinic acid
(3,4-di-CQA), 3,5-dicaeoylquinic acid (3,5-di-CQA) and 4,5-dicaeoylquinic acid (4,5-diCQA) by mass spectroscopy (MS) and
nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, respectively. Therefore, the major phenolic compounds in kudingcha made
from Ilex kudingcha C.J. Tseng were CQA and its derivatives.
Key words：kudingcha made from Ilex kudingcha C.J. Tseng；polyphenol；purification；structural identification；
caffeoylquinic acid
中图分类号： Q946.84 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)11-0060-04
收稿日期：2011-01-20
基金项目：国家自然科学基金项目(30871743)；国家“863”计划项目(2007AA10Z351)
作者简介：孙怡( 1 9 6 6 —)，女，讲师，博士，主要从事食品营养化学与功能性食品开发研究。
E-mail：sunyi01@njau.edu.cn
* 通信作者：胡秋辉( 1 9 6 4 —)，男，教授，博士，主要从事食品安全与功能性食品开发研究。
E-mail：qiuhuihu@njau.edu.cn
苦丁茶作为一种茶的代用品，与茶叶一样在中国被
广为饮用。而苦丁茶实际上是一类代茶用植物的统称，
用于加工苦丁茶的植物原料有 6个科 11种之多，如冬青
科的苦丁茶冬青、大叶冬青、枸骨和木犀科的女贞等，
但主要原料为冬青科的苦丁茶冬青、大叶冬青和枸骨。
苦丁茶中含有多酚类、皂苷、生物碱和黄酮类等生物
活性成分，因而具有很好的抗氧化、降血压、降脂、
抑菌等功效[ 1- 3]。
多酚类化合物是高等植物中普遍存在的次级代谢产
物，具有广泛的生物活性。但是，有关苦丁茶多酚含
量、种类以及抗氧化活性的研究较少[4-6]。刘丽香等[7-8]
以苦丁茶冬青树叶加工而成的苦丁茶(苦丁茶冬青苦丁茶)
为原料，采用 Folin-Ciocalteu比色法测定了苦丁茶粗提
物和各萃取物的多酚含量，并应用DPPH法、TEAC法
和 FRAP法测定了粗提物和各萃取物的抗氧化活性，结
果表明苦丁茶提取物具有较高的多酚含量和较强的抗氧
61※基础研究 食品科学 2011, Vol. 32, No. 11
化能力。张文芹等[9]比较了苦丁茶冬青苦丁茶及大叶冬
青苦丁茶提取液的多酚、黄酮含量及体外抗氧化能力，
结果表明两者均具有较强的体外抗氧化活性。关于苦丁
茶多酚类化合物的组成，梁月荣等[10]通过分析浙江省大
叶冬青苦丁茶中的化学成分发现苦丁茶中含有儿茶素和
芦丁等多酚类化合物，而 Negishi等[11]报道了大叶冬青
等冬青科树叶中含有绿原酸(5-CQA)、3,4-O-二咖啡酰基
奎尼酸(3,4-diCQA)和4,5-O-二咖啡酰基奎尼酸(4,5-diCQA)
等 C Q A 类化合物。因此，基于前期研究基础，本实验
利用带二极管矩阵检测器的高效液相色谱仪(HPLC-DAD)分
析苦丁茶冬青苦丁茶与绿茶多酚类的组成，然后利用半制
备HPLC、质谱(MS)和核磁共振仪(NMR)探讨苦丁茶冬青
苦丁茶多酚类化合物的化学结构，以期为苦丁茶茶冬青苦
丁茶的呈味机制、药理作用机理及其开发应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苦丁茶冬青苦丁茶由海南椰仙生物科技有限公司提
供，其由冬青科的苦丁茶冬青(Ilex kudingcha C.J. Tseng)树
叶加工而成；绿茶(雨花茶)购自南京苏果超市。
绿原酸、没食子酸、咖啡酸、咖啡碱、茶叶碱、
可可碱 美国 Sigma公司；茶叶儿茶素标样：表儿茶
素((-)-EC)、表儿茶素没食子酸酯((-)-ECG)、表没食子儿
茶素((-)-EGC)和表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-EGCG) 日
本 Funakoshi公司；乙腈(进口分装，色谱纯)、甲醇 江
苏汉帮科技公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Agilent 1100高效液相色谱仪(包括G1311A四元泵、
G1379A 真空脱气机、G1316A柱温箱、G1315B DAD和
化学工作站) 美国Agilent公司；Shimadzu LC-MS 2010A
液 -质联用仪(包括Shimadzu LC-10ADvp高效液相色谱仪
和 LC-MS 2010A质谱仪)、半制备型HPLC-6A(包括 LC-
6A系列输液泵、SPD-10AVP UV-VIS检测器和 FRC-10A
收集器)、AY-120电子精密天平、BL-220H 分析天平 日
本岛津公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城
科工贸有限公司；Laborota 4000 真空旋转蒸发仪 德国
Heidolph 公司；冷冻干燥机 英国 Labconco公司。
1.3 方法
1.3.1 茶汤与苦丁茶冬青苦丁茶粗提物的制备
称取绿茶或苦丁茶冬青苦丁茶3.0g于500mL三角瓶
中，加沸水 350mL，在沸水浴中浸提 45min，并每隔
10min摇动一次，过滤，滤液再用 0.45μm的微孔滤膜
过滤，过滤液经稀释供HPLC-DAD和 HPLC-MS分析。
称取粉碎过筛的苦丁茶冬青苦丁茶样，用沸水以1:10
料液比于 95℃水浴中提取 30min，5000× g离心 10min，
取上清液，剩余残渣重复以上操作，合并上清液，经
浓缩、冷冻干燥得苦丁茶冬青苦丁茶粗提物。
1.3.2 HPLC-DAD分析条件
采用Agilent 1100 HPLC系统，检测器为DAD，色
谱柱为 TSKgel ODS-80TsQA (250mm × 2.0mm，5μm)；
柱温箱温度为 40℃；采用梯度洗脱，流动相 A为 1.0%
甲酸溶液、流动相 B 为乙腈、流动相 C 为水，流速为
0.2mL/min，洗脱梯度为：0～60min流动相由10%A+5%B+95%C
至 10%A+25%B+65%C，60～100min由10%A+25%B+65%C
至 1 0 % A + 4 5 % B + 5 5 % C，1 0 0～1 1 0 m in 流动相为
10%A+45%B+55%C；进样体积为 20μL。
1.3.3 HPLC-MS分析条件
采用 Shimadzu LC-MS 2010A系统，HPLC分析条
件同上。质谱条件：电喷雾电离源(ESI)，正负离子检
测，扫描范围 m/z 0～1000，雾化气体为氮气，流速为
2L/min，ESI电离电压为 4.5kV，锥孔电压为 25V，离
子源温度 250℃。
1.3.4 酚类单体的分离纯化
采用半制备型HPLC分离纯化苦丁茶冬青苦丁茶的
酚类单体化合物。半制备型HPLC为 Shimadzu LC-6A系
统，包括运行稳定的 LC-6A系列输液泵、SPD-10AVP
检测器和FRC-10A收集器，色谱柱Zorbax SB-C18 (21.2mm×
250mm，7μm，Agilent)；检测波长 270nm和 320nm，
流速8.0mL/min，FRC-10A收集器自动收集洗脱液(8.0mL/管)，
洗脱液进行 HPLC-MS分析。
1.3.5 NMR分析
将纯化得到的各酚类单体化合物溶于 CD 3OD 中，
用Varian 500进行NMR分析，操作温度为 300K。
2 结果与分析
2.1 苦丁茶冬青苦丁茶与绿茶的HPLC-DAD分析
为了探讨苦丁茶冬青苦丁茶与茶叶多酚类化合物组
成的差异，以苦丁茶冬青苦丁茶和绿茶为原料，采用
热水冲泡法制备各自的茶汤并进行HPLC-DAD分析。采
用 TSKgel ODS-80TsQA色谱柱和以乙腈 -水为流动相
时，各色谱峰拖尾现象非常明显，而改用乙腈 -甲酸水
溶液为流动相，分离效果好，峰形对称。在本实验条
件下，苦丁茶冬青苦丁茶与绿茶的茶汤经HPLC 分析，
它们的色谱峰图呈现明显的不一致(图 1和图 2)。
图 1 绿茶茶汤的HPLC-DAD图
Fig.1 HPLC chromatogram of green tea
m
A
U
时间 /min
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
0 20 40 60 80 100
370nm
330nm
270nm
254nm
分析HPLC-DAD图谱中主要峰的全波长扫描图，发
现绿茶、苦丁茶冬青苦丁茶的紫外光谱图均有很大的差
异。绿茶样品中含有茶叶儿茶素和咖啡碱的特征峰，再
根据没食子酸、茶叶儿茶素[(-)-EC、(-)-ECG、(-)-EGC和
(-)-EGCG]、咖啡碱、茶叶碱和可可碱的标准样HPLC图
谱以及参考相关文献[12-14]，推测绿茶(雨花茶)的主要
多酚类成分为没食子酸、(- )-EGCG 等茶叶儿茶素类成
分。将苦丁茶冬青苦丁茶的图谱与绿茶的相比较，初
步认为苦丁茶冬青苦丁茶样品中没有咖啡碱和各种茶叶
儿茶素等茶叶中的特征性化合物。
2.2 苦丁茶冬青苦丁茶酚类单体成分的制备与结构解析
以上的研究结果初步表明苦丁茶冬青苦丁茶的主要
化学成分可能不同于绿茶，因此对苦丁茶冬青苦丁茶的
多酚类化合物进行了分离纯化和结构分析。首先将苦丁
茶冬青苦丁茶的粗提取物用水溶解和膜过滤，然后上半
制备型HPLC进行分离纯化(图 3)，洗脱液自动收集。将
有紫外吸收的收集液进行 HPLC-MS分析，根据分析结
果合并收集液、浓缩、干燥与结构解析或再进行 HPLC
分离纯化。结果如下：1)图 3A 中的第 11管和 12管合
并、浓缩和干燥，得到化合物 1。根据MS和 NMR 数
据及HPLC出峰时间和紫外光谱图，推测该物质为羟基
酪醇葡萄糖苷[15-17]。2)图 3A中的第 31管和 32管经HPLC
与MS分析，认为是同一物质(相似的保留时间与MS图
谱中均有 m/z 353负离子峰)，这两管合并、浓缩和干
燥得到化合物 2。根据MS和 NMR 数据，可确定该物
质为绿原酸(5-CQA)[11,18-21]。3)图 3A中的第 60～62管经
HPLC与MS分析，认为是同一物质(相似的保留时间与
MS图谱中均有 m/z 515负离子峰)，这 3管合并、浓缩
和干燥得到化合物 3。根据MS和NMR数据可确定化合
物 3为 4,5-O-二咖啡酰奎尼酸(4,5-diCQA)[11,18-21]。4)图3A
中的第 52～59管为 4,5-diCQA和其异构体的混合物，因
此合并、浓缩和进行第二次分离纯化，纯化结果如图
3 B 所示。图 3 B 中的第 1 5、6 管合并、浓缩和干燥，
得到化合物 4。MS和NMR数据表明化合物 4为 3,5-O-
二咖啡酰奎尼酸(3,5-diCQA)。图 3B中的第 13、14管合
并与浓缩后，进行再次分离纯化(图 3C)，第 13～15管
为化合物 3，而第 8～10管合并、浓缩和干燥得到化合
物 5。MS与NMR分析结果表明化合物 5为 3,4-O-二咖
啡酰奎尼酸(3,4-diCQA)。
化合物1： LC-MS m/z 316 [M+H]+和360 [M+HCOO]－。
13C NMR (CD3OD)：δ156.10, 139.58, 126.73, 117.03, 100.54, 95.86,
77.13, 77.01, 73.51, 71.52, 70.72, 64.33, 62.14, 35.07。
化合物 2：LC-MS m/z 353 [M－ H]－。1H NMR
(CD3OD)：δ1.92～1.98 (2H, m), 2.11～2.22 (2H, m), 3.63 (1H,
dd, J 3.6 Hz), 4.11 (1H), 5.34 (1H), 6.29 (1H, d, J 15.6 Hz), 6.76
(1H, d, J 8.0 Hz), 6.93 (1H, dd, J 2.4 Hz), 7.03 (1H, d, J 2.0 Hz),
7.56 (1H, d, J 16.0)。13C NMR(CD3OD)：δ177.63, 168.00,
148.40, 145.77, 144.76, 126.97, 121.84, 115.55, 114.83, 114.10,
74.40, 73.71, 71.96, 67.37, 40.38, 35.73。
化合物 3：LC-MS m/z 515 [M－ H]－。1H NMR
(CD3OD)：δ2.09 (2H, m), 2.20 (2H, m), 4.35 (1H, m), 5.10
(1H, dd, J 2.8 and 8.8 Hz), 5.59 (1H, m), 6.16和6.26 (2H, d,
图 2 苦丁茶冬青苦丁茶茶汤的HPLC-DAD图
Fig.2 HPLC chromatogram of Kudingcha
m
A
U
时间 /min
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
0 20 40 60 80 100
370nm
330nm
270nm
254nm
2011, Vol. 32, No. 11 食品科学 ※基础研究62
图 3 苦丁茶冬青苦丁茶提取物经半制备型 HPLC分离纯化的
HPLC色谱图
Fig.3 Semi-preparative HPLC chromatogram of Kudingcha
A
m
V
时间 /min
2500
2000
1500
1000
500
0
0 10 20 30 40 50 60 70
B
m
V
时间 /min
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
－1000
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0
C
m
V
时间 /min
500
400
300
200
100
0
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5
31
J 16.0 Hz), 6.73和6.75 (2H, d, J 8.0 Hz), 6.88和6.91 (2H, dd,
J 1.6, 6.8 Hz), 6.99和7.01 (2H), 7.49和7.57 (2H, d, J 16.0 Hz)。
13C NMR (CD3OD)：δ176.74, 167.54, 167.21, 148.63, 146.69,
146.57, 145.73, 126.71, 126.65, 122.12, 115.46, 114.20, 114.16,
113.74, 113.69, 75.03, 74.72, 68.33, 67.96, 38.33, 37.37。
化合物 4：LC-MS m/z 515 [M－ H]－。1H NMR
(CD3OD)：δ2.16 (2H, m), 2.31 (2H), 3.98 (1H, dd, J 3.6,
7.6 Hz), 5.39 (1H, m), 5.44 (1H, m), 6.26和6.34 (2H, d, J 16.0 Hz),
6.79和6.80 (2H, dd, J 1.6, 8.0 Hz), 6.95 (2H), 7.51和7.64 (2H,
d, J 16.0 Hz)。13C NMR (CD3OD)：δ176.40, 167.93, 167.44,
148.55, 148.45, 146.30, 146.88, 145.73, 126.94, 126.83, 122.10,
122.03, 115.51, 114.60, 114.31, 114.20, 114.13, 73.76, 71.58, 71.80,
69.72, 36.68, 35.02。
化合物 5：LC-MS m/z 515 [M－ H]－。1H NMR
(CD3OD)：δ2.08 (2H, m), 2.19 (2H, m), 4.35 (1H, br s), 5.09
(1 H, J 3.6 Hz), 5.59 (1H, m), 6.16和6.26 (2H, d, J 16.0 Hz), 6.72
和6.75 (2H, d, J 8.0 Hz), 6.88和6.90 (2H), 6.99和7.01 (2H, dd,
J 2.0 Hz), 7.49和7.57 (2H, d, J 16.0 Hz)。13C NMR (CD3OD)：
δ176.53, 167.58, 167.50, 148.57, 146.33, 146.29, 145.78, 145.76,
126.80, 126.71, 122.19, 122.07, 115.47, 115.44, 114.25, 114.10,
113.97, 113.93, 75.16, 74.84, 69.11, 64.90, 41.05, 35.05。
因此，根据以上的研究结果笔者认为苦丁茶冬青苦
丁茶的主要酚类化合物为绿原酸及其衍生物，即 3-CQA、
5-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA和 4,5-diCQA。
3 结 论
HPLC-DAD分析表明苦丁茶冬青苦丁茶的多酚类化
合物的组成不同于绿茶(雨花茶)多酚类化合物的组成，
苦丁茶冬青苦丁茶中没有咖啡碱和各种茶叶儿茶素等茶
叶中的特征性化合物；利用半制备型HPLC从苦丁茶冬
青苦丁茶中分离纯化得到了5种单体化合物，通过HPLC-MS
和 NMR分析，将 5种单体化合物分别鉴定为羟基酪醇
葡萄糖苷、3-CQA、5-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA
和 4,5-diCQA。因此笔者认为苦丁茶冬青苦丁茶的主要
多酚类化合物为 3-CQA、5-CQA、3,4-diCQA、3,5-
diCQA和 4,5-diCQA，该研究结果有助于进一步研究苦
丁茶的呈味机制、药理作用及其机理。
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