全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 45(6):585-591(2015)
收稿日期:2014-06-06;修回日期:2015-06-14
基金项目:国家自然科学基金项目(31201485);高等学校博士学科点专项科研基金(20100061120036;20123702110013)
通讯作者:刘金亮，副教授，主要从事植物病毒学与分子植物病理学研究;Tel:0431-87835707，E-mail:jlliu@ jlu．edu．cn
共同第一作者:张雅琦，女，吉林珲春人，硕士研究生，主要从事分子植物病毒学研究;E-mail:zhang_ya_qi@ 163．com;
祝富祥，男，山东德州人，硕士研究生，主要从事分子植物病毒学研究;E-mail:fengxiangsui2009@ 163．com。
doi:
芜菁花叶病毒长春分离物 p3基因的克隆、
序列分析及 P3蛋白抗血清的制备
张雅琦1#，祝富祥1#，王凤婷1，潘洪玉1，李向东2，刘金亮1*
(1吉林大学植物科学学院，长春 130062;2山东农业大学植物保护学院，泰安 271018)
摘要:用 RT-PCR方法从长春感染芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus，TuMV)的十字花科蔬菜中扩增获得该病毒的 p3 基
因，并对其序列进行了比较分析。结果表明，本研究所获得的 10个 TuMV 分离物 p3基因含 1 065个核苷酸，其序列一致率
为 98．8%～99．6%，与 GenBank中其他 15个 TuMV 分离物核苷酸一致率为 80．9%～99．4%。根据 p3基因核苷酸序列构建的
系统进化树显示:25个 TuMV 分离物可分为 4 个组，本研究得到的 10 个 TuMV 分离物均属于 basal-BR 组。将 TuMV
JCR06分离物 p3基因 N 端 663 bp片段克隆至原核表达载体 pET-28a(+)，并在大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 中表达出分子
量约为 28 kDa的融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原免疫家兔，制备了 P3 蛋白的特异性抗血清。以 TuMV 侵染的萝卜
为抗原，间接 ELISA 测定抗血清的效价为 1 ∶ 2 048。Western blotting 分析表明，制备的抗血清能与诱导表达的融合蛋白发
生特异性反应。
关键词:芜菁花叶病毒;p3基因;序列分析;原核表达;抗血清制备
Cloning，sequencing of p3 gene of Turnip mosaic virus isolates in Changchun and
preparation of P3 protein antiserum ZHANG Ya-qi1#，ZHU Fu-xiang1#，WANG Feng-ting1，
PAN Hong-yu1，LI Xiang-dong2，LIU Jin-liang1 (1College of Plant Sciences，Jilin University，Changchun 130062，
China;2College of Plant Protection，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China)
Abstract:Ten Turnip mosaic virus (TuMV) isolates were collected from infected cruciferous vegetables in
Changchun． The p3 genes of these 10 isolates consisted of 1 065 nucleotides，with identities of 98．8%－99．6% at the
nucleotide level． These p3 genes shared nucleotide identities of 80．9%－99．4% with other 15 TuMV isolates available
in the GenBank． In the phylogenetic tree constructed with the complete nucleotide sequences of the p3 genes，the 25
TuMV isolates were divided into 4 groups，and the 10 TuMV isolates characterized in this resarch belonged to group
basal-BR． The N-terminnal 663 nucleotides of p3 gene in isolate JCR06 was cloned into expression vector
pET-28a(+)and transferred into E． coli BL21(DE3)pLysS． SDS-PAGE showed that the N-terminnal fragment of
p3 gene was expressed as a 28 kDa fusion protein with IPTG induction． Rabbit was immunized with purified fusion
protein to obtain the antiserum with high specificity． The titer was 1 ∶ 2 048 determined by indirect ELISA test to de-
tect TuMV in radish． Western blotting showed that the prepared antiserum could specifically bind to fusion protein．
Key words:Turnip mosaic virus (TuMV);p3 gene;sequence analysis;prokaryotic expression;antiserum
preparation
中图分类号:S432．41 文献标识码:A 文章编号:0412-0914(2015)06-0585-07
10.13926/j.cnki.apps.2015.06.004
植物病理学报 45卷
芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus，TuMV)是
危害蔬菜最严重的 5种病毒之一，寄主范围非常广
泛，可侵染 43 科 156 属的 318 种植物，是唯一侵染
芸薹属植物的马铃薯 Y 病毒属(Potyvirus)病毒［1］。
被侵染的植株初期表现为花叶、明脉、皱缩，后期出
现矮化、畸形等症状［2］，严重影响作物的产量和品
质。自然状态下，TuMV 主要通过蚜虫以非持久性
方式传播，人工接种也可以通过摩擦传毒。
TuMV 基因组为正义单链 RNA，包含一个大
的开放阅读框架(ORF) ，首先翻译成一个大的多
聚蛋白，通过自身编码的蛋白酶裂解成 10 个成熟
蛋白(P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、
NIb、CP)。在 P3蛋白编码区内部还有一个较短的
ORF，通过核苷酸移码策略翻译形成 P3N-PIPO 蛋
白［3］。相比其他蛋白，P3蛋白容易变异，在大肠杆
菌中表达会产生毒素且难于复性［4］。因此，对 P3
结构和功能了解很少，保守的结构和功能基序鲜有
报道。据报道，P3蛋白可能在病毒复制、决定致病
性、症状形成、寄主抗性、病毒移动等方面具有重要
功能［4～9］。本研究从长春感病的十字花科蔬菜上
扩增得到 10个 TuMV p3基因，并利用其中一个分
离物的 p3基因 N 端 663 bp片段进行了原核表达，
将融合蛋白纯化后作为抗原免疫家兔，获得了其特
异性抗血清，以期为研究该蛋白的结构和功能提供
帮助。
1 材料与方法
1．1 材料
10个 TuMV 分离物采自长春田间表现花叶症
状的十字花科蔬菜，分别命名为:JCRR01、JCR02、
JCR03、JCR04、JCR05、JCR06、JCC07、JCC08、
JCRa09 和 JCM10。Trizol、克隆载体 pMD18-T
Vector购自 TaKaRa 公司;PVDF 膜为北京鼎国昌
盛 生 物 技 术 有 限 公 司 产 品;大 肠 杆 菌
(E． coli)DH5α与 BL21(DE3)pLysS、原核表达
载体 pET-28a(+)均由本实验室提供。
1．2 目的基因扩增与序列分析
根据 GenBank 中 TuMV 全基因组序列，分别
于 HC-Pro 和 CI 中选取保守区段设计引物 TuLB-
HC2-F(5-GCTGCGTAACAACAGAATCA-3)和
TuLBCI2-R(5-GAGTGGGTTCGAGAAGCAA-3) ，
所扩增的片段包含完整的 p3 基因。利用 Trizol试
剂盒提取病样的总 RNA。以提取的总 RNA 为模
板，采用 RT-PCR 方法进行扩增。纯化后的 PCR
产物连接到 pMD18-T 载体，转化 E． coli DH5α 感
受态细胞，PCR 筛选阳性重组质粒。序列测定由
华大基因公司完成。依据已发表的相关分型文献，
从 GenBank中选择了 15 个具有代表性，分别来源
于不同寄主、不同地域和不同年份，并已确定致病
型的 TuMV 分离物［10～13］(表 1)。采用 DNASTAR
软件进行序列分析，用 MEGA4． 0 中的 neighbor-
joining 方法构建系统进化树。
1．3 原核表达载体的构建
参考 Nováková 等［14］的方法，利用 p3 基因 N
端 663 bp 片段进行原核表达，推测蛋白大小约为
28 kDa。根据 p3 基因 N 端 663 bp 片段序列设计
上游引物 TuJCR06-F (5-GTGAATTCGGCAC-
CAAATGGGAGGAC-3)和下游引物 TuJCR06-R
(5-GCTAAGCTTACTCGTAAGAGGACGTGACT-
GAC-3) ，5端分别引入 EcoR I和 Hind III 酶切位
点(下划线部分)。用特异引物 TuJCR06-F 和
TuJCR06-R，以重组 pMD18- JCR06 质粒为模板进
行 PCR扩增，0．8%琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。
经 EcoR I 和 Hind III 双酶切后回收目的片段，连
接到同 2 种酶双酶切的 pET-28a(+)后，转化
E． coli DH5α感受态细胞。经 PCR 扩增和酶切验
证后的阳性重组质粒进行序列测定，验证阅读框架
是否正确。
1．4 融合蛋白诱导表达及纯化
将阳性重组质粒 pET28a-JCR06 转化大肠杆
菌表达菌株 BL21(DE3)pLysS 中，pET-28a(+)空
载体作为阴性对照。挑取单克隆接种于 5 mL LB
液体培养基(含 50 μg /mL 卡那霉素)中，37℃培养
过夜，1 ∶ 100稀释到 10 mL LB 液体培养基(含 50
μg /mL 卡那霉素)中，同样条件下培养至 OD600为
0．3 ～ 0．4，加 IPTG 至终浓度为 1 mmol /L，继续培
养。分别在未诱导及诱导 2、4、6 和 8 h 时收集菌
体，加适量 TE缓冲液(pH 8．0) ，振荡悬浮，再加入
等体积 2 × SDS 样品缓冲液，煮沸 10 min，SDS-
PAGE电泳检测蛋白的表达情况。
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6期 张雅琦，等:芜菁花叶病毒长春分离物 p3基因的克隆、序列分析及 P3蛋白抗血清的制备
Table 1 Turnip mosaic virus isolates used for phylogenetic analysis
Isolates Original host Countries Year Accession No． Groups References
A1 Alliaria officinalis Itaty 1968 AB093598 basal-B ［13］
RUS2 Brassica napus Russia Unknown AB093607 world-B ［13］
Cal1 Calendula officinalis Italy 1979 AB093601 basal-BR ［10］
CP845J C． officinalis Japan 1997 AB093614 basal-BR ［10］
SGD311J Raphanus sativus Japan 1998 AB093619 Asian-BR ［10］
St48 Limonium sinuatum Italy 1993 AB093596 basal-B ［10］
USA1 B． oleracea USA 1993 AB093609 world-B ［10］
PV376-Br B． napus Germany 1970 AB093604 world-B ［10］
NZ290 B． pekinensis New Zealand 1998 AB093612 world-B ［10］
CZE1 B． oleracea Czech Republic 1994 AB093608 world-B ［10］
IS1 Allium ampeloprasum Israel 1993 AB093602 basal-B ［10］
HRD Raphanus sativus China (Zhejiang) 1998 AB093627 Asian-BR ［10］
CH6 R． sativus China (Jiangsu) 1999 AB252103 Asian-BR ［11］
TANX2 R． sativus China (Shandong) 2007 EU734433 basal-BR ［12］
WFLB06 R． sativus China (Shandong) 2006 EU734434 basal-BR ［12］
JCRR01 R． sativus China (Changchun) 2012 KP165427 basal-BR This study
JCR02 R． ssativus China (Changchun) 2012 KP165421 basal-BR This study
JCR03 R． ssativus China (Changchun) 2012 KP165422 basal-BR This study
JCR04 R． sativus China (Changchun) 2012 KP165423 basal-BR This study
JCR05 R．sativus China (Changchun) 2012 KP165424 basal-BR This study
JCR06 R． sativus China (Changchun) 2012 KP165425 basal-BR This study
JCC07 B． pekinensis China (Changchun) 2012 KP165418 basal-BR This study
JCC08 B． pekinensis China (Changchun) 2012 KP165419 basal-BR This study
JCRa09 B． campestris China (Changchun) 2012 KP165426 basal-BR This study
JCM10 B． juncea China (Changchun) 2012 KP165420 basal-BR This study
经 IPTG 诱导表达 4 h后，大量收集菌体，用缓
冲液(25 mmol /L Tris-HCl，pH 6．8;8% SDS)重
悬浮，超声裂解 5 min，获得总蛋白提取物，5 000 r /
min离心 10 min，取上清加入 15 mL 的 Ni2+-NTA
Agarose，经 Ni2+-NTA 亲和层析柱纯化得到融合的
目的蛋白。
1．5 抗血清制备与效价测定
蛋白纯化产物用适量生理盐水稀释后，加入等
体积的福氏不完全佐剂(1．5 g 羊毛脂+8 mL 石蜡
油)进行乳化，免疫注射家兔。采用肌肉注射并结
合皮下注射，每隔 7 d 注射 1 次，每次免疫剂量约
为 2～ 5 mg，共注射 4 次。最后一次注射 7 d 后采
血，制备的抗血清分装后－20℃保存［15］。
以 TuMV 侵染的萝卜叶片为抗原，采用间接
ELISA 对制备的抗血清进行效价测定，系列倍比
稀释(1 ∶ 128、1 ∶ 256、1 ∶ 512、1 ∶ 1 024、1 ∶ 2 048、
1 ∶ 4 096、1 ∶ 8 192)的抗血清作为一抗，辣根过氧
化物酶标记的羊抗兔 IgG 为二抗，待检样品 /阴性
对照吸光值(P /N)大于 2．0为阳性。
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植物病理学报 45卷
1．6 Western blotting 分析
分别收集 pET-28a(+)诱导产物、含重组表达质
粒 pET28a-JCR06的诱导产物，加入 15 mL 裂解缓
冲液进行悬浮，超声裂解，获得总蛋白提取物，离心，
收集上清。含重组表达质粒的诱导产物离心所得到
的上清，用 Ni2+-NTA 亲和层析柱纯化目的蛋白。制
备 12% SDS-PAGE凝胶，电泳后转印 PVDF膜进行
Western blotting 分析。转印后的 PVDF 膜用含 5%
脱脂奶粉的 Tris-HCl 缓冲液(TBST)室温摇床封闭
1 h，TBST 缓冲液洗涤 3次后，制备的抗血清作为一
抗(1 ∶ 2 000稀释)室温孵育 1 h，TBST 缓冲液洗涤
3次后，用碱性磷酸酶标记的 A 蛋白作为二抗
(1 ∶ 2 000稀释)室温孵育 1 h，TBST 再洗涤 3 次
后，用 NBT /BCIP充分显色后观察结果。
2 结果与分析
2．1 TuMV p3基因的扩增及克隆
从侵染 TuMV 的十字花科蔬菜叶片中提取总
RNA，经 RT-PCR扩增获得大小约为 2．1 kb 目的
片段(图 1)。将纯化后的扩增产物克隆到 pMD18-
T 载体。经菌液 PCR 验证，得到含有目的片段的
重组质粒。
Fig． 1 RT-PCR amplification of target frag-
ment including p3 gene
Lane M:DL5000 DNA Marker;Lane 1:RT-PCR product of
JCR06 isolate．
2．2 TuMV p3基因序列分析
2．2．1 一致率比较 序列测定发现，RT-PCR 扩增
产物长度为 2 100 bp，包含 1 065 bp的 p3基因，推
测编码 355个氨基酸。经 DNASTAR软件分析，本
研究获得的 10 个 p3 基因核苷酸序列一致率为
98．8%～99．6%，从不同寄主上获得的病毒分离物
在核苷酸水平上一致率没有明显差异。与
GenBank中其他 15 个 TuMV 分离物核苷酸序列一
致率为 80．9% ～ 99．4%。其中，与山东泰安 TANX2
(登录号为 EU734433)分离物核苷酸序列一致率最
高，达 99．4%;与意大利 A1(登录号为 AB093598)分
离物核苷酸序列一致率最低，为 80．9%。
2．2． 2 系统进化树分析 在与 GenBank 15 个
TuMV 分离物 p3 基因构建的系统进化树中，25 个
TuMV 分离物在系统进化树上形成 4 个组:basal-
BR、Asian-BR、world-B 和 basal-B 组，本研究获得
的 10个长春分离物均属于 basal-BR组(图 2)。10
个长春分离物与 basal-BR 组、Asian-BR 组、world-
B 组和 basal-B 组各分离物核苷酸序列一致率分别
为 91．6% ～99．4%、84．5% ～85．1%、81．3% ～84．4%、
80．9%～82．5%。
2．3 重组质粒的 PCR验证和酶切验证
本研究获得的 TuMV 分离物 p3 基因大小为
1 065 bp，编码 355 个氨基酸，推测蛋白大小为
40 kDa。根据 p3基因 N 端 663 bp片段序列设计特
异性引物［14］，对重组质粒 pET28a-JCR06 用引物
TuJCR06-F和 TuJCR06-R 进行扩增，得到大小约
663 bp的条带;用 EcoR I 和 Hind III 进行双酶切验
证并进行序列测定。测序结果证明阅读框架正确。
2．4 融合蛋白的原核表达与纯化
将验证正确的重组质粒 pET28a-JCR06 和
pET-28a(+)空载体转化到大肠杆菌 BL21(DE3)
pLysS 中，并用 1 mmol /L 的 IPTG 诱导表达，表达
得到的融合蛋白用 Ni2+-NTA 亲和层析柱进行纯
化。SDS-PAGE电泳检测结果表明，含重组表达质
粒的菌液粗提物和经纯化的蛋白在 28 kDa 处均出
现一条特异性条带，与预测大小一致，未经诱导含重
组质粒的菌液粗提物和经诱导含空载体的菌液粗提
物相应位置无明显条带(图 3) ，表明目标蛋白在大
肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 中得到了正确表达。
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6期 张雅琦，等:芜菁花叶病毒长春分离物 p3基因的克隆、序列分析及 P3蛋白抗血清的制备
Fig． 2 Phylogenetic tree of TuMV isolates based on p3 gene sequences
The Bootstrap value ＞50% is displayed． Nodes with Bootstrap value less than 50% are hidden．
Each isolate was listed by accession number-isolate name-geographic origin．
Fig． 3 SDS-PAGE analysis of expression
products
Lane M:Protein Marker;Lane 1:Induction of BL21(DE3)
pLysS;Lane 2:Induction of pET-28a(+) ;Lane 3:Non-in-
duced product of pET28a-JCR06;Lane 4-7:Induction of
pET28a-JCR06 at 2，4，6 and 8 h．
2．5 抗血清制备与检测
用纯化蛋白作为抗原免疫家兔，4 次免疫后采
血获得 TuMV P3蛋白的抗血清。以感病的萝卜叶
片为抗原，进行间接 ELISA 检测(表 2)。结果表
明抗血清稀释至 1 ∶ 2 048 时，P /N 值为 2．069，而
抗血清稀释至 1 ∶ 4 096 时，P /N 值为 1．780，因此
其效价至少是 1 ∶ 2 048。Western blotting 结果表
明，含重组表达质粒的菌液粗提物和经纯化的蛋白
在 28 kDa 处均出现一条特异性条带，而经诱导含
pET-28a(+)空载体的菌液粗提物相应位置无特异
性条带出现，表明原核表达制备的 TuMV P3 抗血
清能够与诱导产物产生特异性反应，而与菌体自身
产生的蛋白无反应(图 4)。
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植物病理学报 45卷
Table 2 Titer of anti-JCR06-P3 antiserum determined by indirect-ELISA
Absorbance /A405
Dilution of antiserum
128 256 512 1 024 2 048 4 096 8 192
TuMV infected sample (P) 0．587 0．459 0．377 0．274 0．149 0．073 0．015
Negative control (N) 0．196 0．178 0．161 0．133 0．072 0．041 0．011
P /N 2．995 2．579 2．342 2．060 2．069 1．780 1．364
Fig． 4 Western blotting analysis of antiserum
Lane M:Protein Marker;Lane 1:Induction of pET28a-JCR06
(purified) ;Lane 2:Induction of pET28a-JCR06(crude bacte-
rium extract) ;Lane 3:Induction of pET-28a(+)．
3 讨论
利用生物学和血清学研究手段表明，TuMV 分
离物存在着广泛的变异［16］。TuMV 寄主范围广、
变异类型多是因为 TuMV 基因组容易发生变
异［17，18］。根据 TuMV 基因组的全序列及部分基因
的核苷酸序列，将其分离物分为 basal-BR、Asian-
BR、world-B 和 basal-B 4 个组［13］。CP 的 N-端区
域和 P1、P3蛋白是最易变异的 3个区域［11］。本研
究依据 p3 基因序列对 25 个 TuMV 分离物进行分
组，其分组结果与依据 TuMV 基因组全序列或部
分 TuMV 基因序列进行分组的结果一致。由此可
见，根据 p3基因对 TuMV 分离物进行分组是可行
的。本研究得到的 10 个 TuMV 分离物均属于
basal-BR组，继 Tian 等［19］在中国发现 TuMV 的
basal BR组分离物后，又一次证实 basal-BR 组分
离物在中国的存在及不同的地理分布。
相比 TuMV 编码的其他蛋白，P3 具有高度变
异性，结构和功能上的保守区域鲜有报道，在大肠
杆菌中表达产生毒性，很难复性，所以对其结构和
功能了解较少［4～9］。进一步了解 TuMV P3 蛋白的
功能，对深入研究该病毒的致病机制具有重要意
义。P3蛋白在受病毒侵染的植株体内含量很低，
一般 P3 蛋白抗体难以检测到［14］，本研究利用
TuMV 侵染的萝卜为抗原测定的抗血清效价仅为
1 ∶ 2 048，推测可能是因为 P3 蛋白在感病寄主体
内表达量低。本研究最初利用全长 p3基因构建原
核表达载体，但未能成功表达出 P3蛋白，因此参考
Nováková等［14］的方法，选用 TuMV p3 基因 N 端
663 bp片段进行原核表达，克服了全长 p3 基因在
大肠杆菌中表达产生毒性的缺点，利用纯化的融合
蛋白制备了多克隆抗体，用此抗体能够检测感病植
物中 P3蛋白的表达，为下一步研究 P3蛋白亚细胞
和组织表达定位、筛选与其互作的寄主蛋白等提供
了基础，从而进一步明确 TuMV P3 蛋白在病毒致
病过程中的功能。
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责任编辑:于金枝
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