全 文 ：浙江大学学报 (农业与生命科学版 )　 27( 2): 161～ 164, 2001
Journal of Zhejiang University ( Ag ric. & Life Sci. )
　　收稿日期: 2000-03-26
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 ( 39870509)
作者简介: 卢 钢 ( 1968- ) ,男 ,硕士 ,浙江东阳人 ,从事蔬
菜栽培生理与分子生物学研究 .
文章编号: 1008-9209( 2001) 02-0161-04
白菜和芜菁杂种小孢子培养研究
卢 钢 , 曹家树
(浙江大学 蔬菜研究所 ,浙江 杭州 310029)
摘　要: 对白菜和芜菁的 6个杂种 F1代进行游离小孢子培养 ,结果表明 ,不同组合间小孢子胚胎发生
频率存在很大差异 ,胚产量最高的两个组合“矮脚黄×气死孩”和 “苏州青×气死孩”平均每蕾分别产生
21. 1和 17. 2个胚 . 诱导杂种胚状体发生的最佳时期是单核中期至单核靠边期 . 33℃、 24 h热激处理可
明显提高杂种小孢子胚的诱导率 ,培养基中加入活性炭也可改善胚的分化 .
关　键　词: 白菜 ; 芜菁 ; 杂种 ; 小孢子培养
中图分类号: S634. 3; Q813. 1　　　文献标识码: A
LU Gang, CAO Jia-shu ( Institute of Vegetable Science , Zhejiang Universit y , Hangzhou 310029, China)
Study on microspore culture of the hybrids between Chinese cabbage and turnip . Journal of Zhejiang
Univ ersity ( Ag ric. & Life Sci. ) , 2001, 27( 2): 161～ 164
Abstract: M icro spo res o f six hybrids between non-headed Chinese cabbage (Brassica campestris ssp. chi-
nensis) a nd turnip (B . campestris ssp. rapifera Mat zg ) were cultured . The embryoid yield va ried with
th e differ ent ma terials used, and the two genotypes w ith the highest embryoid yield, B . campestris ssp.
chinensis cv . aijiaohuang and shuzhouqing crossed with B . campestris ssp. rapifera Matzg cv. qisihai pro-
duced 21. 2 and 17. 2 embryoids per flow er bud. The optimum period of inducing embryo w as uninucleate
period. Pr eheat of 33℃ fo r 24 h befor e the microspor es were transfer red to the culture condition of 25℃
could obv iously enhance the yields, and the activ e ca rbon could improve embryo quality.
Key words: Chinese cabbage; turnip; hybrid; microspore culture
　 　白菜 ( Brassica campestris L . ssp chinensis
Manino )在我国蔬菜生产中占有重要的地位 ,
在南方蔬菜周年供给上有着举足轻重的作用 .
进行白菜抗病、抗逆性育种时 ,常常需要利用芸
薹种其他亚种的种质资源 ,而利用常规育种方
法将多基因控制的隐性性状渗入到目标材料则
需要经过许多代的选择过程 . 通过游离小孢子
培养的方法获得双单倍体 ( Double Haploid;
DH)植株 ,可以大大节省纯化时间和工作量 [1 ] .
自 Li tchter等 [2 ]首次从甘蓝型油菜小孢子培养
中获得胚状体以后 ,已相继在甘蓝、白菜、芥菜
等芸薹属作物上获得了成功 [3～ 5 ] ,并被用于种
间杂种的研究 [6 ] .但迄今尚没有白菜杂种 F1代
小孢子培养的报道 . 由于芸薹属不同种的小孢
子胚胎发生各有其自身的规律 ,不能相互完全
套用 ,所以我们对白菜不同亲本间杂种小孢子
培养的可能性进行了比较 ,并对影响杂种小孢
子产量和质量的有关因子进行了研究 ,旨在寻
求白菜杂种小孢子胚胎高频率发生的培养
条件 .
1　材料与方法
1. 1　试验材料
　　供试材料为浙江大学蔬菜研究所细胞与分
子生物学实验室所配制的 F1代杂种 .以白菜为
母本 ,芜菁为父本 ,共 6个组合分别为矮脚黄
( cv. aijiaohuang )×气死孩 ( cv. qisihai ) ,芸薹
( cv . yuntai )×气死孩 ,苏州青 ( cv. suzhouqing )
×气死孩 ,小八叶 ( cv. xiaobaye)×气死孩 ,矮
脚黄×耐病芜菁 (cv . naibingw uqing )和芸薹×
耐病芜菁 . 1998年和 1999年两度种植在浙江
大学蔬菜试验场 ,常规栽培管理 .
1. 2　实验方法
1. 2. 1　小孢子的分离　　将不同时期采集的
花蕾放入培养皿中 ,加 6% ( w /v )次氯酸钙溶液
表面消毒 15 min. 用无菌水冲洗 3次 . 置于小
研钵中 ,加少量 B5洗涤溶液 [ 4]用平头玻棒碾碎
花蕾 . 双层滤网 ( 63 /44μm)过滤 . 将滤液收集
在 10 mL离心管中 , 900 r /min离心 3次 ,加 B5
洗涤培养基 ,再离心 . 如此重复 3次 .
1. 2. 2　游离小孢子培养　　将小孢子悬浮于
经过滤灭菌的 NLN-13培养基中 ,用血球计数
器将小孢子密度调至 1× 105 /mL. 每个培养皿
中加入 3 mL悬浮液 , Parafilm封口后置于不同
温度下进行暗培养 .
1. 2. 3　胚培养　　出现肉眼可见的胚状体后 ,
置摇床 ( 60 r /min)于 25℃暗培养 . 形成子叶形
胚状体时转入 B5固体培养基上 ,在 25℃光暗
交替条件下继续培养 . 比较不同杂交组合小孢
子胚的发生能力 ,在培养过程中进行高温预处
理实验以及加活性炭效应实验 ,利用倒置显微
镜观察小孢子的发育状况 .
2　试验结果
2. 1　不同供体材料胚状体产量的差异
　　在供试的 6份材料中 ,有 5个杂种获得了
胚状体 .但不同亲本间杂交所得 F1代小孢子胚
的诱导效率差异很大 ,以矮脚黄×气死孩、苏州
青×气死孩的胚产量较高 ,平均每花蕾可产胚
21. 2和 17. 2个 ,而小八叶×气死孩的胚产量
很低 ,只有 0. 53个 ,芸薹×耐病芜菁经多次重
复也未能诱导出胚状体 . 不结球白菜的不同变
种与同一芜菁品种杂交 ,胚的产量不同 .几个亲
本间比较 ,以芸薹为母本的组合胚产量 (平均产
胚 10. 4个 )明显低于矮脚黄 (平均 13. 8个 ) ,这
与李岩等 [4 ]的报道非常接近 .
表 1　不同杂交组合游离小孢子培养的胚产量
Table 1　 The variation of th e embryoid yield
in dif ferent materials
杂交 组 合 培养花蕾数 总胚 数 胚产量 /个 蕾 - 1
矮脚黄×气死孩 20 421 21. 2
芸薹×气死孩 20 56 2. 8
苏州青×气死孩 30 516 17. 2
小八叶×气死孩 30 16 0. 53
矮脚黄×耐病芜菁 40 260 6. 5
芸薹×耐病芜菁 40 0 0
2. 2　小孢子不同发育阶段胚状体发生能力的
比较
　　取矮脚黄×气死孩 F1代不同大小的花蕾
以荧光显微法观察细胞核 ,以确定小孢子发育
阶段 ,并比较各阶段小孢子培养的胚产量 .结果
表明 ,小孢子发育阶段与花蕾长度密切相关 (表
2) ,当花蕾长 2. 1～ 3. 0 mm时 , 80. 5%的小孢
子处于单核中期和单核靠边期 ,这时培养的小
　 表 2　杂种不同长度花蕾小孢子的发育阶段及胚产量
Table 2　 Embryoid yield and g row th period of microspore derived f rom the f low er buds of dif f eren t length
花蕾大小 /mm 不同阶段小孢子所占比例 /%四分体 单核中期 单核靠边期 双核期 三核期 接种花蕾数 胚状体数 胚产量 /个 蕾
- 1
< 1. 0 100 40 0 0
1. 1～ 2. 0 39. 6 50. 1 10. 3 30 322 10. 7
2. 1～ 4. 0 25 55. 5 19. 5 30 731 24. 4
3. 1～ 4. 0 6. 7 75. 3 18 40 249 6. 0
> 4. 0 4. 8 95. 2 60 47 0. 8
162　　　　 　 浙 江 大 学 学 报 (农业与生命科学版 ) 　 第 2 7卷　
孢子胚状体产量最高 . 所以小孢子发育时期对
小孢子培养的胚产量影响很大 . 对于矮脚黄×
气死孩的杂种 ,取长度 2. 1～ 3. 0 mm的花蕾进
行培养可以获得较高的胚产量 . 但由于不同基
因型间花蕾的长度稍有差异 ,在实际操作中 ,应
当对供体株作细胞学鉴定 ,以找出本品种的适
宜蕾长标准 .
2. 3　高温前处理对胚产量的影响
表 3　不同温度预处理对杂种小孢子产量的影响
Table 3　 Effect of di ff eren t high temperature
on embryoid yield of h ybrids
温 度 时间 /h 接种花蕾数 胚状体数 产胚率 /个 蕾 - 1
35℃ 24 15 48 3. 2
48 15 0 0
72 20 0 0
30℃ 24 15 352 23. 5
48 15 190 12. 7
72 20 0 0
30℃ 30 62 2. 4
25℃ 30 0 0
　　高温预处理对于矮脚黄×气死孩的杂种
F1代胚诱导的影响见表 3. 30℃处理 24 h胚
产量可达 23. 5个 ;而不进行热激处理 ,一直在
30℃下恒温培养的 ,虽有小孢子的分裂和原胚
形成 ,但数量上明显低于热激处理的 . 25℃恒
温培养的小孢子胚没有发生分化 . 35℃高温处
理的效果也不如 33℃处理的 .从处理时间上来
看 ,经 24 h处理的分化频率最高 , 48 h处理后
胚分化频率下降 ,而处理 72 h则胚状体不能
发生 .
2. 4　活性炭对小孢子胚产量的影响
　　在每个培养皿中加入 0. 1 mL 0. 01 g /mL
活性炭琼脂糖悬浮液后 ,胚产量的增加在不同
的组合中表现不同 ,对于矮脚黄×耐病芜菁加
活性炭的处理胚产量明显增加 ,而矮脚黄×气
死孩总胚状体数不变 ,但在两个组合中加活性
炭的处理都明显地提高了成熟胚所占的比例 ,
分别从 54. 5%和 37. 5%上升至 71. 6%和
60. 7% ,球形胚及其畸形胚比例也大大减少 .
　 表 4　活性炭对杂种胚发育的影响
Table 4　 Ef fect of activ e carborn on emb ryo dev elopment of hybrids
组合 处 理 球形胚 心形胚 鱼雷形胚 成熟胚 畸形胚 总胚状体
矮脚黄×气死孩 不加活性炭 13 0 2 35 14 64
加活性炭 7 0 3 48 9 67
矮脚黄×耐病芜菁 不加活性炭 3 1 1 6 5 16
加活性炭 4 0 1 17 6 28
3　讨　论
　　高效率的杂种胚状体发生将为遗传图谱构
建、基因定位以及品种改良提供有效途径 .虽然
白菜和芜菁 6个杂种 F1代中的 5个基因型能
诱导胚状体的分化 ,但他们之间的诱导效率有
明显的差异 . 单蕾胚产量最高的可达 15个以
上 ,低的只有 0. 53个 . 不结球白菜不同变种之
间胚诱导发生率不同 ,矮脚黄亲本胚诱导效率
较高 [ 4] ,在本实验中以其为母本的杂种 F1代胚
产量也较高 . 杂种小孢子胚的分化同两亲本成
胚难易的关系有待进一步探索 . 小孢子发育阶
段对胚产量有决定性的作用 , 2. 1～ 3. 0 mm范
围内小孢子发育正处于单核期 ,小孢子胚产量
最高 .较大的或较小的花蕾其胚产量都下降 .而
对于甘蓝类蔬菜 ,选择双核期花粉占较大比例
时 ,可以获得理想的游离小孢子培养效果 [3 ] .高
温前处理可以大大促进胚的发育 ,其中以 33
℃、 24 h最为适宜 ,处理温度过高或处理时间
过长 ,胚产量都下降 .不同基因型间可以存在一
定差异 ,B. juncea , B . napus和 B . carinata这些
异源四倍体种 ,需要在 32～ 35℃处理 3～ 4 d,
才能有效地诱导胚胎发生 .而对于甘蓝类、白菜
类二倍体种 ,对高温处理更为敏感 ,处理时间过
长 ,对诱导胚胎发生是不利的 [8 ] .本实验结果表
明白菜和芜菁杂种对高温处理也较敏感 . 加活
性炭可以克服毒性物质的危害 ,由于不同的基
因型早期释放的有毒物质不同 ,活性炭的作用
效果有很大的差异 . 低胚胎发生率的基因型往
163　第 2期 　 卢钢 , 曹家树　　白菜和芜菁杂种小孢子培养研究 　 　　　　
往释放有毒物质的能力比胚胎发生率高的基因
型要强得多 ,所以加活性炭的效果明显 .活性炭
处理对胚产量的影响在不同基因型上表现不
同 ,但对成熟胚的发育有明显的促进作用 .而花
椰菜上的试验表明 ,部分基因型加入活性炭后 ,
胚胎发生率反而下降 [ 7] ,其作用机理有待进一
步探索 .
参考文献 References:
[ 1 ]　 Cao M Q, Li Y, Liu F, et al . Application of anth er cul-
tu re and isolated microspore culture to vegetable crop im-
provement [ J ]. Acta Hort icul ture, 1995, 392: 27-38.
[ 2 ]　 Litcher R. Induction of haploid plants from isolated
pollen of Brassica napus [ J] . Z P f lanzen phsiol , 1982,
105: 427-434.
[ 3 ]　 Tak ahata Y, KellerW A. High f requency emb ryogenesis
and plan t regeneration in isolated micropore culture of
Brassica oleracea L [ J] . Plant Sci , 1991, 74: 235-242.
[ 4 ]　 LI Yan, LIU Fan, CAO Ming-qing (李岩 ,刘凡 ,曹鸣
庆 ) . Embryogen esi s and plan t regeneration from isolated
microspore cultures of Brassica campes tris ssp chinensis
[ J ]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica (华北农学报 ) ,
1993, 8( 3): 92-97. ( in Chinese)
[ 5 ]　 Hiramatsu M , Odahara K, Matsue Y. A surv ey of mi-
crospore embryogenesi s in leaf mus tard ( Brassica juncea)
[ J] . Acta Horticulture, 1995, 392: 139-145.
[ 6 ]　 ZHOU Yong-ming (周永明 ) , Scarth R. Plant regenera-
tion f rom is olated microspore cul ture of h ybrids betw een
Brassica napus and B. juncea[ J ]. Acta Agronomica Sinica
(作物学报 ) , 1996, 22( 4): 399-402. ( in Chines e)
[ 7 ]　 zhang D S, Cao M Q, Qing Z W . Ef fect s of genotype
and active carborn on microspore embryogenesis in broc-
coli ( Brassica oleracea ssp i talica) [ J ]. Crucif era newslet-
ter . 1998, 20: 45-47.
[ 8 ]　 LIU Gong-she, LI Yan, LIU Fan, et al (刘公社 ,李岩 ,
刘 凡 ,等 ) . Ef fects of high temperatu re on the cultures
of isolation microspores in B rassica cam pestris ssp
pekinensis [ J ]. Acta Botanica Sinica (植物学报 ) , 1995,
37( 2): 140-146. ( in Chinese)
(责任编辑　邓君奇 )　　
164　　　　 　 浙 江 大 学 学 报 (农业与生命科学版 ) 　 第 2 7卷