全 文 ：第４４卷　第４期
２０１６年４月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．４４ Ｎｏ．４
Ａｐｒ．２０１６
网络出版时间：２０１６－０３－１４　０８：４５ ＤＯＩ：１０．１３２０７／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｎｗａｆｕ．２０１６．０４．０１６
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３９０．Ｓ．２０１６０３１４．０８４５．０３２．ｈｔｍｌ
花椒根腐病生防芽孢杆菌的筛选鉴定及
定殖和防治效果
　［收稿日期］　２０１４－０９－１０
　［基金项目］　国家自然科技资源共享平台项目（２００５ＤＫＡ２１２０７－１３）
　［作者简介］　李姝江（１９８３－），女，四川宜宾人，副教授，博士，硕士生导师，主要从事林木病害生物防治研究。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｓｈｕｊｉａｎｇｓｕｍｅｒ＠１６３．ｃｏｍ
　［通信作者］　朱天辉（１９６３－），男，重庆开县人，教授，博士，博士生导师，主要从事林木病害及其防治研究。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｕｔｈ１２２７＠１２６．ｃｏｍ
李姝江，朱天辉，谯天敏，韩　珊
（四川农业大学 林学院，四川 成都６１１１３０）
［摘　要］　 【目的】对花椒根腐病生防芽孢杆菌进行分离、筛选、定殖和防效评价，为开发高效、稳定、持久的生
物农药提供理论与实践基础。【方法】采用稀释平板涂布法分离健康花椒根际土中的芽孢杆菌，利用点菌法和打孔法
２次筛选拮抗效果最佳的芽孢杆菌，根据形态特征和生理生化试验对其进行初步鉴定，并测定其对１年生花椒根腐病
的防治效果。用链霉素标记拮抗芽孢杆菌，并检测该菌在花椒根际及根内土壤中的定殖动态，以此为基础，运用灌根
法对花椒根腐病进行预防和治疗处理，计算发病率、病情指数和防治效果。【结果】在分离获得的２０株芽孢杆菌中，
编号为Ｂ３的菌株拮抗作用最强，抑菌圈直径达２６．０ｍｍ，高温处理后仍具有活性，初步确定其为蜡样芽孢杆菌Ｂａ－
ｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ。盆栽试验结果表明，花椒根腐病发病率和病情指数随Ｂ３菌株发酵液稀释倍数增加而增加，Ｂ３发酵液原
液至稀释２００倍以下防治效果显著。定殖动态试验结果表明，无论病原菌存在与否，抗３００μｇ／ｍＬ链霉素的突变菌
株均能在根际土壤和根内定殖，但根际土菌量大于根内，且早于根内达到峰值，随接种时间延长，定殖量下降并维持稳
定。田间试验中，突变菌株Ｂ３无论预防还是治疗试验，均能发挥很好的效果，并优于原始菌株和化学农药双效灵。【结
论】菌株Ｂ３能在花椒根际和根内很好地定殖、排挤病原物，具有对花椒根腐病进行生物防治的潜力和良好的发展前景。
［关键词］　花椒；根腐病；腐皮镰刀菌；芽孢杆菌；生物防治
［中图分类号］　Ｓ４３５．７３ ［文献标志码］　Ａ ［文章编号］　１６７１－９３８７（２０１６）０４－０１１４－０９
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ
Ｂａｃｉｌｕｓ　ｓｐ．ａｇａｉｎｓｔ　ｒｏｏｔ　ｒｏｔ　ｏｆ　Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ　ｂｕｎｇｅａｎｕｍ Ｍａｘｉｍ．
ＬＩ　Ｓｈｕ－ｊｉａｎｇ，ＺＨＵ　Ｔｉａｎ－ｈｕｉ，ＱＩＡＯ　Ｔｉａｎ－ｍｉｎ，ＨＡＮ　Ｓｈａｎ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ，Ｓｉｃｈｕａｎ６１１１３０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ
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ｃｏｎｔｒｏｌ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｏｎｅ－ｙｅａｒ－ｏｌｄ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｐｒｉｃｋｌｙ　ａｓｈ　ｒｏｏｔ　ｒｏｔ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｄｅｒｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ
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ｐｈｅｒｅ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｐｒｉｃｋｌｙ　ａｓｈ．Ｔｈｅｎ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｐｒｉｃｋｌｙ　ａｓｈ　ｒｏｏｔ　ｒｏｔｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｂｙ　ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌｉｎｇ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ，ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎｄｅｘ，ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｅｆｆｅｃｔ　ｗｅｒｅ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ａｍｏｎｇ　ｔｈｅ　２０　Ｂａ－
ｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ，ｔｈｅ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　Ｂ３ｗａｓ　ｔｈｅ　ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｚｏｎｅ　ｄｉ－
ａｍｅｔｅｒ　ｏｆ　２６．０ｍｍ．Ｉｔ　ｋｅｐｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｆｔｅｒ　ｈｉｇｈ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ａｎｄ　ｗａｓ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ａｓ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ．Ｐｏｔ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎｄｅｘ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｌｏｎｇ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｄｉｌｕ－
ｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　Ｂ３ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｌｉｑｕｉｄ　ｄｉｌｕｔｅｄ　ｂｙ　ｌｅｓｓ　ｔｈａｎ　２００ｔｉｍｅｓ　ｗｅｒｅ　ｒｅ－
ｍａｒｋａｂｌｅ．Ｔｈｅ　ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｄｙｎａｍｉｃ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ　ｓｔｒａｉｎ　ａｇａｉｎｓｔ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　ｏｆ　３００
μｇ／ｍＬ　ｃｏｕｌｄ　ｃｏｌｏｎｉｚｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｏｏｔ　ｉｎｔｅｒｉｏｒ　ａｎｄ　ｒｈｉｚｏｐｈｅｒｅ　ｎｏ　ｍａｔｔｅｒ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｅｘｉｓｔｉｎｇ　ｏｒ　ｎｏｔ．Ｂｕｔ　ｔｈｅ
ｑｕａｎｔｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｈｉｚｏｐｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｍｏｒｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｅａｋ　ｖａｌｕｅ　ａｐｐｅａｒｅｄ　ｅａｒｌｉｅｒ　ｔｈａｎ　ｒｏｏｔ　ｉｎｔｅｒｉｏｒ．Ｔｈｅ　ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ
ｑｕａｎｔｉｔｙ　ｄｅｃｌｉｎｅｄ　ａｎｄ　ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ　ｓｔａｂｌｙ　ａｌｏｎｇ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｏｆ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ．Ｉｎ　ｆｉｅｌｄ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｔｈｅ
ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ　ｓｔｒａｉｎ　Ｂ３ｈａｄ　ｇｏｏｄ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ａｎｄ　ｗａｓ　ｂｅｔｔｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｏｒｉｇｉｎａｌ　ｓｔｒａｉｎ　ａｎｄ　ｍｉｘｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｃｏｐｐｅｒ
ｃｏｍｐｌｅｘ（ＣＣＭＡ）ｉｎ　ｂｏｔｈ　ｐｒｅｖｅｎｔ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｔｅｓｔｉｎｇ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】Ｓｔｒａｉｎ　Ｂ３ｃａｎ　ｃｏｍｍｅｎｄａｂｌｙ
ｃｏｌｏｎｉｚｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｏｏｔ　ｉｎｔｅｒｉｏｒ　ａｎｄ　ｒｈｉｚｏｐｈｅｒｅ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｐｒｉｃｋｌｙ　ａｓｈ　ａｎｄ　ｓｕｐｐｌａｎｔ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎ．Ｔｈｕｓ，ｉｔ　ｈａｓ
ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｐｒｉｃｋｌｙ　ａｓｈ　ｒｏｏｔ　ｒｏｔ　ａｎｄ　ｆａｖｏｕｒａｂｌｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｐｒｏｓｐｅｃｔ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ　ｂｕｎｇｅａｎｕｍ　Ｍａｘｉｍ．；ｒｏｏｔ　ｒｏｔ；Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｏｌａｎｉ（Ｍａｒｔ）Ｓａｃｃ．；Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．；
ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ
　　花椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ　ｂｕｎｇｅａｎｕｍ　Ｍａｘｉｍ．）属芸
香科花椒属植物，是一种重要的油料、香料、药材等
多用途树种，在中国栽培的范围广、产量高［１］，为目
前四川省内发展的主要经济林种之一。但花椒易受
到根腐病［２］、流胶病［３］、锈病［４］和枯穗病［５］等２０余
种病害的危害，其中由腐皮镰刀菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｏｌａｎｉ
（Ｍａｒｔ）Ｓａｃｃ．）［１－２］引起的花椒根腐病导致根系腐
烂，地上部分叶片变小、枝条发育不全，最终导致整
株枯死，严重影响花椒产量和品质，给花椒产业造成
重大的经济损失。迄今对花椒根腐病病原鉴定及其
生物学特性［１］、发生特点［２］及防治［６］研究较为广泛。
蒋其军等［７］选用根腐净、福美双等药剂对该病进行
田间防治，得到较好防效。化学防治虽是一种有效
的防治手段，但存在病原菌抗药性、环境与食品安
全、药害等许多实际问题，一些化学杀菌剂在许多发
达国家和地区已严格限制使用［８］。而与环境友好的
生物农药越来越受到人们的青睐，是未来农业可持
续发展的重要组成部分［９－１０］。花椒根腐病是一种土
传根病，侵染循环尚不明显，发病土壤环境相对稳
定，最适宜于生物防治。但目前有关花椒根腐病的
生物防治，仅见朱天辉和杨启智［１１］采用腐皮镰刀菌
培养液诱导花椒抗根腐病的初步研究。
芽孢杆菌作为自然界中分布最为广泛且极易分
离培养的一类细菌，具有广谱抗菌活性和极强的抗
逆能力［１２］。目前，在植物病害生物防治领域已得到
广泛应用，如在辣椒［１３］、水稻［１４］、小麦［１５］、烟草［１６］等
多种植物上显示出很好的防效，然而有关将花椒根
际土壤中的芽孢杆菌应用于根腐病这一经济林木重
大病害防治的研究尚未见报道。此外，成功的生物
防治必须具备两个条件：生防菌能在引进位点有效
地定殖，并且能在侵染位点表现出与离体测定时相
同的拮抗作用［１７］。因此，探索生防菌的定殖动态和
消长规律成为生物防治研究的重要内容。本研究以
健康花椒根际土中芽孢杆菌为筛选对象，通过初筛、
复筛、盆栽试验获得目标菌株，经发酵培养后进行定
殖动态和田间生物防治研究，以期为开发环保型生
防制剂提供技术支撑。
１　材料与方法
１．１　材　料
供试花椒样品为１年生大红袍花椒（Ｚａｎｔｈｏｘ－
ｙｌｕｍ　ｂｕｎｇｅａｎｕｍ Ｍａｘｉｍ．）苗木，由汉源清溪花椒种
植林地提供，用四川于盆栽防效和定殖试验。
于四川汉源清溪花椒种植林地采集健康花椒根
际土壤（表层１０ｃｍ以下）装入无菌样品袋带回实验
室，用于芽孢杆菌的分离。
供试盆栽试验土壤采自四川省雅安市大兴镇林
木育种基地，采样深度为０～３０ｃｍ，紫色土。土壤
理化性质为：ｐＨ　７．１，全磷含量１．８ｇ／ｋｇ，全钾含量
８．４ｇ／ｋｇ，全氮含量１．２ｇ／ｋｇ，速效磷含量２５．３２
ｍｇ／ｋｇ，速效钾含量 ３５．３６ ｍｇ／ｋｇ，碱解氮含量
３１．５６ｍｇ／ｋｇ，有机质含量２４．３ｇ／ｋｇ。样土混合均
匀后，装袋（５ｋｇ／袋），共计１４０袋，用体积分数
０．１％甲醛溶液熏蒸灭菌。
供试病原菌为腐皮镰刀菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｏｌａｎｉ
（Ｍａｒｔ）Ｓａｃｃ．），分离于四川汉源清溪花椒根腐病发
病林地中发病花椒的根茎组织，由四川农业大学森
林保护省级重点实验室提供。将该菌于２５℃培养
５１１第４期 李姝江，等：花椒根腐病生防芽孢杆菌的筛选鉴定及定殖和防治效果
７～１０ｄ后，收集其分生孢子，用无菌水稀释成１０５
ＣＦＵ／ｍＬ，用于盆栽防效和定殖试验。
抗生素为纯度９９．９％链霉素（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，
Ｓｔｒ），购自上海生物工程有限公司。杀菌剂为２０％
双效灵，购自四川瑞进特科技有限公司。
１．２　根际土芽孢杆菌的分离与纯化
采用稀释平板涂布法［１８］。称１０ｇ采集的根际
土壤样品于盛有９０ｍＬ无菌水和少量玻璃珠的三
角瓶中，充分混匀后制成土壤悬浮液，１００℃水浴加
热５ｍｉｎ。冷却后，无菌条件下取１ｍＬ加入装有９
ｍＬ无菌水的试管中，充分混匀得到１０－２的稀释液，
按照此法依次稀释，分别获得１０－３，１０－４，１０－５和
１０－６的稀释液，分别取各浓度土壤稀释液０．１ｍＬ，
将其涂布在ＬＢ培养基上，倒置在３０℃恒温培养箱
中，４８ｈ后根据菌落形态特征，挑取单菌落进行平
板划线，保存于斜面备用。
１．３　生防芽孢杆菌的筛选
初筛：将斜面培养的产孢的腐皮镰刀菌用无菌
水洗出分生孢子，用移液枪取１ｍＬ加入无菌培养
皿中，倒入４５℃左右的ＰＤＡ培养基１５ｍＬ，充分混
合均匀，冷却后制成含菌平板。采用点菌法［１９］，接
种分离获得的芽孢杆菌，倒置在３０℃培养箱中，２４
ｈ后观察有无抑菌圈产生。
复筛：将初筛筛选出的抑菌活性较强的芽孢杆
菌菌株活化后分别接种于ＬＢ肉汤培养液中，３０℃、
１２０ｒ／ｍｉｎ的摇床中培养２４ｈ后，作为种子液以１∶
１体积比加入含有葡萄糖的ＬＢ肉汤培养基，３０℃、
１２０ｒ／ｍｉｎ的恒温摇床中培养４８ｈ后取出，取上清
液，３　５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，再取上清液用打孔
法［２０］进行抑菌试验，２４ｈ后观察有无抑菌圈产生。
对筛选出的芽孢杆菌发酵液进行１２１ ℃、１５
ｍｉｎ高温处理，按照上述方法检测拮抗活性的有无。
１．４　生防芽孢杆菌的鉴定
根据菌体和菌落形态特征、革兰氏染色等，结合
生理生化试验，参照《常见细菌系统鉴定手册》［２１］进
行鉴定。
１．５　盆栽防效试验
取１０５　ＣＦＵ／ｍＬ的腐皮镰刀菌分生孢子悬液
５０ｍＬ，接种于１年生盆栽花椒苗木根系，７ｄ后用
筛选出的生防菌采用１．３节中的方法发酵后，取其
发酵液，分不同浓度（原液及稀释５０倍、１００倍、２００
倍、５００倍、１　０００倍），采用灌根法［２２］对花椒苗进行
处理，每盆５０ｍＬ，并以无菌水和无菌培养液为对
照，每处理１０盆，３０ｄ后进行病害调查统计，并计算
发病率、病情指数和防治效果。病害分级标准：０
级，根部健康；Ⅰ级，１／５以下侧根腐烂；Ⅱ级，１／５至
１／３侧根腐烂；Ⅲ级，１／３至２／３侧根腐烂；Ⅳ级，２／３
以上侧根腐烂甚至整株死亡。
发病率＝（发病株数／总接种株数）×１００％；
病情指数＝［（各病级株数×代表级值）／（总株
数×发病最高级的代表级值）］×１００；
防治效果＝［（对照病情指数－处理病情指数）／
对照病情指数］×１００％。
１．６　生防芽孢杆菌在花椒根际及根内土壤中的定
殖动态
１．６．１　生防芽孢杆菌抗链霉素标记及突变菌株的
拮抗性和稳定性　参照谯天敏等［１７］的方法，取芽孢
杆菌发酵液１００μＬ涂布于含２０μｇ／ｍＬ链霉素的
ＬＢ培养基上，３０℃培养３ｄ，确定天然抗药性后，挑
取单菌落依次在含４０，６０，１２０，１８０，２４０，３００μｇ／ｍＬ
链霉素的ＬＢ培养基上继代培养，直至筛选出的突
变体菌株对链霉素耐药达３００μｇ／ｍＬ。
原始菌株与突变菌株活化后，与病原菌对峙培
养，３０℃培养５ｄ，观察培养皿中有无拮抗带，记录
拮抗带的宽度并计算抑制率，每处理重复３次。抑
制率＝（对照菌落直径－处理菌落直径）／对照菌落
直径×１００％。
参照周林等［２３］的方法，将突变菌株在抗性平板
上继代培养，每隔３ｄ转接１次，转２０次后保存ＬＢ
斜面，３０ｄ后将保存于斜面的菌株分别转接于ＬＢ
平板（含３００μｇ／ｍＬ链霉素）和ＬＢ培养液。观察
ＬＢ平板上突变菌株的生长情况；ＬＢ培养液中的突
变菌株培养２４ｈ后，涂布于ＬＢ平板，然后用灭菌牙
签随机挑取１００个菌落点接种到含３００μｇ／ｍＬ链
霉素的ＬＢ平板上，３０℃培养３ｄ，以突变菌株所占
百分比计算其稳定性。
１．６．２　突变菌株在花椒根际及根内土壤中的定殖
与消长动态　突变菌株采用１．３节的方法发酵后，
用无菌水调节菌液的ＯＤ值，制成１０８　ＣＦＵ／ｍＬ菌
剂（平板计数法统计带菌量）。分别用１０５　ＣＦＵ／ｍＬ
腐皮镰刀菌分生孢子悬液和无菌水各５０ｍＬ接种１
年生盆栽花椒苗木根系，７ｄ后灌根法接种突变菌株
菌剂１００ｍＬ，每处理３０盆。于接种后的第１，５，１０，
２０，４０，８０天对根系组织和根际土进行取样，用含
３００μｇ／ｍＬ链霉素的ＬＢ培养基检测突变体菌株数
量（每克根系组织或根际土的含菌量对数值）。
１．７　生防芽孢杆菌对花椒根腐病的田间防治效果
田间防治试验在四川汉源清溪花椒种植林地进
６１１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４４卷
行。
预防处理方法为：选择１年生尚未发病花椒林
地内的花椒苗木，用１．３节制作的原始菌株和１．６．１
中筛选的突变菌株菌剂原液及二者的１０倍、１００
倍、５００倍、１　０００倍稀释液灌根，每株１００ｍＬ，每处
理３０株，每年春季施用１次，２０１１－２０１３年连续３
年施用，以双效灵１　０００倍液、无菌水和无菌培养液
为对照。
治疗处理方法为：选择３年生发病花椒林地内
的花椒植株，用１．３节制作的原始菌株及１．６．１中
筛选的突变菌株菌剂原液和１０倍、１００倍、５００倍、
１　０００倍稀释液灌根，每株１００ｍＬ，每处理３０株，
春、夏各１次，２０１１－２０１３年连续３年施用，以双效
灵１　０００倍液、无菌水和无菌培养液为对照。
以上处理全部完成后８０ｄ进行病害调查，分级
标准为：０级，整株健康；１级，叶片变小、枝条发育不
全；２级，整株死亡。按１．５节的方法计算发病率、
病情指数和防治效果。
１．８　数据分析
试验数据采用Ｅｘｃｅｌ　２００７和ＳＰＳＳ　１３．０软件
分析处理，采用ＬＳＤ法进行多重比较（Ｐ＜０．０５）。
２　结果与分析
２．１　生防芽孢杆菌的初筛与复筛
根据菌落颜色、形态、光学特性以及是否产生色
素等特征进行合并后，从花椒根际土壤中共分离获
得２０株生防芽孢杆菌（表１）。采用点菌法进行拮
抗测定发现，２０株芽孢杆菌均有一定的抑菌作用，
其中Ｂ２、Ｂ３和Ｂ２０　３株芽孢杆菌对花椒根腐病菌具
有较强的拮抗作用，抑菌圈直径均达到１０．０ｍｍ以
上。Ｂ３菌株拮抗作用最强，抑菌圈直径均达到２０．０
ｍｍ以上，其次是 Ｂ２和 Ｂ２０，抑菌圈直径均达到
１３．０ｍｍ以上，显著高于其他菌株。Ｂ１１抑菌圈直
径最小，仅为４．０ｍｍ。
采用打孔法进一步复筛，结果表明Ｂ２、Ｂ２０基
本不产生抑菌圈，而Ｂ３菌株抑菌圈直径达到２６．０
ｍｍ，说明Ｂ３对腐皮镰孢病菌具有较好的抑制作
用。Ｂ３发酵滤液经过１２１℃高温处理１５ｍｉｎ后仍
具有拮抗活性（抑菌圈直径为９．０ｍｍ），说明Ｂ３菌
株具有耐热性。
表１　生防芽孢杆菌菌株筛选结果
Ｔａｂｌｅ　１　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｐ．
分离菌株代码
Ｎｏ．ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ
菌落特征
Ｃｏｎｏｌｙ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
抑菌圈直径／ｍｍ　Ｄｉａｍｅｔｅｒ　ｏｆ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｚｏｎｅ
初筛
Ｆｉｒｓｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
复筛
Ｓｅｃｏｎｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
Ｂ１ 表面不光滑，淡黄色 Ｒｏｕｇｈ　ｓｕｒｆａｃｅ　ａｎｄ　ｆａｉｎｔ　ｙｅｌｏｗ　 ５．０±０．５ｄｅ　 ０ｃ
Ｂ２ 表面不光滑，干燥，白色 Ｒｏｕｇｈ　ｓｕｒｆａｃｅ，ｄｒｙ　ａｎｄ　ｗｈｉｔｅ　 １４．０±１．３ｂ １．０±０．３ｂ
Ｂ３ 表面不光滑，白蜡状，乳白色 Ｒｏｕｇｈ　ｓｕｒｆａｃｅ，ｗａｘ　ｓｈａｐｅ　ａｎｄ　ｃｒｅａｍ　 ２０．０±１．５ａ ２６．０±１．５ａ　
Ｂ４ 表面不光滑，干燥，白色 Ｒｏｕｇｈ　ｓｕｒｆａｃｅ，ｄｒｙ　ａｎｄ　ｗｈｉｔｅ　 ６．０±０．５ｃｄ　 ０ｃ
Ｂ５ 表面不光滑，淡黄色 Ｒｏｕｇｈ　ｓｕｒｆａｃｅ　ａｎｄ　ｆａｉｎｔ　ｙｅｌｏｗ　 ５．０±０．５ｄｅ　 ０ｃ
Ｂ６ 表面不光滑，淡黄色 Ｒｏｕｇｈ　ｓｕｒｆａｃｅ　ａｎｄ　ｆａｉｎｔ　ｙｅｌｏｗ　 ７．０±１．０ｃ ０ｃ
Ｂ７ 表面不光滑，干燥，白色 Ｒｏｕｇｈ　ｓｕｒｆａｃｅ，ｄｒｙ　ａｎｄ　ｗｈｉｔｅ　 ５．０±０．５ｄｅ　 ０ｃ
Ｂ８ 表面不光滑，淡黄色 Ｒｏｕｇｈ　ｓｕｒｆａｃｅ　ａｎｄ　ｆａｉｎｔ　ｙｅｌｏｗ　 ６．０±０．５ｃｄ　 ０ｃ
Ｂ９ 表面不光滑，干燥，白色 Ｒｏｕｇｈ　ｓｕｒｆａｃｅ，ｄｒｙ　ａｎｄ　ｗｈｉｔｅ　 ７．０±１．３ｃ ０ｃ
Ｂ１０ 表面不光滑，淡黄色 Ｒｏｕｇｈ　ｓｕｒｆａｃｅ　ａｎｄ　ｆａｉｎｔ　ｙｅｌｏｗ　 ６．０±１．０ｃｄ　 ０ｃ
Ｂ１１ 表面不光滑，干燥，白色 Ｒｏｕｇｈ　ｓｕｒｆａｃｅ，ｄｒｙ　ａｎｄ　ｗｈｉｔｅ　 ４．０±０．４ｅ ０ｃ
Ｂ１２ 表面不光滑，淡黄色 Ｒｏｕｇｈ　ｓｕｒｆａｃｅ　ａｎｄ　ｆａｉｎｔ　ｙｅｌｏｗ　 ５．０±０．４ｄｅ　 ０ｃ
Ｂ１３ 表面不光滑，干燥，白色 Ｒｏｕｇｈ　ｓｕｒｆａｃｅ，ｄｒｙ　ａｎｄ　ｗｈｉｔｅ　 ５．０±０．５ｄｅ　 ０ｃ
Ｂ１４ 表面不光滑，淡黄色 Ｒｏｕｇｈ　ｓｕｒｆａｃｅ　ａｎｄ　ｆａｉｎｔ　ｙｅｌｏｗ　 ７．０±１．５ｃ ０ｃ
Ｂ１５ 表面不光滑，干燥，白色 Ｒｏｕｇｈ　ｓｕｒｆａｃｅ，ｄｒｙ　ａｎｄ　ｗｈｉｔｅ　 ５．０±０．５ｄｅ　 ０ｃ
Ｂ１６ 表面不光滑，干燥，白色 Ｒｏｕｇｈ　ｓｕｒｆａｃｅ，ｄｒｙ　ａｎｄ　ｗｈｉｔｅ　 ５．０±０．４ｄｅ　 ０ｃ
Ｂ１７ 表面不光滑，淡黄色 Ｒｏｕｇｈ　ｓｕｒｆａｃｅ　ａｎｄ　ｆａｉｎｔ　ｙｅｌｏｗ　 ６．０±１．０ｃｄ　 ０ｃ
Ｂ１８ 表面不光滑，干燥，白色 Ｒｏｕｇｈ　ｓｕｒｆａｃｅ，ｄｒｙ　ａｎｄ　ｗｈｉｔｅ　 ５．０±１．０ｄｅ　 ０ｃ
Ｂ１９ 表面不光滑，干燥，白色 Ｒｏｕｇｈ　ｓｕｒｆａｃｅ，ｄｒｙ　ａｎｄ　ｗｈｉｔｅ　 ５．０±０．５ｄｅ　 ０ｃ
Ｂ２０ 表面不光滑，淡黄色 Ｒｏｕｇｈ　ｓｕｒｆａｃｅ　ａｎｄ　ｆａｉｎｔ　ｙｅｌｏｗ　 １３．０±１．５ｂ １．０±０．２ｂ
　　注：表中数据为“平均数±标准差”；同列数据后标不同小写字母表示在Ｐ＜０．０５水平上差异显著（ＬＳＤ法）。表３～５同。
Ｎｏｔｅ：Ｄａｔａ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔａｂｌｅ　ａｒｅ“ｍｅａｎ±ＳＤ”．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｏｗｅｒｃａｓｅ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｃｏｌｕｍｎ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ａｔ　Ｐ＜０．０５ｌｅｖｅｌ　ｂｙ
ＬＳＤ　ｔｅｓｔ．Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｆｏｒ　Ｔａｂｌｅ　３－５．
２．２　目标芽孢杆菌的鉴定
Ｂ３菌株经ＬＢ琼脂平板培养２４ｈ后，菌落扁
平，颜色为乳白色，不透明，表面略粗糙，呈白蜡状，
质地软，略有光泽，无色素，外形不规则近圆形，中部
７１１第４期 李姝江，等：花椒根腐病生防芽孢杆菌的筛选鉴定及定殖和防治效果
突起，边缘不整齐。显微镜下革兰氏染色呈阳性，菌
体呈杆状，末端钝，为短或长链，芽孢椭圆中生或近
中。Ｂ３芽孢杆菌的生理生化特征见表２。表２结果
表明，接触酶、硝酸盐还原、Ｖ－Ｐ反应、明胶液化、过
氧化氢酶试验为阳性，苯丙氨酸脱氢酶、甲基红、马
尿酸盐水解试验为阴性，可利用柠檬酸盐、葡萄糖、
蔗糖、麦芽糖，不能利用木糖、甘露醇、阿拉伯糖、乳
糖，厌氧、不能形成吲哚，５℃生长、５０℃不生长。根
据Ｂ３菌株菌落形态特征、革兰氏染色和生理生化
特征测定结果，初步确定Ｂ３菌株为蜡样芽孢杆菌
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　Ｆｒａｎｋｌａｎｄ）。
表２　Ｂ３菌株的生理生化特征
Ｔａｂｌｅ　２　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ－ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　Ｂ３
特征
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
结果
Ｒｅｓｕｌｔｓ
特征
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
结果
Ｒｅｓｕｌｔｓ
运动性 Ｍｏｔｉｌｉｔｙ ＋ 厌氧生长Ａｎａｅｒｏｂｉｃ　ｇｒｏｗｔｈ ＋
接触酶Ｇａｔａｃａｓｅ ＋ 卵磷脂酶Ｌｅｃｉｔｈａｓｅ ＋
苯丙氨酸脱氨酶Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　Ｄｅａｍｉｎａｓｅ － 甲基红 Ｍ．Ｒ． －
柠檬酸盐利用Ｃｉｔｒａｔｅ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ＋ 明胶液化Ｇｅｌａｔｉｎ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ＋
葡萄糖利用Ｇｌｕｃｏｓｅ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ＋ 过氧化氢酶Ｃａｔａｌａｓｅ ＋
木糖利用Ｘｙｌｏｓｅ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ － 蔗糖利用Ｓｕｃｒｏｓｅ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ＋
甘露醇利用 Ｍａｎｎｉｔｏｌ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ － 麦芽糖利用 Ｍａｌｔｏｓｅ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ＋
阿拉伯糖利用Ａｒａｂｉｎｏｓｅ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ － 马尿酸盐水解 Ｈｉｐｐｕｒａｔｅ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ －
乳糖利用Ｌａｃｔｏｓｅ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ － 酪素水解Ｃａｓｅｉｎ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ＋
溶菌酶生长Ｌｙｓｏｚｙｍｅ　ｇｒｏｗｔｈ ＋ 酪氨酸水解Ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ＋
硝酸盐还原Ｎｉｔｒａｔｅ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ ＋ 淀粉水解Ｓｔａｒｃｈ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ＋
Ｖ－Ｐ反应 Ｖ－Ｐ　ｒｅａｃｔｉｏｎ ＋ 形成吲哚Ｂｅｎｚｐｙｒｏｌｅ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｓｅ －
Ｖ－Ｐ反应下ｐＨ　ｐＨ　ｉｎ　Ｖ－Ｐ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　 ５．１　 ７％ ＮａＣｌ生长Ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　７％ ＮａＣｌ ＋
ｐＨ　５．７生长 Ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　ｐＨ　５．７ ＋ ｐＨ　６．８生长 Ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　ｐＨ　６．８ ＋
５℃生长 Ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　５℃ ＋ ５０℃生长 Ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　５０℃ －
　　注：“＋”阳性；“－”阴性。
Ｎｏｔｅ：“＋”ｍｅａｎｓ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ；“－”ｍｅａｎｓ　ｎｅｇａｔｉｖｅ．
２．３　目标芽孢杆菌的盆栽生防效果
由表３可以看出，接种Ｂ３发酵液３０ｄ后，对花
椒根腐病具有不同的防治效果，发病率和病情指数随
稀释倍数的增加而增大，防治效果随稀释倍数的增加
而降低。其中，无菌水和无菌培养液的对照花椒苗发
病率高达９４％以上，Ｂ３发酵原液至稀释２００倍以下
效果显著，特别是稀释５０倍以下，可基本上控制病害
不发生，而稀释５００倍以上防治效果低于５０％。
表３　Ｂ３菌株对花椒根腐病的盆栽防治效果
Ｔａｂｌｅ　３　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　Ｂ３ｏｎ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｏｌａｎｉ　ｉｎ　ｐｏｔ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
稀释倍数（体积比）
Ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ（ｖｏｌｕｍｅ　ｒａｔｉｏ）
发病率／％
Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ
病情指数
Ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎｄｅｘ
防治效果／％
Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｅｆｆｅｃｔ
原液Ｏｒｉｇｉｎａｌ　ｌｉｑｕｉｄ　 １．２２±０．２５ａ １．０５±０．５０ａ ９７．５６±１．８７ａ
５０　 ４．２２±０．４０ｂ ２．８７±０．７５ｂ ９１．１７±１．５６ｂ
Ｂ３ １００　 ８．３７±０．５１ｃ ４．４９±０．７０ｃ ８９．２２±１．３３ｃ
２００　 １４．１５±１．１２ｄ ９．６９±１．２０ｄ ８１．２５±１．５９ｄ
５００　 ３８．８０±１．０５ｅ ３０．１５±１．２５ｅ ４９．６６±１．２５ｅ
１　０００　 ５１．２３±１．３４ｆ ４７．７０±１．１４ｆ ２５．５７±１．２０ｆ
无菌水Ｓｔｅｒｉｌｅ　ｗａｔｅｒ －　 ９４．５５±０．８０ｇ　 ７７．９８±１．０５ｇ　 －
无菌培养液Ｓｔｅｒｉｌｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｌｉｑｕｉｄ －　 ９５．４１±０．９５ｇ　 ７９．３５±１．０８ｇ －
２．４　抗链霉素突变菌株的拮抗性和稳定性
逐步增加链霉素质量浓度获得抗３００μｇ／ｍＬ
的突变菌株Ｂ３，将原始菌株和突变菌株分别与腐皮
镰刀菌对峙培养５ｄ后，测量拮抗带的宽度和病原
菌直径，结果显示，突变菌株拮抗带宽度为１．５７
ｃｍ，抑制率为７７．２０％；原始菌株拮抗带宽度为１．５９
ｃｍ，抑制率为７７．８７％，二者无显著差异，说明突变
菌株对病原菌仍有较强的抑制作用。
测定结果显示，继代培养后突变菌株在含３００
μｇ／ｍＬ的ＬＢ平板上生长后形态和生长速度与原始
菌株相似。选取１００个菌落点接种后，突变菌株丢
失率为０，说明所获得的突变菌株Ｂ３具有很好的抗
药稳定性。
２．５　突变菌株在花椒根际及根内的定殖和消长
动态
花椒根际和根内分离的突变菌株数量结果（图
８１１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４４卷
１）表明，根际和根内的定殖量和消长规律有显著差
异，无论在有或没有腐皮镰刀菌存在的情况下，突变
菌株Ｂ３均能在根际和花椒根内定殖。对比根际和
根内的定殖量可知，根际土中菌量比根内更早达到
峰值，下降维持稳定的菌量要远大于根内部，说明突
变菌株Ｂ３更易于在花椒根际土中定殖生长。同
时，１～８０ｄ内无菌水处理的花椒根际和根内菌量都
要显著高于病原菌处理。
图１Ａ显示，在接种后１～８０ｄ内病原菌处理与
无菌水对照在根际的定殖动态变化规律相似，１～５
ｄ内下降，５～１０ｄ上升，１０ｄ时达到最大值，之后下
降，４０～８０ｄ内维持稳定状态。其中，１０ｄ时无菌
水处理的菌量为６．７０×１０６　ＣＦＵ／ｇ，显著高于病原
菌处理的菌量（３．３２×１０６　ＣＦＵ／ｇ），二者到８０ｄ时
仍有９．７５×１０３　ＣＦＵ／ｇ和４．５７×１０３　ＣＦＵ／ｇ的菌
量。
图１Ｂ显示，接种后１～２０ｄ内无菌水和病原菌
处理花椒根内的菌量呈缓慢上升趋势，２０ｄ时均达
到最大值，分别为４．４７×１０５　ＣＦＵ／ｇ和１．３５×１０５
ＣＦＵ／ｇ，之后下降，４０～８０ｄ保持稳定，且差异不显
著，８０ｄ时根内仍然能检测到突变菌株Ｂ３，菌量分
别为１．６１×１０３　ＣＦＵ／ｇ和０．８０×１０３　ＣＦＵ／ｇ。
图１　突变菌株Ｂ３在花椒根际（Ａ）和根内（Ｂ）的定殖动态
不同大写字母表示同一处理不同时间点在Ｐ＜０．０５水平上差异显著（ＬＳＤ法）；
不同小写字母表示同一时间点不同处理在Ｐ＜０．０５水平上差异显著（ＬＳＤ法）
Ｆｉｇ．１　Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｄｙｎａｍｉｃｓ　ｏｆ　ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ　ｓｔｒａｉｎ　Ｂ３ｉｎ　ｒｈｉｚｏｐｈｅｒｅ（Ａ）ａｎｄ　ｒｏｏｔ　ｉｎｔｅｒｉｏｒ（Ｂ）ｏｆ　Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ　ｂｕｎｇｅａｎｕｍ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃａｐｉｔａｌ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ａｔ　Ｐ＜０．０５ｌｅｖｅｌ　ｂｙ　ＬＳＤ　ｔｅｓｔ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｍｅ　ｐｏｉｎｔｓ　ｏｆ　ｏｎｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ；
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｏｗｅｒｃａｓｅ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ａｔ　Ｐ＜０．０５ｌｅｖｅｌ　ｂｙ　ＬＳＤ　ｔｅｓｔ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ　ａｔ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｔｉｍｅ　ｐｏｉｎｔ
２．６　生防芽孢杆菌Ｂ３的田间防治效果
原始菌株和突变菌株Ｂ３对花椒根腐病的田间
预防效果见表４。
表４　原始菌株和突变菌株Ｂ３对花椒根腐病的田间预防效果
Ｔａｂｌｅ　４　Ｐｒｅｖｅｎｔ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｏｒｉｇｉｎａｌ　ａｎｄ　ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ　Ｂ３ｏｎ　Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ　ｂｕｎｇｅａｎｕｍｉｎ　ｆｉｅｌｄ
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
稀释倍数（体积比）
Ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ（ｖｏｌｕｍｅ　ｒａｔｉｏ）
发病率／％
Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ
病情指数
Ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎｄｅｘ
预防效果／％
Ｐｒｅｖｅｎｔ　ｅｆｆｅｃｔ
原液 Ｏｒｉｇｉｎａｌ　ｌｉｑｕｉｄ　 ０ａ ０ａ １００ａ
５０　 ０ａ ０ａ １００ａ
原始菌株Ｏｒｉｇｉｎａｌ　ｓｔｒａｉｎ
１００　 ０ａ ０ａ １００ａ
２００　 ０ａ ０ａ １００ａ
５００　 ６．１５±０．８７ｃ ４．４６±０．５８ｃ ７９．２６±２．５０ｃ
１　０００　 １８．２６±０．７５ｄ １０．９９±０．６９ｄ ５２．３４±２．３５ｄ
原液 Ｏｒｉｇｉｎａｌ　ｌｉｑｕｉｄ　 ０ａ ０ａ １００ａ
５０　 ０ａ ０ａ １００ａ
突变菌株 Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ　ｓｔｒａｉｎ
１００　 ０ａ ０ａ １００ａ
２００　 ０ａ ０ａ １００ａ
５００　 ４．００±０．８０ｂ ２．９６±０．４０ｂ ８９．６５±２．２７ｂ
１　０００　 ５．５２±０．６６ｃ ４．０１±０．５５ｃ ８１．７７±２．６０ｃ
双效灵Ｃ．Ｃ．Ｍ．Ａ． １　０００　 ６．３７±０．５３ｃ ４．６８±０．４３ｃ ７８．２６±２．９２ｃ
无菌水Ｓｔｅｒｉｌｅ　ｗａｔｅｒ － ３０．５０±１．００ｅ ２２．５５±０．９８ｅ －
无菌培养液Ｓｔｅｒｉｌｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｌｉｑｕｉｄ － ３１．４８±１．２０ｅ ２３．４４±１．１０ｅ －
　　由表４可以看出，Ｂ３原始菌株和突变菌株菌剂 原液、５０～１　０００倍稀释液沿根系幅面灌根，对花椒
９１１第４期 李姝江，等：花椒根腐病生防芽孢杆菌的筛选鉴定及定殖和防治效果
根腐病都有一定的预防效果，随稀释倍数的增大发
病率和病情指数升高，而预防效果变差。无菌水和
无菌培养液对根腐病无预防作用，发病率均超过
３０％。突变菌株原液稀释５００倍以下的预防效果显
著优于双效灵１　０００倍液，而突变菌株１　０００倍液与
双效灵１　０００倍液相当。相比而言，原始菌株菌剂
稀释２００倍以下的预防效果与突变菌株相同，但
５００倍和１　０００倍稀释液发病率显著高于突变菌株，
相应预防效果也较差；１　０００倍稀释液的预防效果仅
为５２．３４％，而突变菌株菌剂均超过８０％。
由表５可以看出，Ｂ３原始菌株和突变菌株菌剂
原液、５０～１　０００倍稀释液沿根系幅面灌根，对花椒
根腐病都有一定的治疗作用，随稀释倍数的增大发
病率和病情指数升高，而治疗效果变差。突变菌株
菌剂稀释２００倍以下的治疗效果显著优于双效灵
１　０００倍液，５００倍稀释液与双效灵１　０００倍液差异
不显著，但均超过５０％。而原始菌株菌剂稀释２００
倍以下治疗效果才高于５０％，５００倍和１　０００倍稀
释液的疗效显著低于突变菌株和双效灵１　０００倍
液。以上结果说明，在自然条件下，菌株Ｂ３对花椒
根腐病既能治疗又能预防；无论在未发病还是已发
病的花椒林地，突变菌株的防治效果均比原始菌株
更好，更能适应环境并定殖及繁殖。
表５　原始菌株和突变菌株Ｂ３对花椒根腐病的田间治疗效果
Ｔａｂｌｅ　５　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｏｒｉｇｉｎａｌ　ａｎｄ　ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ　Ｂ３ｏｎ　Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ　ｂｕｎｇｅａｎｕｍｉｎ　ｆｉｅｌｄ
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
稀释倍数（体积比）
Ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ（ｖｏｌｕｍｅ　ｒａｔｉｏ）
发病率／％
Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ
病情指数
Ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎｄｅｘ
治疗效果／％
Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｅｆｆｅｃｔ
原液 Ｏｒｉｇｉｎａｌ　ｌｉｑｕｉｄ　 ９．２５±２．１５ａ ５．６９±１．３８ａ ８８．２０±２．３０ａ
５０　 １４．１０±２．４７ａｂ　 ７．８３±１．５２ａ ８４．２６±１．７９ａ
原始菌株Ｏｒｉｇｉｎａｌ　ｓｔｒａｉｎ
１００　 ２７．５０±２．５６ｃ １９．５５±１．５０ｃ ５９．３０±２．０４ｃ
２００　 ３６．４４±２．５５ｄ ２８．２１±１．７７ｄ ５２．６６±１．９８ｄ
５００　 ５４．２７±３．０３ｅ ３４．３５±２．１９ｅ ４４．１７±１．５５ｅ
１　０００　 ７５．３９±３．１２ｆ ５２．３０±２．１０ｆ ２２．９３±２．０３ｆ
原液 Ｏｒｉｇｉｎａｌ　ｌｉｑｕｉｄ　 ８．１７±２．５６ａ ４．９２±１．１７ａ ８９．３５±２．２５ａ
５０　 １２．４３±２．６６ａ ７．０６±１．８２ａ ８５．６１±２．１８ａ
突变菌株 Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ　ｓｔｒａｉｎ
１００　 １８．９９±２．９１ｂ １１．８８±１．７６ｂ ７６．５５±１．９６ｂ
２００　 ２８．６２±２．１８ｃ １９．０９±１．３３ｃ ６０．７３±１．９０ｃ
５００　 ３６．０５±３．１０ｄ ２６．１２±２．１０ｄ ５２．８８±１．７４ｄ
１　０００　 ５７．７８±３．０８ｅ ３４．５６±２．１２ｅ ４１．５６±１．５４ｅ
双效灵Ｃ．Ｃ．Ｍ．Ａ． １　０００　 ３８．１４±２．９８ｄ ２５．２６±１．９９ｄ ５０．７２±１．５０ｄ
无菌水Ｓｔｅｒｉｌｅ　ｗａｔｅｒ － １００ｇ　 １００ｇ －
无菌培养液Ｓｔｅｒｉｌｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｌｉｑｕｉｄ － １００ｇ　 １００ｇ －
３　讨　论
众多研究表明，细菌有着其他微生物所不具备
的优点，如种类和数量庞大，繁殖快速，作用方式多
样等，因此在植物病害生物防治中有着非常重要的
地位。目前，已发现有１８个属的细菌在植物病害生
物防治上具有应用潜力［２４］，特别是芽孢杆菌属
（Ｂｕｃｉｌｌｕｓ）的细菌，由于其抗逆性强、商贮性好，更
是受到生防工作者的重视。其中，蜡样芽孢杆菌
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）是土壤中的优势菌，不仅能防治植
物病害，而且还能促进植物生长，属于目前研究比较
多的植物根际促生菌［２５］。本研究所分离的蜡样芽
孢杆菌对花椒根腐病菌拮抗作用强，能抗高温，易繁
殖，是一种极具开发价值的生防菌。但刘国红等［２６］
指出，芽孢杆菌属细菌的表型特征范围较广泛，较难
准确对其进行属种确定，因而结合张艳东等［２７］的报
道，还应对所得Ｂ３菌株进行１６ＳｒＤＮＡ鉴定进而印
证本研究的菌株分类鉴定结果。
植物根标存在大量的有益微生物，现已从多种
植物根际分离到对病害具有良好抑制效果的微生
物［２８－２９］。但是，生防菌在植物根际或根部有效定殖
是防治根部病害成功与否的关键［１７］。将 ＤＮＡ 和
ＲＮＡ探针［３０］、基因标记［３１］、荧光显微镜［３２］等方法
应用于生防微生物在植物根部定殖均已见报道；利
用抗生素标记具有经济、简便、快速等优点。周林
等［２３］以链霉素标记枯草芽孢杆菌，检测其在香蕉体
内及根际的定殖动态，获得理想效果。本试验使用
链霉素标记也成功获得蜡样芽孢杆菌 Ｂ３抗３００
μｇ／ｍＬ链霉素的突变菌株，经与原始菌株比较拮抗
活性、稳定性发现，其性状稳定，拮抗活性较优。在
定殖和消长动态测定中，Ｂ３突变菌株在根际土中定
殖量大于根内，且达到峰值的时间早于根内。这与
刘庆丰等［３３］关于枯草芽孢杆菌在大白菜根围的定
殖结果相似，生防菌从根际土拓展到根系内部是一
０２１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４４卷
个渐进的过程，在此过程中可能受到诸多因素影响，
如植物与土壤的相互作用、土壤温度、湿度、植物气
孔开放程度等。此外，本研究结果仅是利用灌根法
接种Ｂ３突变菌株，结合孙建波等［２２］、周林等［２３］的
报道，说明该菌株可主动穿过根皮层进入花椒体内，
显示出较强的定殖能力。再者，无论环境中有无病
原菌存在，该突变菌株均能很好地定殖于花椒的根
系和根际土中，有利于其在根部占据有利生态位点，
这为抑制花椒根腐病菌奠定了良好的基础。因此，
将定殖能力与拮抗活性相结合，可作为优良高效持
久的生防菌筛选的重要指标。
蜡样芽孢杆菌应用于植物病害生物防治时都要
经过发酵使细胞富集，进而可以直接制成活菌制剂，
但是在实际应用过程中，菌株效能不稳定是制约其
开发的重要条件之一。本研究利用突变菌株进行田
间防治试验，取得了优于原始菌株及化学农药（双效
灵）的预防和治疗效果，结合定殖结果来看，突变菌
株Ｂ３可能更适应自然环境，能更好地定殖、排挤病
原物，其防效更持久、稳定，具有良好的应用前景，可
成为防治花椒根腐病的一种新途径。
［参考文献］
［１］　李智敏，陈建斌，周惠萍，等．花椒根腐病病原鉴定和生物学特
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２２１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４４卷