全 文 ：江西农业学报 2011，23( 3) : 14 ～ 16
Acta Agriculturae Jiangxi
芦笋游离小孢子培养研究初报
汤泳萍1，2，周劲松2，罗绍春2，盛文涛1，谢启鑫2，朱友林1，陈光宇2*
收稿日期:2011 －01 －11
基金项目:公益性行业( 农业) 科研专项“芦笋产业技术研究与试验示范”( 201003074) ;江西省农科院青年创新基金“芦笋小孢子培养技术
研究”。
作者简介:汤泳萍( 1975─) ，女，副研究员，硕士研究生，研究方向:作物遗传育种。* 通讯作者:陈光宇。
( 1．南昌大学 生命科学与食品工程学院，江西 南昌 330031; 2．江西省农业科学院 生物工程中心，江西 南昌 330200)
摘 要:以 5个芦笋品种不同发育时期的花药为试验材料，进行芦笋游离小孢子培养，探索高频率获得雄核发育个体的
技术途径，为芦笋全雄育种和杂种优势利用服务。初步试验结果表明: 单核靠边期是小孢子适宜培养的最佳时期; 不同的基
因型之间小孢子愈伤组织诱导率差异显著;对花药小孢子进行变温预处理，其膨大率比对照高出 6 倍多，最高达到 22． 5% ;小
孢子培养的适宜培养基为 MS加 0． 5 mg /L 6 － BA、1． 0 mg /L NAA 、0． 2 mg /L 2，4 － D、400 mg /L Glu和 6%的蔗糖。
关键词:芦笋;小孢子培养;愈伤组织;胚状体
中图分类号: S644． 6 文献标识码: A 文章编号: 1001 －8581( 2011) 03 －0014 －03
A Preliminary Study on Isolated Microspore Culture of Asparagus officinalis
TANG Yong － ping1，2，ZHOU Jin － song2，LUO Shao － chun2，SHENG Wen － tao1，
XIE Qi － xin2，ZHU You － lin1，CHEN Guang － yu2*
( 1． School of Life Sciences and Food Engineering，Nanchang University，Nanchang 330031，China;
2． Biotechnology Center，Jiangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanchang 330200，China)
Abstract: In this paper，the isolated microspore culture is studied with five cultivars or hybrid combinations of Asparagus officina-
lis． The results show that the optimal time for the inducement of callus is near the monokaryotic stage; there is significant difference in
the inducement rate of callus among different genotypes; the frequency of the inflated microspore treated by different temperatures is 6
times higher than that of the control，and the highest frequency reaches 22． 5% ; the suitable medium for the isolated microspore cul-
ture is MS + 0． 5 mg /L 6 － BA + 1． 0 mg /L NAA + 0． 2 mg /L 2，4 － D + 400 mg /L Glu + 6% sucrose．
Key words: Asparagus officinalis; Isolated microspore culture; Callus; Embryoid
芦笋( Asparagus officinalis L． ) 是一种深受消费者喜
爱的营养保健型高档蔬菜，具有很高的经济附加值。它
雌雄异株，雄性 Mm，雌性 mm。雄株因不结种子而消耗
养分少，产量比同条件的雌株高出 25%以上，因此开展
芦笋全雄育种是提高芦笋产量最有效的途径之一。由于
芦笋超雄株( MM) 与雌株的杂交后代全部为雄株( Mm)
( mm × MM→Mm) ，超雄株的获取是芦笋全雄育种的
关键［1 ～3］。
高效的芦笋小孢子培养技术体系，能够高频率诱导
发育相对一致的雄核个体，有效解决花药培养过程中的
体细胞干扰问题［4，5］，获得大量的 DH 单株( 包括超雄
株) ，可加速芦笋全雄育种和杂种优势利用，并为芦笋分
子生物学研究提供优良的实验系统。目前，国内外芦笋
小孢子培养成功的报道比较少，仅闫凤英、Zhang与 Peng
等［6 ～8］采用自然散落法进行小孢子培养，经愈伤组织途
径获得再生植株，但他们所用的材料都是目前生产上已
淘汰的传统品种，其雄核发育诱导频率低，愈伤途径而非
胚状体途径诱导成苗相对困难且易畸变，试验设计处理
因素较少。为此，本研究将设置不同的基因型供试材料、
取蕾时期、花药预处理方式、激素种类和水平等处理因素
进行芦笋小孢子培养技术探索，为建立高频率的诱导体
系和愈伤组织以及胚状体成苗奠定基础。
1 材料和方法
1． 1 试验材料 供试材料为芦笋杂交 F1 代栽培品种，
分别是: B4 ( PURPLEPASSION ) 、B15 ( NEW JERSEY
1019) 、B22 ( GIJNLIM F1 ) 、B23 ( THIELIM F1 ) 和 B25
( BACKLIM F1 ) 。种苗于 2004年春季定植于江西省农科
院生物工程中心芦笋资源圃温室大棚内，常规管理。
2009年 4月至 2010年 5月采集雄株花蕾进行试验。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 材料处理 从供试植株上选取小孢子发育处于
单核中晚期至双核早期的花蕾，进行镜检后挑选小孢子
发育处于单核靠边期比率高的花蕾，同时测量花蕾长度
并记录花蕾外观、花药颜色及花丝长度等，待用。用 5%
次氯酸钠溶液消毒花蕾 15 min后，用去离子无菌水冲洗
3 ～4次，每次 3 min。在无菌条件下，剥取花药接种在未
添加激素的 MS预培养基上，置于黑暗条件、不同温度( 4
℃、32 ℃、先 4 ℃后 32 ℃ ) 下预培养一定时间( 2、4、6、8
d) ，其余试验均选用变温预处理 6 d。每处理 3 次重复，
每重复 10个培养皿。以常温( 25 ℃ ) 为对照，进行显微
观察，并记录 10个视野的小孢子膨大率。
1． 2． 2 诱导培养基和诱导试验 将变温预处理的花药
进行小孢子游离，游离的小孢子经血球计数板计数后，调
整密度至 1． 5 ×105 个 /mL，以 MS培养基为基本培养基，
进行诱导培养。培养基通过0． 22 μm孔径的微孔滤膜过
滤灭菌。MS培养基中分别附加不同种类的激素，处理
1: 0． 2 mg /L 6 － BA + 1． 0 mg /L NAA + 0． 5 mg /L 2，4 －
D;处理 2: 0． 5 mg /L 6 － BA +1． 0 mg /L NAA +0． 2 mg /L
2，4 － D;处理 3: 1． 0 mg /L 6 － BA +0． 5 mg /L NAA +0． 1
mg /L 2，4 － D;每处理设 10次重复，每重复 10个培养皿。
培养放置于 27 ℃、黑暗的人工培养箱内诱导愈伤组织和
胚状体，分别于 10、15、20、25 和 30 d 后调查愈伤组织和
胚状体的诱导情况。
1． 2． 3 统计方法和数据分析 小孢子膨大率 =预处理
后孢子直径 /预处理前孢子直径 × 100% ;愈伤组织诱导
率 =产生愈伤组织数( 个) /培养花药数( 个) ×100% ;试
验数据采用 DPS、Excel进行统计分析［9］。
2 结果与分析
2． 1 花蕾外部形态与小孢子发育时间的关系 以花蕾
长度、外观以及花药特征作为判断小孢子发育时期的基
本指标。由表 1可见，当花蕾的长度在 2． 0 ～ 2． 4 mm之
间、花药颜色为黄或黄绿时，大部分小孢子处于单核靠边
期，但不同品种不同单株间存在一定的差异。
表 1 花蕾外部形态与小孢子发育时间的关系
材料 花蕾长度 花药颜色 小孢子发育阶段 是否适于培养
B15 大于 2． 1 mm 黄，花丝长 82． 5%为成熟花粉 否
2． 0 ～2． 1 mm 黄或黄绿 79． 0%为小孢子单核期 是
小于 2． 0 mm 嫩绿 66． 7%为小孢子母细胞 否
B22 大于 2． 15 mm 黄，花丝长 78． 5%为成熟花粉 否
2． 0 ～2． 15 mm 黄或黄绿 76． 0%为小孢子单核期 是
小于 2． 0 mm 嫩绿 65． 0%为小孢子母细胞 否
B23 大于 2． 2 mm 黄，花丝长 80． 0%为成熟花粉 否
2． 0 ～2． 2 mm 黄或黄绿 72． 5%为小孢子单核期 是
小于 2． 0 mm 嫩绿 62． 5%为小孢子母细胞 否
B25 大于 2． 2 mm 黄，花丝长 65． 5%为成熟花粉 否
2． 0 ～2． 2 mm 黄或黄绿 68． 5%为小孢子单核期 是
小于 2． 0 mm 嫩绿 54． 5%为小孢子母细胞 否
B4 大于 2． 4 mm 黄，花丝长 60． 7%为成熟花粉 否
2． 2 ～2． 4 mm 黄或黄绿 69． 0%为小孢子单核期 是
小于 2． 2 mm 嫩绿 50． 7%为小孢子母细胞 否
2． 2 花药预处理对小孢子膨大率的影响 以品种 B23
为试材，花药经预处理( 低温、高温或变温预处理) 后，镜
检观察到小孢子出现明显的膨大现象，变温处理 6 d后，
发现少量膨大的小孢子开始出现分裂( 图 1) 。
A:预处理后部分小孢子开始膨大; B、C:膨大的小孢子开始分裂
图 1 花药预处理后，小孢子的形态特征
试验结果表明，在 4 ℃温度处理过程中，培养 2 d
后，小孢子膨大率呈逐渐降低趋势，且均低于对照;而在
32 ℃高温处理 2 d 后，小孢子膨大率已明显高于对照 1
倍以上，2 ～6 d时随着处理时间的增加，呈上升趋势，处
理 6 d的膨大率达到 15． 4%，处理 6 d后开始下降，小孢
子大量死亡;变温处理 2 d 的小孢子膨大率明显高于对
照，处理 4 d 的膨大率达到 16． 1%，处理 6 d 后达到
22． 5%，上升幅度明显高于 32 ℃处理，而处理 8 d 时的
膨大率降低幅度相对于 32 ℃处理较平缓( 图 2) 。结果
显示，变温处理有利于小孢子膨大。在其他几个品种上
也有类似的反应。
2． 3 不同基因型对愈伤组织诱导的影响 选用的 5 个
材料均获得了愈伤组织，但愈伤组织形成的时期和数量存
在较明显差异(表 2)。其中以 B23和 B25 的诱导效果最
好，平均每蕾形成愈伤组织数达 0． 46和 0． 39个，所需时间
最短，15 d左右即可形成肉眼可见的愈伤组织( 图 3) ; B4
和 B22诱导效果最差，形成愈伤组织数明显低于其他品
种，而 B15形成愈伤时间长达 50 d。上述结果表明，基因
型也是影响芦笋小孢子愈伤组织诱导效果的重要因素。
表 2 基因型对愈伤组织诱导率的影响
材料 接种花蕾数( 个)
愈伤组织诱导率
( % )
从开始培养到形成
愈伤组织的时间( d)
B15 100 26 50
B22 120 15 35
B23 100 46 39
B25 100 39 33
B4 95 12 36
513 期 汤泳萍等:芦笋游离小孢子培养研究初报
图 2 温度预处理对 B23小孢子膨大率的影响
2． 4 激素浓度对愈伤组织诱导的影响 选取上述 5 个
品种的适期花蕾，在对花蕾进行 6 d变温预处理后，选用
MS培养基作为基本培养基，附加不同浓度激素，研究激
素浓度对愈伤组织诱导的影响。试验结果( 表 3) 表明，
最适宜的激素浓度组合为 6 － BA 0． 5 mg /L + NAA 1． 0
mg /L +2，4 － D 0． 2 mg /L，其中 4 个供试材料的愈伤组
织诱导率显著高于其他处理，B23 的愈伤组织诱导率达
到 1． 25%。
3 结论与讨论
不同基因型的差异是花药和小孢子培养中存在的
普遍问题，基因型决定了愈伤组织的诱导率。本试验所
用的 5个供试品种在愈伤组织诱导上表现出较大差异，
表明在芦笋小孢子培养中，基因型同样影响芦笋愈伤组
织诱导率的高低。其中 B23 出现较高的小孢子愈伤组
织诱导率，能够作为小孢子培养较理想的材料。
A:液体诱导培养基上的愈伤组织; B:转接至半固体培养基上的愈伤组织
图 3 小孢子诱导出的愈伤组织
表 3 激素浓度对愈伤组织诱导率的影响 %
处理
各品种的愈伤组织诱导率
B15 B22 B23 B25 B4
处理 1 0． 68 bB 0． 23 bB 1． 05 bB 0． 24 bAB 0． 08 bB
处理 2 1． 12 aA 1． 16 aA 1． 25 aA 0． 50 aA 0． 26 aA
处理 3 0． 32 cC 0． 34 bB 0． 73 cC 0． 05 bB 0． 04 cB
注:同列不同小写字母表示 0． 05 显著水平，大写字母表示 0． 01显
著水平。
研究表明，适当的预处理可以促使小孢子脱分化启
动。Peng M S等［8］研究发现热激处理对芦笋游离小孢
子培养是必须的。肖昌华等［10］进行芦笋花药培养时发
现，低温预处理对提高芦笋小孢子诱导率作用明显。而
本试验结果表明，采用先 4 ℃后 32 ℃的花药预处理方
式，可以较长时间促进小孢子的生长膨大，从而提高愈伤
组织的诱导率。可见，芦笋小孢子培养过程中，虽然高温
处理对小孢子脱离正常的分裂途径并启动雄核发育机制
有着重要作用［11］，但低温和高温结合处理更能促进小孢
子的雄核发育机制［12，13］，本试验也得到了类似的结果。
在芦笋花药培养过程中，6 － BA、NAA、2，4 － D和 IBA等
激素以适宜浓度混合，其效果比单一激素作用好［2，3］。
本试验对不同浓度激素在芦笋愈伤组织诱导中的作用进
行了探讨，得出适宜的小孢子诱导培养基为改良 MS 培
养基加 0． 5 mg /L 6 － BA、1． 0 mg /L NAA、0． 2 mg /L 2，4
－ D、400 mg /L Glu和 6%的蔗糖。
芦笋小孢子愈伤组织的诱导受到诸多因素的综合
影响，从而导致诱导率不稳定，愈伤植株再生比较困难，
小孢子直接诱导胚状体也比较困难。如何进一步提高芦
笋愈伤组织诱导率，并尽快获得再生植株，以及直接诱导
胚状体成苗，还在进一步研究之中。
参考文献:
［1］陈光宇． 芦笋无公害生产技术［M］． 北京: 中国农业出版
社，2005．
［2］彭新红，周劲松，汤泳萍，等．芦笋花药培养胚状体诱导条件优
化的初探［J］．江西农业大学学报，2006，28( 1) : 39 ～40．
［3］张磊．石刁柏花药培养的研究及其进展［J］．天津农学院学报，
1995，2( 3) : 39 ～43．
［4］朱至清．植物细胞工程［M］．北京:化学工业出版社，2003．
［5］袁亦楠，朱德蔚，连勇，等．番茄游离小孢子培养形成胚状体的
初步研究［J］．农业生物技术学报，1999，7( 1) : 85 ～88．
［6］闫凤英，刘贵仁，严仁玲．石刁柏花粉离体培养及再生植株的
研究［J］．西北植物学报，1993，13( 4) : 265 ～269．
［7］Zhang C J，Wang H L，Ma Y，et a1． Regeneration of haploid plants
from isolated microspores of asparagus( Asparagus officinalis L． )
［J］． Plant Cell Reports，1994，13: 637 ～640．
( 下转第 19页)
61 江 西 农 业 学 报 23 卷
导率存在一定的差异，NAA浓度为 0． 1 mg /L 时，BA 浓
度 2 ～12 mg /L时，顶芽丛生芽诱导率随 BA浓度增大而
升高。灰楸顶芽丛生诱导率最高达到 68． 3%。但当
NAA浓度 0． 3 ～0． 5 mg /L时，灰楸顶芽丛生诱导率则是
随 BA浓度增大先升高再降低。多重比较表明，组合 MS
+ NAA 0． 1 mg /L +12 mg /L BA、NAA 0． 3 mg /L +6 mg /L
BA中的顶芽丛生诱导率与其它浓度组合相比差异显著。
表 2 不同激素浓度对灰楸顶芽丛生诱导率及芽长的影响
浓度
NAA + BA( mg /L)
丛生芽诱导率
( % )
平均芽长
( cm)
0． 1 +2 38． 3 d 1． 1 e
0． 1 +6 55． 0 b 1． 6 d
0． 1 +12 68． 3 a 3． 3 a
0． 3 +2 28． 3 e 0． 6 g
0． 3 +6 63． 3 a 2． 1 b
0． 3 +12 48． 3 c 1． 9 c
0． 5 +2 31． 7 e 0． 8 f
0． 5 +6 45． 0 c 0． 9 f
0． 5 +12 15． 0 f 0． 8 f
2． 3 灰楸根诱导 由表 3 可以看出，灰楸在生长素为
0． 1 ～0． 5 mg /L的 1 /2 MS生根培养基上均诱导出根，且
生根率均达100%，当生长素为0． 7 mg /L根诱导率下降。
根据诱导出根的时间差异，以及生长素含量不同和根的
条数和粗壮程度不同，选择 1 /2 MS + NAA 0． 5 mg /L 作
为灰楸幼芽生根最适培养基。
表 3 灰楸根的诱导
NAA浓度
( mg /L)
生根百分率
( % )
平均根数
( 条)
平均根长
( cm)
0 100 4 4
0． 1 100 4 3． 5
0． 3 100 5 3． 2
0． 5 100 10 4
0． 7 90 3 3
3 小结
以灰楸茎段和顶芽为试验材料，对灰楸的体外植株
再生条件进行了研究。灰楸茎段愈伤组织和芽诱导最适
培养基为 0． 3 mg /L IBA + 5 mg /L BA，顶芽丛生诱导最
适培养基为 MS + 0． 1 mg /L NAA + 12 mg /L BA，根诱导
最适培养基为 1 /2MS +0． 5 mg /L NAA。
参考文献:
［1］潘庆凯，康平生，郭明． 灰楸［M］． 北京: 中国林业出版社，
1991: 151 ～152．
［2］范国强，翟晓巧，毕会涛，等．金丝楸的离体培养和植株再［J］．
植物生理学通讯，2002，38( 4) : 359．
［3］傅玉兰，费鹏飞，刘小云．灰楸组培初代培养技术［J］．林业科
技开发，2009，23( 4) : 88 ～91．
［4］乔勇进，夏阳，梁慧敏，等．试论灰楸的生物生态学特性及发展
前景［J］．防护林科技，2003，57( 4) : 23 ～24．
［5］吴春林，郝明灼，彭方仁，等．不同品种灰楸幼树生长及生理特
性比较［J］．南京林业大学学报( 自然科学版) ，2008，32 ( 6) :
123 ～127．
［6］王良桂，张春霞，彭方仁，等．干旱胁迫对几种灰楸苗木叶片荧
光特性的影响［J］．南京林业大学学报( 自然科学版) ，2008，32
( 6) : 119 ～122．
［7］王华荣，王海亭，张国立，等．灰楸不同嫁接方法对苗木成活率
和生长量的影响［J］．安徽农业科学，2007，35( 30) : 9505．
［8］王苏珂，王军辉，张守攻，等．灰楸不同交配组合种子发芽特性
的研究［J］．林业科学研究，2008，21 ( 2) : 275 ～278．
［9］杨玉珍，王顺财，彭方仁．我国灰楸研究现状及开发利用策略
［J］．林业科技开发，2006，20( 3) : 4 ～7．
［10］周蓉，谢焕松，刘鑫燕，等．楸树组培与快繁技术初探［J］．安
徽农业科学，2009，37( 32) : 15715 ～15716，15794．
［11］翟晓巧，范国强，贺窑青，等．金丝楸茎段的组织培养及植株
再生技术研究［J］． 河南农业大学学报，2002，36 ( 4 ) : 319
～326．
［12］费鹏飞．灰楸组织培养体系的研究［D］． 合肥: 安徽农业大
学，2007．
［13］杨燕．灰楸组织培养研究［D］．南京:南京林业大学，
櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗
2008．
(上接第 16页)
［8］Peng M S，Wolyn D J． Improved callus formation and plant regen-
eration for shed － microspore culture in asparagus ( Asparagus of-
ficinalis L．) ［J］． Plant Cell Reports，1999，18: 954 ～958．
［9］唐启义，冯明光．实用统计分析及其数据处理系统［M］．北京:
科学出版社，2002．
［10］肖昌华，李治平．石刁柏花药预冷冻对诱导频率的影响［J］．
长江蔬菜，1994( 4) : 28 ～29．
［11］吴丽艳，胡靖锋，杨兴梅，等．青花菜游离小孢子培养体系的
优化研究［J］．云南大学学报，2009，31( S2) : 504 ～507．
［12］陈晓，詹玉丝，徐小利，等．花药培养建立辣椒 DH 纯系的初
步研究［J］．河南农业科学，2003( 9) : 52 ～55．
［13］张菊平．辣椒花药小孢子培养及其胚状体发生机理研究
［D］．杨凌:西北农林科技大学，2007．
913 期 翟晓巧等:灰楸体外植株再生体系建立