全 文 ：2009年 4月　　　　　　　　　　　　　　　　　云南化工　　　　　　　　　　　　　 　　　　　Apr.2009
　第 36卷第 2期　　　　　　　　　　　　YunnanChemicalTechnology　　　　　　　　　　　　　　Vol.36, No.2　
叶下花黄酮抗氧化活性研究
李东海 ,杨发忠 ,代红娟 ,张丽 ,陈厚琴
(西南林学院 ,云南昆明 650092)
收稿日期:2009-01-15　　　　稿件修回日期:2009-03-13
基金项目:云南省西南林学院基金(0745)。
作者简介:李东海(1988-),男 ,贵州贵阳人 ,西南林学院大学三年级学生。
通讯作者:杨发忠(1974-),男 ,云南楚雄人 ,讲师 ,硕士 ,主要从事天然药物化学研究。
摘　要:　采用 3种体外模型 ,通过与 Vc和芦丁进行比较 ,研究了叶下花黄酮成分的抗氧化活性。 结果表明 ,
叶下花黄酮具有较强的还原力和抗氧化活性 ,二者的变化关系具有一致性 ,并呈现很好的量效关系;羟基自由基清
除率最高可达 82.58%。三者比较 ,还原力和抗氧化活性顺序均为抗坏血酸≈叶下花黄酮 >芦丁;三者的SC
50
分别
为 39.17、66.50、 91.06mg/L。为从叶下花黄酮中分离提取具有较高活性的新型天然抗氧化剂奠定基础。
关键词:　叶下花;黄酮;抗氧化;自由基清除
中图分类号:　R284　　文献标识码:　A　　文章编号:　1004-275X(2009)02-0032-04
　　叶下花(AinsliaeapertyoidesFranch.var.albo
-tomentosaBeauverd)也称白背兔耳风 、白背叶下
花 、追风箭等 ,是菊科(Compositae)帚菊木族(Mu-
tisieaeCass)兔耳风属(AinsliaeaDC)草本植物 。
在 《本草纲目 》等多种药典中均有收录 [ 1] 。叶下花
作为骨科良药 ,资源丰富 、药效优良 ,例如能治疗
强直性脊柱炎 ,意义重大 ,应用十分广泛[ 2] 。但除
了叶下花的用药研究之外 ,实生苗训化 、质量控
制 、有效成分药理学研究 、化学成分系统研究以及
用药安全等大部分领域的研究都还十分缺乏 ,给
叶下花中药现代化带来困难 。业已证明 ,植物黄
酮是具有多种生理功能的活性成分 [ 3] ,本实验用
有机溶剂提取叶下花黄酮成分 ,以芦丁和抗坏血
酸作对比 ,用 3种体外模型研究了叶下花黄酮成
分的还原力和抗氧化活性 ,以期为叶下花用药的
中药现代化提供理论基础 。
1　实验部分
1.1　中药材与主要试剂和仪器
叶下花干燥全草 ,采自云南省楚雄市树苴镇。
芦丁(rutin)标准品 ,成都欧康植化科技有限公司。
亚铁氰化钾(K3Fe(CN)6)、三氯化铁(FeCl3)、亚硝
酸钠 (NaNO2)、硝酸铝 (Al(NO3)3 )、氢氧化钠
(NaOH)、磷酸二氢钠 (NaH2 PO4 )、磷酸二氢钠
(Na2HPO4)、过氧化氢(H2O2)、三氯乙酸(trichloro-
aceticacid, TCA)、硫酸亚铁 、邻二氮菲 (1, 10-
Phenanthroline)、抗坏血酸(ascorbicacid, Vc)、水杨
酸(salicylicacid)、无水乙醇等均为分析纯;实验用
水为去离子水。
Unic7200可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪
器有限公司),电子天平(Sartorius, Bs210s,北京赛
多利斯天平有限公司), HWS12型电热恒温水浴
锅(上海一恒科技有限公司), 0408-1台式低速离
心机(上海医疗器械集团有限公司), RE-200型旋
转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂), RO-DI-50-RE
纯水系统(厦门锐思捷公司)。
1.2实验方法
1.2.1　叶下花总黄酮提取
用电子天平准确称取 10.0000g叶下花干燥
全草粉末 , 控制水浴温度为 65℃,用体积分数为
55%乙醇 -水回流提取 ,每次用 300mL溶剂提取 3
次 ,共 2h,滤过 ,合并 ,定容至 1000mL,得棕黄色
的叶下花总黄酮(flavonoidextractfromA.perty-
oides, FE)提取液 。避光低温保存 ,待用。
1.2.2　芦丁标准曲线的绘制
采用 NaNO2 -Al(NO3 )3 -NaOH法测定总黄
酮 [ 4] 。精确称取芦丁标准品 50mg, 置于 50mL量
瓶中 ,加 60%乙醇溶解并稀释至刻度 , 摇匀 , 即得
芦丁标准溶液。
分别配制不同浓度的芦丁标准溶液 , 各取
10.00mL,先分别加入质量分数 5% NaNO2溶液
1mL,摇匀 , 放置 6 min后 , 分别加入质量分数
5% Al(NO3)3溶液 1mL,摇匀 ,再放置 6 min后 ,
再分别加入质量分数 10%NaOH溶液 10mL,用水
稀释至 50.00mL,摇匀 ,放置 10 ～ 15min后 , 采用
试剂参比 ,在 λ=510nm处测定吸光度 A。用 Ori-
gin6.1软件进行数据处理(下同),得标准工作曲
线回归方程为 A=0.009 84C+0.046 92 ,相关系
数 r=0.999 47,线性范围 12.80 ～ 121.80 mg/L。
线性关系良好 , 可以作为叶下花总黄酮含量的测
定方法 。
1.2.3叶下花总黄酮含量测定
取总黄酮提取液 10.00mL,按与芦丁相同的
方法测定吸光度值 ,并据芦丁标准工作曲线计算
定容到 100mL后黄酮提取液中总黄酮的质量浓
度为 401.0mg/L。进而计算在叶下花样品中总黄
酮的质量分数为 4.010% (40.10 mg/g)。另将所
得溶液在旋转蒸发仪中减压蒸干 ,准确称取少量
固体 ,重新溶解 ,在容量瓶中配制成 1000g/L的叶
下花黄酮提取液 ,用于抗氧化活性的测定 。
1.2.4　叶下花黄酮成分还原力的测定
参考 Oyaizu[ 5]的方法 ,稍有改动 ,取 2.5mL不
同浓度的黄酮提取液于试管中 ,依次加入 2.5mL
0.2mol/L磷酸盐缓冲液(phosphatebufersaline,
PBS, pH6.6)和 2.5mL1% K3Fe(CN)6溶液 ,于
50℃水浴 20min后快速冷却 ,再加入 2.5mL10%
三氯乙酸溶液(TCA),以 3000r/min的转速离心
10min,取上清液 2.5 mL,依次加入 2.5 mL蒸馏
水 , 0.5mL0.1%FeCl3溶液 ,充分混匀 ,静置 10min
后 ,在 700nm下测定其吸光度值(以蒸馏水代替
样品的混合液作参比溶液),吸光度值越高还原力
越强。
同法测定抗坏血酸和芦丁的还原力。
1.2.5　叶下花黄酮成分抗氧化活性的测定
采用邻二氮菲法 [ 6]和水杨酸 [ 3]法两种方法对
叶下花黄酮成分的 · OH清除率进行实验 ,以评
价叶下花黄酮成分的抗氧化活性。
邻二氮菲法:分别取 1mL7.5mmol/L邻二氮
菲溶液于试管中 ,依次加入 2mL0.2mol/L磷酸盐
缓冲液(pH7.4)和 1mL去离子水 ,充分混匀 ,加入
1mL7.5 mmol/LFeSO4混匀 , 加入 1 mL0.1%
H2O2;于 37℃水浴 60min后 ,在 536nm处测定吸
光度值 , 所测的数据为损伤管的吸光度值 A损伤 。
未损伤管以 1 mL去离子水代替损伤管中 1 mL
0.1%的 H2O2 ,操作同损伤管 ,可测得未损伤管的
吸光度值 A未损 。样品管以 1mL样品代替损伤管
的 1mL去离子水 ,操作同损伤管 ,可测得样品管
的吸光度值 A样品 。
羟基自由基清除率 =[ (A样品 -A损伤)/(A未损
-A损伤)] ×100%。
水杨酸法:利用 H2O2对 Fe2+混合产生 ·OH,
在体系内加入水杨酸捕捉 ·OH并产生有色物质 ,
该物质在 510nm下有最大吸收。反应体系中含有
8.8 mmol/LH2O2 2 mL、 9 mmol/LFeSO4 2 mL、 9
mmol/L水杨酸 -乙醇 2 mL,不同浓度的叶下花黄
酮溶液 2 mL。最后加 H2O2启动反应 , 37℃反应
0.5h,以蒸馏水为参比 ,在 510nm下测量各溶液
的吸光度 ,考虑到本身的吸光值 ,以 9mmol/LFe-
SO4 2mL,水杨酸 -乙醇 2mL。不同浓度的叶下花
黄酮溶液 2mL为黄酮的本底吸收。
羟基自由基清除率 =[ Ao-(Ax-Axo)] /Ao×
100%。
式中:Ao为空白对照液的吸光度 , Ax为加入黄酮溶
液后的吸光度 , Axo为不加 H2O2黄酮溶液的本底吸
光度。
抗坏血酸和芦丁的羟基自由基清除率分别按
照以上两种方法同法测定。
2　结果与分析
2.1　叶下花黄酮的还原力
抗氧化剂的还原力与其抗氧化性之间存在十
分密切的关系 。抗氧化剂是电子的给予体 (elec-
trondonor),通过自身的还原作用给出电子而清除
自由基 ,还原力越强 ,抗氧化性越强 。因此 ,可通
过测定还原力来说明其抗氧化活性的大小 [ 7] 。普
鲁士蓝法测定还原力的原理是样品将铁氰化钾
(K3Fe(CN)6)还原成亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6),
亚铁氰化钾再与 Fe3+作用 ,生成亚铁氰化铁(普鲁
士蓝),在 700nm波长处检测普鲁士蓝的吸光度 ,
以表示还原力的大小 ,吸光度越高样品的还原力
就越强。
用此法测定叶下花黄酮成分 、芦丁 、抗坏血酸
的还原力 ,结果如图 1所示。
·33·　2009年第 2期　　　　　　　　　　　　李东海等:叶下花黄酮抗氧化活性研究
图 1　Vc、芦丁 、叶下花黄酮的还原力比较
Figure1Comparisonofreductivityamongvitamin
C, rutinandflavonoidsfromAinsliaeapertyoide
从图 1看出 , 3者还原力均随浓度增加而逐渐
增大 , 呈现较好的量效关系 , 都具有较强的还原
力 。叶下花黄酮提取物的还原力与抗坏血酸的很
接近 ,特别是在低浓度范围内超过抗坏血酸;与芦
丁相比 ,还原力在所测定浓度范围内比芦丁强很
多 ,同样在低浓度范围内叶下花黄酮提取物显示
出更强的还原力 。
2.2　叶下花黄酮成分抗氧化活性
2.2.1　邻二氮菲法
参照 Fenton反应 [ 8]的方法建立 · OH自由基
产生模型。 H2O2与二价铁离子混合后产生 · OH
的 Fenton反应为:H2O2 +Fe2+ =OH- +· OH+
Fe3+ , · OH具有很高的反应活性 , 存活时间短 。
如果加入抗氧化剂 ,将会有更多的 Fe2+存留于溶
液中 ,而使吸光度增加 ,从而可用计算出的羟基自
由基清除率表示出抗氧化剂的活性。
抗坏血酸 、芦丁 、叶下花黄酮提取物的羟基自
由基清除率的实验结果如图 2所示。
从图 2看出 ,随抗氧化剂加入量增加 ,羟基自
由基清除率明显增大。当加入抗氧化剂的质量浓
度为 50.00mg/L时 ,抗坏血酸和芦丁的清除率分
别为 28.87%、30.01%;而叶下花黄酮为 65.82%,
是抗坏血酸和芦丁的两倍多;最高可达 82.58%,
接近抗坏血酸 ,在低浓度范围内则超过抗坏血酸;
在所测定浓度范围内均比芦丁强得多 。
图 2　邻二氮菲法比较Vc、芦丁 、叶下花黄酮的羟基自由基清除率
Figure2HydroxylradicalscavengingrateofvitaminC, rutin
andflavonoidsfromAinsliaeapertyoidebyphenanthrolinemethod
通过 Origin软件分析可知 ,叶下花黄酮提取物 、
抗坏血酸和芦丁的半清除率质量浓度 SC50分别为
39.17、66.50、91.06mg/L,从 SC50来看 ,叶下花黄酮提
取物的羟基自由基清除率约为抗坏血酸的 2倍 ,更比
芦丁的 2倍还强。
2.2.2　水杨酸法
Fenton反应产生的 ·OH,也可在反应体系中加入
水杨酸来有效地捕捉 ,并产生有色产物。该产物在 510
nm处有强吸收 ,若加入具有清除·OH功能的被测物 ,
它会与水杨酸竞争 ·OH,从而使有色产物的生成量减
少。采用固定反应时间法 ,测量含被测物反应液的吸
光度 ,并与空白液比较 ,便能测定被测物对 ·OH的清
除情况。图 3为叶下花黄酮提取液、抗坏血酸(Vc)、芦
丁 3种物质对羟基自由基的清除实验结果。
图 3　水杨酸法比较Vc、芦丁 、叶下花黄酮的羟基自由基清除率
Figure3HydroxylradicalscavengingrateofvitaminC, rutin
andflavonoidsfromAinsliaeapertyoidebysalicylicacidsystem
·34· 云南化工　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年第 2期　
由图 3可知 ,自由基清除率变化趋势与邻二
氮菲模型中结果十分相似 ,也是随抗氧化剂浓度
增加 ,自由基清除率增大 ,量效关系十分显著 ,变
化关系更具规律性 。同样 ,叶下花黄酮的羟基自
由基清除能力接近抗坏血酸 ,并比芦丁强得多 ,最
高可达 61.96%。但加入量超过 100.0mg/L后 ,清
除率增加程度随浓度增加不是很显著 。
在水杨酸 -Fe2+-H2O2模型中 ,叶下花黄酮提
取物 、抗坏血酸和芦丁的 SC50分别为 97.04、
88.22、211.4mg/L,叶下花黄酮的自由基清除能力
小于抗坏血酸 ,且很接近 ,但比芦丁的强得多。
3　结论
生命活动的有氧代谢可以不断产生各种自由
基 ,羟基自由基 · OH是其中 3种有代表性的自由
基(超氧阴离子自由基 ·O2 -、羟基自由基 · OH、
酯自由基 RCOO· )之一 , Fenton反应是体内产生
羟基自由基的重要机理。羟基自由基是造成组织脂
过氧化 、蛋白质解聚 、核酸断裂 、多糖解聚的重要活
性氧 。羟基自由基清除率是反映药物抗氧化作用的
重要指标 [ 9] 。人体自身内源性自由基清除系统可
以清除体内多余自由基 ,但毕竟有限 ,更多的是发掘
外源性抗氧化剂———自由基清除剂 ,将其添加到药
品中或食品中 ,阻断自由基对人体的入侵。
本实验利用普鲁士蓝法研究了叶下花黄酮提
取物的还原力 ,并利用与人体内产生羟基自由基
相似的机理(Fe2 +-H2O2模型)研究了叶下花黄酮
提取物的抗氧化活性 。结果显示 ,还原力和抗氧
化活性的变化关系具有一致性 ,均随浓度增加而
逐渐增强 ,呈现很好的量效关系;羟基自由基清除
率最高可达 82.58%(在邻二氮菲-Fe2+-H2O2模型
中);在与抗坏血酸和芦丁的比较研究中 ,可以看
出 ,叶下花黄酮提取物的还原力和抗氧化活性接
近抗坏血酸 ,在低浓度范围内则超过抗坏血酸 ,且
在所测定浓度范围内均比芦丁强得多。总体来
看 ,叶下花黄酮提取物具有较强的还原力和抗氧
化活性 , 其活性与抗坏血酸相当 ,且比芦丁强得
多 ,其顺序为抗坏血酸 ≈叶下花黄酮 >芦丁 。研
究结果为从叶下花黄酮中分离提取具有较高活性
的新型抗氧化剂奠定基础 ,也为叶下花用药安全 、
质量控制 、药理作用 、药物开发等中药现代化的基
础研究提供依据。
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AntioxidantActivityofFlavonoidsfromAinsliaeapertyoides
LIDong-hai, YANGFa-zhong, DAIHong-juan, ZHANGli, CHENHou-qin
(SouthwestForestrySchool, Kunming650092)
Abstract:　AntioxidantactivityofflavonoidsfromAinsliaeapertyoideswasdeterminedandcomparedwithvitaminC
andrutinbythreemodelsinvitro.ResultshowedthatflavonoidsfromAinsliaeapertyoidesexhibitedpotentantioxidantactivi-
ty, with82.58% offreeradicalsscavengingrate.Flavonoidswerealsofoundtoshowstrongreductiveactivity, whichwas
closelyaccordedwithantioxidantcapacities.ReductiveandantioxidantactivitiesofflavonoidsweresimilartovitaminC, but
wasstrongerthatthatofrutin, withSC50of66.50, 39.17and91.06μg/mLrespectively.
Keywords:　 Ainsliaeapertyoides;flavonoids;antioxidant;freeradicalscavenging
·35·　2009年第 2期　　　　　　　　　　　　李东海等:叶下花黄酮抗氧化活性研究