全 文 ：［收稿日期］ 20150405(001)
［基金项目］ 贵州省科学技术基金项目(黔科合 J字［2010］2213 号);贵州省应用化学特色重点学科(黔教科研发［2012］442 号)
［第一作者］ 甘秀海，副教授，从事中药化学成分及质量控制研究，Tel:0851-86700494，E-mail:gxh200719@ 163. com
［通讯作者］ * 赵超，副研究员，从事中药化学及中药质量控制研究，Tel:0851-86700494，E-mail:chaozhao@ 126. com
冷水花总黄酮的提取工艺优选及抗氧化活性考察
甘秀海1，梁志远1，赵超2*
(1. 贵州师范学院 化学与生命科学学院，贵阳 550018;
2. 贵州师范大学 天然药物质量控制研究中心，贵阳 550001)
［摘要］ 目的:测定不同产地冷水花中总黄酮的含量并评价其抗氧化活性。方法:在单因素试验基础上，以总黄酮提取
量为指标，选择料液比、提取温度、提取时间为考察因素，采用响应面法优化冷水花总黄酮的提取工艺，测定不同产地冷水花
样品中总黄酮的含量并考察其抗氧化活性。结果:最佳提取工艺为料液比 1∶ 19，提取温度 71 ℃，提取时间 126 min。冷水花
总黄酮提取量 7. 08 mg·g －1;不同产地样品中总黄酮质量分数 4. 35 ～ 7. 10 mg·g －1，具有明显的地域差异性。冷水花总黄酮对
1，1-二苯基苦基苯肼和 2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基的清除能力与维生素 C相当。结论:不同产地冷
水花中总黄酮具有较好的抗氧化能力，且该能力与总黄酮含量具有明显量效关系。
［关键词］ 冷水花;总黄酮;响应面法;抗氧化活性
［中图分类号］ Ｒ283. 6;Ｒ284. 1;Ｒ284. 2;Ｒ917 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2015)16-0010-04
［doi］ 10. 13422 / j． cnki． syfjx． 2015160010
［网络出版地址］ http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /11． 3495． Ｒ． 20150702． 1014． 008． html
［网络出版时间］ 2015-07-02 10:14
Investigation of Extraction Process and Antioxidation of Total Flavonoids from Pilea aquarum
GAN Xiu-hai1，LIANG Zhi-yuan1，ZHAO Chao2* (1. School of Chemistry and Life Science，Guizhou Normal
University，Guiyang 550018，China;2. Ｒesearch Center for Quality Control of Natural Medicine，Guizhou Normal
University，Guiyang 550001，China)
［Abstract］ Objective:To determine the content of total flavonoids from Pilea aquarum and evaluate its
antioxidative activity． Method:With the content of total flavonoids as an indicator，based on single factor
experiments，response surface methodology was adopted to optimize extraction process by taking liquid-solid ratio，
extraction temperature and time as factors． The content of total flavonoids in P． aquarum from different places were
determined，then antioxidation of total flavonoids were evaluated against DPPH and ABTS free radical． Ｒesult:
Optimum coditions were as follows:liquid-solid ratio of 1∶ 19，extraction temperature at 71 ℃ and extraction time
of 126 min． Yield of total flavonoids was as high as 7. 08 mg·g －1 under these conditions． The content of total
flavonoids in P． aquarumfrom different places was from 4. 35 to 7. 10 mg·g －1 with obvious regional differences．
Scavenging capacity of total flavonoids were as same as vitamin C against DPPH and ABTS free radical．
Conclusion:There is obvious difference of total flavonoids content in P． aquarum from different places，and total
flavonoids has good antioxidative activity in a dose-dependent manner．
［Key words］ Pilea aquarum;total flavonoids;response surface methodology;antioxidation
冷水花具有清热、利湿、退黄等功效，是贵州常
见苗族药品种，可用于治疗黄疸、肺结核等疾
病［1-3］。前期通过系统化学成分研究发现，冷水花
中含有多种黄酮类化合物，并具有一定抗菌活
性［4-5］;另外，本课题组还采用了高效液相色谱法
(HPLC)测定不同种冷水花中木犀草苷和大波斯菊
苷的含量，结果发现湿生冷水花中这 2 种黄酮类成
分的含量较高［6］。为进一步开发冷水花的药材资
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源，在单因素试验基础上，本实验采用响应面法优化
冷水花总黄酮的提取工艺，利用紫外分光光度法
(ultraviolet spectrophotometry，UV)测定不同产地冷
水花中总黄酮的含量，比较不同产地冷水花总黄酮
的抗氧化活性，为该药材资源的综合开发与利用提
供参考。
1 材料
Cary-100 型紫外-可见分光光度计(美国瓦里安
公司)，XFB-200 型中药粉碎机(长沙市中南制药机
械厂)，AL204 型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多
公司)。湿生冷水花样品于 2012 年 9 ～ 10 月采自贵
州省境内，经贵州师范学院朱富寿教授鉴定为荨麻
科植物湿生冷水花 Pilea aquarum的全草;芦丁对照
品(中国食品药品检定研究院，批号 111521-
200303)，1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)和 2，2-联氮-
二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)均购于
美国 Sigma公司，维生素 C(北京市金诺欣成化工有
限公司)，试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 供试品溶液的制备 取冷水花全草，粉碎，过
60 目筛，精密称取 1. 0 g，用石油醚脱脂后，按一定
料液比加入 70%乙醇，于一定温度下加热提取，趁
热过滤，取滤液，加 70%乙醇定容至 50 mL，即得。
2. 2 标准曲线绘制 精确称取芦丁对照品 10 mg，
加 70%乙醇溶解并定容至 50 mL，得 0. 20 g·L －1对
照品溶液。参考文献［7］方法，准确吸取芦丁对照
品溶液 0. 25，0. 5，1. 0，2. 0，4. 0，8. 0 mL，分别置于
25 mL量瓶中，用 70%乙醇补至 8. 0 mL，加入 5%亚
硝酸钠溶液 1 mL，摇匀，静置 5 min;加入 10%硝酸
铝溶液 1 mL，摇匀，静置 5 min;加入 4%氢氧化钠溶
液 10 mL，用 70%乙醇定容至刻度，摇匀，以试剂为
空白参比液，于 510 nm处测定吸光度 A，平行测定 3
次，以 A为纵坐标，质量浓度(C)为横坐标，得回归
方程 A = 11. 318C + 0. 012(Ｒ2 = 0. 999 6)，结果表明
芦丁质量浓度在 0. 002 ～ 0. 064 g·L －1与 A呈良好线
性关系。
2. 3 提取工艺优选［8］ 在单因素试验基础上，确
定以 70%乙醇为提取溶剂，选择料液比、提取温度
及时间为自变量，以总黄酮提取量(Y)为因变量，利
用 Design-Expert 8. 0. 6 软件中的 Box-Behnken 优化
冷水花总黄酮的提取条件。取冷水花全草，粉碎，过
60 目筛，精密称取 1. 0 g，共 17 份，试验安排及结果
见表 1。对表 1 中数据进行多元回归分析，得因变
量对各自变量的二次多项回归方程 Y = 6. 99 －
0. 055A + 0. 016B + 0. 049C － 0. 038AB － 0. 12AC +
0. 02BC － 0. 29A2 － 0. 28B2 － 0. 35C2，该回归模型的
方差分析见表 2。
表 1 冷水花总黄酮提取工艺响应面试验分析
Table 1 Ｒesponse surface analysis for extraction process of total
flavonoids from Pilea aquarum
No．
A料液比
/ g·mL －1
B提取温度
/℃
C提取时间
/min
总黄酮
/mg·g － 1
1 1∶ 30 70 60 6. 34
2 1∶ 10 80 120 6. 51
3 1∶ 30 70 180 6. 22
4 1∶ 20 60 180 6. 36
5 1∶ 10 70 60 6. 25
6 1∶ 30 80 120 6. 35
7 1∶ 20 70 120 6. 98
8 1∶ 30 60 120 6. 41
9 1∶ 20 60 60 6. 31
10 1∶ 10 70 180 6. 59
11 1∶ 20 70 120 7. 01
12 1∶ 20 70 120 6. 99
13 1∶ 10 60 120 6. 42
14 1∶ 20 70 120 6. 99
15 1∶ 20 80 60 6. 32
16 1∶ 20 80 180 6. 45
17 1∶ 20 70 120 6. 98
表 2 回归模型方差分析
Table 2 Variance analysis of regression model
方差来源 SS f MS F P
模型 1. 440 9 0. 160 434. 97 ＜0. 000 1
A 0. 024 1 0. 024 65. 79 ＜0. 000 1
B 2. 113 ×10 －3 1 2. 113 ×10 －3 5. 74 0. 047 7
C 0. 019 1 0. 019 51. 68 0. 000 2
AB 5. 625 ×10 －3 1 5. 625 ×10 －3 15. 29 0. 005 8
AC 0. 055 1 0. 055 150. 13 ＜0. 000 1
BC 1. 600 ×10 －3 1 1. 600 ×10 －3 4. 35 0. 075 5
A2 0. 350 1 0. 350 946. 09 ＜0. 000 1
B2 0. 330 1 0. 330 897. 37 ＜0. 000 1
C2 0. 520 1 0. 520 1 402. 15 ＜0. 000 1
残差 2. 575 ×10 －3 7 3. 679 ×10 －4
失拟项 1. 975 ×10 －3 3 6. 583 ×10 －4 4. 39 0. 093 5
绝对误差 6. 000 ×10 －4 4 1. 500 ×10 －4
总差离 1. 440 16
由表 2 可知，模型的 P ＜ 0. 000 1，表明该回归模
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型达到了极显著水平，说明建立的模型可靠。回归
方程复相关系数(Ｒ2)0. 998 2，说明该模型拟合程度
较好。模型的修正复相关系数(Ｒ2adj)0. 995 9，表明
该方程较好地反映了各自变量与因变量的关系，提
示该模型对冷水花总黄酮提取工艺的分析和预测
良好。由回归模型的方差分析可知，一次项 A，C
和二次项 A2，B2，C2 均对总黄酮提取工艺影响极
显著，因素 B 影响显著，交互项 AC，AB 对总黄酮提
取工艺的影响高度显著。在所选试验范围内，由 F
可判断 3 个因素对提取工艺的影响顺序为 A ＞ C ＞
B。各自变量交互作用对总黄酮提取量的影响分
析见图 1。结果发现各自变量对提取工艺的影响
均表现出先上升后下降的趋势，同时交互因子对
总黄酮提取量影响均能够达到响应值的极大值，
其中因素 A影响最显著，表现为曲面最陡峭，响应
值变化较大。
通过响应面软件分析，得冷水花总黄酮的最佳
提取工艺为料液比 1∶ 18. 8，提取温度 70. 4 ℃，提取
时间 125. 4 min，此条件下总黄酮理论提取量 7. 10
mg·g －1。考虑实际操作，将提取条件修正为料液比
1∶ 19，提取温度 71 ℃，提取时间 126 min。取冷水花
全草，粉碎，过 60 目筛，精密称取 1. 0 g，共 3 份，测
得总黄酮平均提取量 7. 08 mg·g －1(ＲSD 1. 3%)，与
理论提取量的相对误差 1. 1%，说明优选的提取工
艺稳定可行。
2. 4 重复性试验 精密称取同一批冷水花样品 6
份，依据最佳提取工艺条件，按 2. 1 项下方法制备供
试品溶液，按 2. 2 项下方法测定，计算总黄酮含量的
ＲSD 1. 1%，表明该方法重复性良好。
2. 5 精密度试验 精密吸取对照品溶液 2 mL，按
2. 2 项下方法重复测定 6 次，计算总黄酮含量的
ＲSD 0. 9%，表明仪器精密度良好。
2. 6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液
2 mL，共 6 份，按 2. 2 项下方法每隔 30 min 测定 1
次吸光度，结果 3 h内 ＲSD 1. 0%，表明供试品溶液
在 0 ～ 3 h内稳定性良好。
2. 7 加样回收率试验［9］ 精密称定已知总黄酮
质量分数为 6. 85 mg·g － 1的冷水花样品约 0. 4，
0. 5，0. 6 g，各 3 份，分别精密加入芦丁对照品
4. 0，3. 0，2. 0 mg，按 2. 1 项下方法制备供试品溶
液，按 2. 2 项下方法测定总黄酮含量，计算回收
率，结果见表 3。
2. 8 样品的含量测定 精密称取冷水花粉末样品
1. 0 g，按 2. 1 项下方法制备供试品溶液，按 2. 2 项
图 1 料液比、提取温度和提取时间交互作用对冷水花总黄酮提取量
的响应面
Fig． 1 Ｒesponse surface plots showing interaction of liquid-solid
ratio，extraction temperature and time on yield of total flavonoids
from Pilea aquarum
表 3 冷水花总黄酮含量测定的加样回收率试验
Table 3 Ｒecovery test of determination of total flavonoids from
Pilea aquarum
称样量
/ g
样品中量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
ＲSD
/%
0. 410 2 2. 809 9 4. 011 2 6. 714 5 97. 34
0. 405 1 2. 774 9 3. 998 5 6. 712 8 98. 48
0. 399 5 2. 736 6 4. 103 5 6. 815 0 99. 39
0. 503 4 3. 448 3 3. 102 6 6. 558 1 100. 23
0. 510 1 3. 494 2 3. 002 1 6. 436 2 98. 00 98. 70 1. 6
0. 499 7 3. 422 9 3. 018 5 6. 382 7 98. 06
0. 598 8 4. 101 8 1. 997 8 6. 081 2 99. 08
0. 604 0 4. 137 4 2. 056 3 6. 115 9 96. 22
0. 610 5 4. 181 9 2. 101 5 6. 314 8 101. 49
下方法测定总黄酮含量，结果见表 4。结果显示不
同产地冷水花样品中总黄酮的含量具有明显差异，
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其中贵州玉屏冷水花中总黄酮的含量最高，而贵州
贵阳冷水花中总黄酮的含量最低;贵州贵阳的冷水
花采自黔灵公园较潮湿的背阳处，其余均采自向阳
处，说明样品中总黄酮含量与土壤、阳光、水分等气
候的差异密切相关。
表 4 不同产地冷水花中总黄酮含量及抗氧化活性
Table 4 Content and antioxidant activity of total flavonoids in Pilea
aquarum from different places
样品 产地 采集时间
总黄酮
/mg·g － 1
IC50 /mg·L －1
DPPH ABTS
S1 贵州纳雍 2012-09 6. 52 5. 32 10. 87
S2 贵州贵阳 2012-10 4. 35 8. 18 13. 15
S3 贵州凯里 2012-09 6. 78 5. 22 10. 19
S4 贵州天柱 2012-09 7. 05 5. 01 9. 87
S5 贵州正安 2012-09 7. 09 4. 98 9. 62
S6 贵州息烽 2012-09 6. 85 6. 11 10. 35
S7 贵州惠水 2012-10 5. 46 7. 92 12. 18
S8 贵州遵义 2012-10 6. 12 5. 18 10. 65
S9 贵州盘县 2012-09 6. 98 5. 02 10. 11
S10 贵州玉屏 2012-10 7. 10 4. 88 9. 11
2. 9 抗氧化活性测定［7，10］ 将样品溶液及阳性对
照溶液用 70%乙醇配成系列质量浓度，测定各溶液
对 DPPH和 ABTS 自由基的清除能力(n = 3)，计算
清除率，利用 Origin 软件处理数据，得各样品消除
DPPH和 ABTS自由基的半数抑制率(half inhibition
concentration，IC50)，见表 4。结果显示冷水花总黄
酮样品对 DPPH和 ABTS自由基具有较好的消除能
力，多数产地样品对自由基的清除能力优于维生素
C(对 DPPH 和 ABTS 自由基的 IC50分别为 7. 17，
11. 54 mg·L －1)，其中贵州玉屏产冷水花样品对
DPPH和 ABTS自由基清除能力最强，总黄酮的含量
也最高;而贵州贵阳冷水花样品总黄酮对自由基的
清除能力最弱，总黄酮含量也最低，说明冷水花样品
对自由基的清除能力与总黄酮含量成量效关系。
3 讨论
冷水花是一种广泛分布于贵州的苗族习用药材
之一，前期研究发现其木犀草苷和大波斯菊苷含量
较高，但要得到纯的单体化合物较困难，这阻碍了冷
水花药用资源的利用。本文在单因素试验基础上，
采用响应面试验优化了总黄酮的提取工艺［11］。总
黄酮的含量测定常采用 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH
法，多羟基黄酮类化合物(如芦丁、金丝桃苷、异槲
皮苷、槲皮苷)在 510 nm 处有最大吸收，其余均无
最大吸收［12］，故选择芦丁为指标成分测定总黄酮含
量。结果表明不同产地冷水花样品中总黄酮的含量
具有明显差异，这可能与不同地区的土壤特性及光
照、水分等气候有关。
采用 DPPH和 ABTS自由基评价法测定了冷水
花样品对自由基的清除能力，这是 2 种被广泛认可
的抗氧化活性测定方法，具有快速、准确等优点。结
果显示冷水花总黄酮具有较好的抗氧化活性能力，
但不同产地样品的清除能力差异性较大，总黄酮含
量高的样品清除自由基的能力强，反之清除自由基
的能力弱，说明冷水花清除自由基的能力与总黄酮
含量间呈较好的量效关系，为该药材的药理活性物
质基础研究提供实验依据。
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［责任编辑 刘德文］
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