全 文 ：今
《食品与发哮工业 》 F o o d 乙 F e r m e n ta ti o n I n d s u tr i e s 1 92 9N o . 5
蘑菇中伞菌氨酸的分离和分析
杨祖英
(卫生部食品卫生监督检验所 )
J
.
L 位 th y
(瑞士泊尔尼大学生物化学所 )
户
伞菌氨酸是人工培植的伞菌科蘑菇和一
些野生蘑菇中存在的一种对轻甲基苯饼衍生
物 . 其含量为 0 . 04 ~ 0 . 0 7% (按鲜重计 ) 。 伞
菌氮酸 (a ga ri i tn e) 在蘑菇中 y- 谷氨酞转移酶
的作用下进行下列反应 :
1 9 7 7年 T o th , B . 等证明 ( b )和 ( e )诱发小鼠肺
癌和血管瘤 。 ( c )还能诱发小鼠皮肤癌 。
本题 目的目的是分离和分析落菇 中伞菌氮睦
(明 a r i t ien ) 。
材 料 与 方 法
“ 0一 , · `笼』- , 。 。“ c。一` , : `“邢 , “ , : ` 0。“ —
-NO .cR { 〕 es N 一 。一 ,同声毛多- 侧
从 19 5 7 年起 ,美国 T o t h B . 等已经证
明 50 多个拼和酞麟化合物能诱发实验动物
致癌 ,而这些麟化合物中的三个在结构上与
伞菌氨酸相关 。 为此 ,对伞菌氨酸 引起了疑
虑 。
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伞菌氨酸 ( a g a r i t i n e )
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4一 甲荃苯基麟氢氛化物
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4
一
(经甲基 ) 四氟硼酸重氮苯
舜
一 、 仪器 : 吹风机 、 层析缸 、 微量注射器 。
高效液相色谱仪 (W at e r 公司 ) 、 紫外分光光
度计 。
二 、 试剂 : 正丁醉 、 醋酸 、 硫酸按 、 甲醉 、
乙醉 、 氛化钠 、 对二甲氨基肉桂醛 , 均为分析
纯 。 其余试剂如下 :
1
. 阳离子交换树脂 : D O W ex SOW X S ,
5 0一 1 0 0 目 , H 十型 , F L U K A A G 。
2
. 阴离子交换树脂 J 义)Wex l 又 4 , 50 一
1 0 0 目 。
3
. 移动相 ( H P L C 用 )
9 7 5m I0
.
0 5M 磷酸二氢钾溶液加 2 5 0 1
甲醇 ,混匀后 ,通过 。. 45 拌m 微孔滤膜过滤 。
4
.
I M 硫酸按溶液 : 称取 13 2 . 14 9 硫唆
钱加水至 l o o m l 。
5
. 展开剂 (薄层层析用 )
( l ) 正丁醇 : 冰醋酸 , 水 ( 6 0 , 1 5 , 2 5 )
( 2 ) 甲醉 : 5%氢氧化按 ( 5 : l )
( 3 ) 乙醇 : 5%氢氧化按 ( 5 : l )
( 4 ) 甲醇 : 冰醋酸 : 水 ( 8 : 3 : 5 )
6
. 显色剂 (薄层层析用 )
0
.
4 9 对二 甲氨基肉桂醛 , 加 g m l 盐酸 ,
,
7 5
.
DOI : 10. 13995 /j . cnki . 11 -1802 /ts . 1992. 05. 012
食
3 1m l 甲醇 ,混匀 , 即得 。
三 、 操作步骤 :
1
. 样品处理 : 新鲜蘑菇切碎后 , 贮藏于
一 2 0 ℃冷 冻箱 中 , 过夜后 , 于一 70 ℃冷冻干
燥 , 约 1 ~ 2 天后 , 干燥完毕 , 取出 , 于捣碎机
中捣成粉末 。
2
. 提取 : 称取蘑菇粉末 10 9 , 加 甲醇
l 0 0 0 m l
, 在匀浆机 中混匀 , 放置 hl , 时时搅
拌 ,抽滤 ,得滤液 ,在旋转蒸发器中蒸发至干 ,
水浴温度不能超过 3 ℃ , 然后于冷冻干燥器
中干燥 (一 70 ℃ ) 。 得到粗制品 。
3
. 分离与分析
解后 ,离心 , 吸取上清液 ,然后将此液通过阳
离子交换柱 。 用水洗脱 ,流速为 l m l /。 in , 每
管 5m l , 用部分收集器收集 , 收集 20 0 管 , 然
后 测 定每 管溶 液 的 E 2 3 7 . 5 和 E 2 6 o , 以
E 2 3 7
.
5
E 2 6 0
为纵座标 , 以收 集液的量为横座标 ,
作分布曲线 。 合并 E 2 3 7
.
5 ~
,
一琶厄丽 - 户 l 部分 , 然后 于
一 2。 ℃冷冻后 ,再置于一 70 ℃冷冻干燥箱中
干燥 。取其少量进行薄层定性分析 ,观察哪一
部分含伞菌氨酸多 。从薄层分析的结果看 , 取
第二部分流液较好 , 即收集第 25 管至 60 管 。
( 见图 1 、 2) , 流出液的第 3 部分已经检不出
伞菌氨酸 。 伞菌氨酸紫外分光曲线 (见图 3 ) ,
其 最 大 吸 收 为 轰, = 2 8 1 一 2 7 8 n m , 、 : =
2 3 7
.
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。
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2 0
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4 0
流出 液的量 .一一 - . ~ . . , .图 1. 蘑菇提取物在阳离子交换柱上的
色谱图 (以水为洗脱剂 )
( l) 阳离子交换树脂柱层析 :
取阳离子交换树脂 10 0 克浸泡于水中 ,
放置过夜 , 装柱 ( 1 . 5 x 3 o e m ) ,用 5% H C I 洗
(约 3 0 0 m l ) , 再用 2% N a O H 洗 (约 3 0 0 m l ) ,
然后用 I M ( N H ; ) 2 5 0 ;洗至 p H S . 3 。
称取伞菌氨酸粗制品 69 , 加水 1 2m t 溶
。
7 6
。
图 2 . 阳离子交换树脂流出液薄层色谱
( 1 ) 流出液 I ( 3 ) 对 照
( 2 ) 流出液 l ( 4) 流出液 l
( 2) 阴离子交换树脂柱层析 :
称取 阴离子 交换树脂 ( D O w ex l 又 4)
1。 。g ,用水浸 泡过夜 , 装柱 , 用 2% N a 0 H 洗
(约 3 0 0 m l ) ,用水洗至中性 ,用 0 . 1 8M N H 4 A C
洗至无 lC 一 , p H 为 5 . 7 。
铆
干燥 , 然后进行薄层定性 。 从结果看 ,效果不
好 , 不能分离 (见图 5 ) 。
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2 4 0 2业o n -
举
图 3 . 伞菌氨酸的紫外分光曲线
入m a x l = 2 8 1一 2 7 8 n m
入m a x l = 2 3 7 . s n m
图 5 . 阴离子文换柱流出液薄层色谱图
, 带 ( 3 ) H P L C 分离
称取经阳离子交换树脂层析后的干燥品
0
.
2 59
,加水 Zm l , 通过 S e p 一 P A K C 。微柱过
滤 ,用 W a et r 公司的 H P L C 进行分离 ,用 C : 。
制备柱 , 以 0 . 0 5M N a H Z P O 4 9 7 5 rn l 加 甲醇
25 m l 的混合液 为移动相 , 流速为 1 . o m l/
m in
, 紫外检测器为 2 3 7n m , 伞菌氨酸的滞留
时间为 5 . 0 9 ~ 5 . 4 1m i n ,分离结果见图 6 。
一碑 . 5 .涟出该 t 一向~一 -步
图 4 . 阴离子交换树脂色谱图
称取伞菌氨酸粗制品 6 9 , 加水 12 m l 溶
解 ,离心后 ,取其上清液 ,通过柱子 , 以 p H .S 7
的醋酸钱 溶液洗脱 , 流速为 2m l /m in , 每管
s m l
, 以部分收集器收集 20 。 管 , 然后测定每
管溶液的 E 23 7 . 5 和 E 260 , 作离子交换柱色
、 ` ~ , 。 ~ 、
, ` ,
E 2 3 7
.
5
、 . ` , , 一 二_ 一 … 、 ` 二 , _谱图 (见图 4 ) 。 以气器长岁为纵座标 ,流出液的用 曰 、 2 . ~ ` 产 。 ~ E 2 6 0 / J 叨 、 ~ ` .J ” v “ 叫 ’ 认 “ J
量为横座标 ,将每部分合并于冷冻干燥器 中
众
图 6 . 蘑菇提取物经阳离子文换树脂分离后的产物
的 H P L C 色谱图 (5 . 3 0 处为伞菌氨酸 )
( 4) 薄层层析
收集上述不同峰的流出液 , 于一 70 ℃冷
冻干燥后 , 进行薄层检定 。
·
7 7
.
夯
显色剂 : 见 “ 试剂 ” 项 ,
结 果 : 白底红斑 ,只有滞留时间为 5 . 09
一 5 . 4 1m in 的峰含有伞菌氨酸 (见图 7 ) 。
结 果 与 讨 论
.
’
本研究应用柱层析 、 H P L C 、 薄层层析分
离和分析了蘑菇中伞菌氨酸 , 从分离效果来
看 ,阳离子交换柱 比阴离子交换柱好 。 由于时
间关系没有试验硅胶柱 , 据报道硅胶柱效果
较 H P L C 好 。
本实验达到初步分离蘑菇中伞菌氨酸的
效果 , 所用薄层层析法灵敏度为 。 . 05 拜g 。 本
研究从 sk g 鲜蘑菇 中提取 、 分离得到约 0 . 39
伞菌氨酸粗品 。
本实验在瑞士泊尔尼大学生物化学所食
品室完成 。
甲
参 考 资 料
图 7 . H P L C 各个馏份的薄层色谱图
1
. 滞留时间为 2 . 7m in 的峰
2
. 滞留时间为 5 . 0 9~ 5 . 6 o m in 的峰
3
. 对照
4
. 滞留时间为 7 . o s m in 的峰
5
. 滞留时间为 8 . 1 8m in 的峰
6
. 滞留时间为 14 . s im n 的峰
展开剂 : 正丁醇 : 冰醋酸 : 水 ( 65 , 15
2 5 )
吸附剂 : 纤维素
1
·
T o t h B
·
, J
·
A g r ie
.
F o o d C h e m
. ,
1 9 8 4
,
3 2
( 3 )
,
6 7 6~ 8
.
2
.
T o t h B
.
;
C
a r e
i n g
.
M
u t a g e n s E n
v i r o n
. ,
1 9 8 3
,
3
,
9 9 ~ 1 0 8
.
3
.
H e g n a k e r H
. , e t a l
.
;
E
x p
.
M界 0 1. 1 9 8 5 , 9
( 3 )
,
2 2 1 ~ 9
.
4
.
R
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.
E
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.
,
F
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d C h
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. ,
1 9 8 2
,
2 0
,
9 0 3~ 0 7
.
5
.
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4 7
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