全 文 ：食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY添加剂与调味品
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2015年 第40卷 第07期
收稿日期：2015-02-01 *通讯作者
基金项目：2014年云南民族大学研究生创新基金科研项目(2014YJY80)；中共云南民族大学化学与生物技术学院党委学习型党支部SRT创新
性实验计划项目(2013HXSRTD04)。
作者简介：卢怡雯(1990—)，女(壮族)，云南昆明人，硕士研究生，研究方向为药物分析化学。
卢怡雯，李晓芬，高云涛*，杨海英，温欣竹，郑奔月，虞姣姣
(云南民族大学化学与生物技术学院，
民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，昆明 650500)
摘要：采用微量光度滴定法对花旗松素清除1,1-二苯基-2-苦基苯肼 (1 ,1-Diphenyl-2-
picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl，DPPH)自由基进行研究，确
立微量滴定数学关系，以两者反应的清除计量比R对花旗松素抗氧化能力进行评价，经过数
学关系中的公式推导能简便快捷的计算出相应的EC50%值。结果表明，当DPPH初始量分别为
1.27×10-7、1.78×10-7 mol时，R值为2.142和2.141，对应的EC50%值为2.967×10-6和4.159×10-6
mol/L。在常规实验中，当DPPH初始量均为6.34×10-7 mol时，花旗松素的EC50%值为1.527×10-5
mol/L，低于芦丁的EC50%值1.775×10-5 mol/L，说明花旗松素的抗氧化活性比芦丁强。该方法与
常规方法结果一致，且该方法具有准确度高、样品用量少、操作简单、成本低等优点，对抗氧
化活性物质评价指标的研究具有重要意义。
关键词：花旗松素；1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)自由基；微量光度滴定法；清除计量比R值
中图分类号：TS 201.2 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2015)07-0286-04
Trace spectrometric titrimetric investigation of the taxifolin against
DPPH free radicals
LU Yi-wen, LI Xiao-fen, GAO Yun-tao*, YANG Hai-ying, WEN Xin-zhu, ZHENG Ben-yue, YU Jiao-jiao
(School of Chemistry and Biotechnology, Key Laboratory of Ethnic Medicine Resource
Chemistry, State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education, Yunnan University of
Nationalities, Kunming 650500)
Abstract: In this paper, trace photometric titration method of the taxifolin scavenging 1,1-Diphenyl-2-
picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl) hydrazyl (DPPH) free radicals was applied and
the mathematical relationships of trace photometric titration was established. The antioxidant capacity
of taxifolin was evaluated through the reactive scavenging stoichiometric R of the two substances and
the corresponding EC50% value can be calculated out easily and quickly by derivating the mathematical
relationships. The results showed that if the initial amount of DPPH were 1.27×10-7 mol and 1.78×10-7 mol
respectively, the R value were 2.142 and 2.141, and the corresponding EC50% value were 2.967×10
-6mol/L
花旗松素清除DPPH自由基的
微量光度滴定研究
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2015.07.062
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很多疾病及衰老均与人体内自由基代谢失衡
有关，从天然产物中寻找抗氧化活性物质是目前
研究的热点[1-3]。至今为止，抗氧化活性的研究
方法已有很多，包括化学发光法、分光光度法、
电子自旋共振法、气相色谱法和超高效液相色
谱串联质谱法等实验方法[4-8]。1,1-二苯基-2-苦
基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-
Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl，DPPH)
是一种人工合成的稳定自由基，DPPH光度分析法
则广泛用于天然活性物质抗氧化能力的筛选，具
有准确、快速、简便、灵敏的优点[9-10]。近年来，
李晓芬等[11]和刘萍等[12]分别提出DPPH自由基清除
实验的新型微量电化学滴定法和光度滴定法，以
抗氧化剂与自由基被清除量的剂量比评价清除能
力，弥补了传统的评价指标半数清除浓度EC50%
值因自由基初始浓度的不同而有较大差异且不同
研究之间不具可比性的不足。
花旗松素(5,7 ,3′,4′-四羟基二氢黄酮醇，
Taxifolin)具有多种生理活性，如抗氧化[13]、抗病
毒[14]、抗肿瘤[15]等。已作为一种安全的食品添加
剂被广泛用于食品保鲜及功能食品的开发[16]，但
目前花旗松素清除DPPH自由基活性的研究鲜见
报道。
采用微量光度滴定法[12]研究了花旗松素对
DPPH自由基的清除作用，通过滴定曲线计算花
旗松素与自由基被清除量的化学计量比，即清除
计量比。以清除计量比评价花旗松素的抗氧化能
力，建立以清除计量比计算不同DPPH初始量对应
的EC50%值的方法。该方法可比性好、准确可靠、
试剂和样品用量明显减少、且操作简单、成本
低、易于普及。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
DPPH(1,1-Diphenyl-2-picryhydrazyl，纯度
>99%)、芦丁标准品(纯度>98%)、花旗松素标准
品(纯度>98%)：美国Sigma公司；花旗松素储备液
(3.29×10-4 mol/L)、DPPH储备液(2.54×10-4 mol/
L)、芦丁储备液(3.28×10-4 mol/L)：上述储备液均
用无水乙醇配制，避光保存于4 ℃，使用时稀释
到所需浓度。
1.2 仪器与设备
UV-9200型紫外可见分光光度计：北京瑞利
分析仪器公司；40 mm石英比色皿：江苏晶禾科学
仪器厂；10 μL色谱进样针：上海高鸽工贸有限
公司。
1.3 实验方法
1.3.1 微量光度滴定实验 分别取10.00 mL一定
浓度的DPPH溶液于40 mm比色皿中，测初始吸光
度值A0，以10 μL色谱进样针逐次向DPPH溶液中
滴加3.29×10-4 mol/L花旗松素10.00 μL，迅速混
匀，反应5 min后测定DPPH在517 nm处的吸光度值
A517
[17]。滴加至达到了最大清除A517不再变化后再
滴加5次即可结束滴定。计算滴定过程中517 nm处
的吸光度变化值A，以花旗松素累积加入量nT对
吸光度变化值A制作滴定曲线。
1.3.2 DPPH自由基清除实验 按照文献的方法[12]
进行常规DPPH自由基清除实验，DPPH自由基的
初始量为6.34×10-7 mol，溶液总体积为10.00 mL，
反应时间为30 min。
2 微量滴定数学关系
在DPPH清除实验中，通常以517 nm做为测
定波长[17]，其吸光度A与DPPH浓度c符合Lambert-
Beer定律：A=εbc+a，在微量滴定过程中，随着
抗氧化剂的逐渐滴加，DPPH不断被清除，其在
517 nm处吸光度值(Ai)逐渐下降，并与剩余DPPH的
浓度ci成正比关系的降低。吸光度变化值A=A0-
and 4.159×10-6 mol/L. In conventional experiments, when the all initial DPPH content were 6.34×10-7 mol,
the EC50% value of taxifolin was 1.27×10
-5 mol/L that was lower than the EC50% value of rutin 1.775×10
-5
mol/L, which showed the antioxidant activity of taxifolin was stronger than rutin. This method is consistent
with the results of the conventional method and it has the advantages of high accuracy, less sample
consumption, simple operation and lower cost. It is important to study the evaluation index of antioxidant
activity substances.
Key words: taxifolin; 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl) hydrazyl
(DPPH) free radicals; the trace photometric titration method; the scavenging stoichiometric R
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Ai，可用下式计算：
⋯⋯⋯⋯(1)
式中：A0、c0、n0和V0分别为DPPH的初始吸
光度、初始浓度，初始物质的量和初
始体积；
i为滴定次数；
nD为剩余DPPH量。
忽略每次滴加的10.00 μL花旗松素对总体
积(10.00 mL)的影响，并设R为DPPH被清除量nE
与抗氧化剂加入量nT的清除计量比，R=nE/nT，则
nE=RnT。因此(1)式可简化为：
⋯(2)
(2)式即为反映吸光度变化值∆A与花旗松素
加入量nT关系的滴定方程，可由(2)式的斜率结合
DPPH的Lambert-Beer关系(A=εbc+a)计算出清除
计量比R。
EC50%为清除率达到50%时抗氧化剂的浓度
(c50%)，清除率达到50%时，DPPH被清除量为
n0/2，由R=nE/nT可知，此时消耗的抗氧化剂物质
的量nT50%=n0/2R。由此可得不同DPPH初始量对应
的EC50%值计算式为：
⋯⋯(3)
从(3)式可知，EC50%值并不是个固定的值，
而是与DPPH初始量n0或初始浓度c0有关，n0或
c0越大，EC50%越大；且R越大，EC50%越小，清
除能力越强。根据本文的方法，只要知道清除
计量比R，就可方便求出不同DPPH初始量的
EC50%值。
3 结果与分析
3.1 滴定曲线、清除计量比测定及EC50%计算
实验测得DPPH在517 nm处的吸光度值与其浓
度的Lambert-Beer关系为：
A0=εbcD+a=33301cD+0.0042，cD单位为mol/
L。滴定方程对应的滴定曲线测定结果见图1。选
取高、中、低3个不同DPPH初始量进行滴定，吸
光度变化值A517随花旗松素加入量nT的增加呈线
性增加，说明两者在按照一定的计量关系反应。
当花旗松素加入到一定量时，A517变化达到最
大，继续滴加花旗松素，A517不再变化，表明花
旗松素对DPPH的清除作用已达最大。











       
㟝ᬃᲪ㉌ߌڑ䛻n T  f  NPM
ȍ




ON






ȍA=Ao-Ai=εb(Co-Ci)=εb( )
=1
+
0 D
N
0 t0 t
n n
V V
−
∑V
ȍA=εb( )= (n0-nD)=
0
0 0
n εbnE
V V
− D
0
n
V 0
εb
V

0
εbRnT
V
&$(mol/L)=CT50%=
0
nT50%
V

0
nO
2RV

CO
2R
注：DPPH初始量(mo l )：1 .1 . 78×10-7；2 .1 . 27×10-7；
3.0.76×10-7。
图1 微量光度滴定曲线
表1 微量滴定法测定结果
初始DPPH/(×10-7 mol) n0 线性方程/r 清除计量比R=nE/nT EC50%/(×10-6 mol/L)
0.76 A517nm=1.244×107nT+0.0009 (0.9995) 2.677 1.413
1.27 A517nm=1.562×107nT+0.0099 (0.9995) 2.142 2.967
1.78 A517nm=1.563×107nT+0.0096 (0.9996) 2.141 4.159
1.78×10-7 mol相差较大，说明只要DPPH初始量
高于1.27×10-7 mol，所获得的R值可适用于不同
DPPH初始量的计算。根据R的测定结果，用(3)式
可计算出不同DPPH初始量对应的EC50%值(表1)，
结果表明，EC50%值依次随DPPH初始量的增加而
线性增加，说明对于不同DPPH初始量而言，获得
的EC50%值不具有可比性。
3.2 对照实验
本法与常规方法的对照实验及花旗松素与芦
丁的对照实验结果见表2，对照实验中DPPH的初
始量均为6.34×10-7 mol，本法的EC50%值是由表
1所测得的清除计量比R根据公式(3)计算获得的
DPPH初始量为6.34×10-7 mol对应的结果。从表2
可知，花旗松素的EC50%低于芦丁，表明花旗松素
清除活性高于芦丁。而本法的结果与常规方法获
得的结果是一致的，表明本法结果准确可靠。因
对滴定曲线进行拟合，根据(2)式及Lambert-
Beer关系计算出清除计量比R，并根据R计算出不
同DPPH初始量对应的EC50%值，结果见表1。从表
1可看出，0.76×10-7、1.27×10-7、1.78×10-7 mol 3
个DPPH初始量对应的R值分别为2.677、2.142和
2.141。当DPPH初始量高于1.27×10-7mol时，测
定曲线线性部分几乎完全重叠，所得到的R值几
乎相同。但0.76×10-7 mol组R值却与1.27×10-7和
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EC50%值随DPPH初始量的不同而不同，所以对于
不同DPPH初始量的常规清除实验，所获得的结果
不具有可比性。而本文采取的微量滴定法，不同
DPPH初始量获得的R值几乎相同，且可以根据R
值准确推导出不同DPPH初始量对应的EC50%值。
用此法来比较抗氧化物质对DPPH自由基的清除活
性强弱，从可比性、适用性、可靠性等方面均优
于常规方法，具有较好的应用前景。
表2 对照试验结果
方法 初始DPPH/(×10-7 mol) n0
初始体积/
mL V0
EC50%/(×10-5 mol/L)
常规方法*
花旗
松素 6.34 10.0 1.527
芦丁 6.34 10.0 1.775
本法计算结果** 6.34 10.0 1.504
　　注：文献[12]；**根据(3)式计算结果，R取2.142。
4 结论
传统方法以EC50%评价抗氧化物质清除DPPH
自由基的活性，但结果表明，EC50%值因DPPH初
始量的不同而不同，可比性较差。本文以微量光
度滴定法获得花旗松素清除DPPH自由基的清除计
量比R，当DPPH初始量高于1.27×10-7 mol时，不
同DPPH初始量所得到R值几乎相同，克服了EC50%
的不足。且根据R值可准确推导出不同初始DPPH
对应的EC50%值，结果与常规方法一致。因此，以
清除计量比R评价抗氧化物质的活性强弱，从可
比性、适用性、可靠性等方面均优于常规方法，
且试剂用量明显减少，降低了分析成本，具有较
好的应用前景。本文结果亦表明，花旗松素清除
DPPH自由基的活性高于芦丁。
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订阅热线：010-67913893